CN103866041A - 帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒及其检测方法，属于分子诊断领域。试剂盒设有包装盒、两对引物序列、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品和阴性标准品。试剂盒在检测金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628中应用。检测方法：使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据人类CARD15基因和TREM2基因序列获得分别包含rs206684和rs75932628的特异性PCR扩增产物；将特异性PCR扩增产物，分别用限制性内切酶BamHI和HhaI酶切；联合毛细管电泳检测，根据酶切片段的数量和酶切片段大小，检测这两个位点是否发生突变以及突变类型。

Description

帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及用于检测与帕金森病和脑白质疏松症相关突变：rs2066842，rs75932628的试剂盒，还涉及一种检测帕金森病和脑白质疏松症相关突变：rs2066842，rs75932628的方法，以及上述方法和上述试剂盒在检测帕金森病和脑白质疏松症相关突变：rs2066842，rs75932628的应用。

背景技术

随着老龄化的加剧，老年性疾病的患病率日益增加，帕金森病和脑白质疏松症是两种常见的老年性疾病。在超过65岁的老年患者中男性的发病率为1.6%，女性的发病率为1.7%，全球400万患者中有170万人在中国，患病率与欧美国家接近。此报告于2005年公布在《TheLancet》杂志上（Zhang ZX,Roman GC,Hong Z,Wu CB,Qu QM,Huang JB,Zhou B,Geng ZP,Wu JX,Wen HB et al:Parkinson's disease in China:prevalence in Beijing,Xian,and Shanghai.Lancet2005,365(9459):595-597.），并得到了杂志编委们的高度评价。该调查还发现，在边远地区及农村，帕金森病误诊率较高，这极有可能是导致既往患病率低的原因之一。帕金森病患者一般在病理分期达3～4期时才会出现典型的运动症状，一般此时多巴胺能神经元减少50%，多巴胺水平降低达70%～80%，但是由于神经元的不可再生特点，此时患者已错过了治疗的最佳时机。因此，积极寻找具有早期诊断价值的生物学标志物，在多巴胺能神经元存活时即明确诊断帕金森病已成为目前研究的热点之一。

脑白质疏松症是一个放射学术语，用于描述脑室周围或皮质下区脑白质在计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）上的表现，根据病变范围的大小可分为轻、中、重度。有研究表明，脑白质疏松症的发生与年龄因素密切相关，年龄越大，发病率越高。特别是近年来，随着CT和MRI的广泛应用，脑白质疏松症越来越多地在中、老年人中被发现。2011年全基因组关联研究（GWAS）发现单核苷酸突变是导致脑白质疏松症的遗传因素之一（Fornage M,Debette S,Bis JC,Schmidt H,Ikram MA,Dufouil C,Sigurdsson S,Lumley T,DeStefano AL,Fazekas F et al:Genome-wide association studies of cerebral white matter lesion burden:theCHARGE consortium.Ann Neurol2011,69(6):928-939.）。

基因单核苷酸多态性（SNP）是导致帕金森病发生的遗传因素之一。当DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点，这样就可以用限制性长度多态性（RFLP）进行基因型分析。SNP可以影响人类疾病的发展和对病原体，化学品，药品，疫苗等的机体反应。SNP也是个性化医疗的关键。同时，这些遗传变异也构成了我们对疾病易感性的差异。我们的身体对疾病的严重程度及治疗的效果在临床中也表现为遗传变异性。例如，载脂蛋白E（APOE）的单碱基突变与更高的老年痴呆症相关。

一般实验室常用琼脂糖凝胶电泳展示RFLP的结果，但由于其分辨率低和制备繁琐，不利于大批量样本的操作。毛细管电泳是90年代初发展起来的新技术，具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化的特点。后来又发展了激光诱导荧光检测器，大大提高了分析灵敏度，对微量样品如单细胞分析等，具有很大的优势。毛细管电泳可以应用于DNA点突变的检测，而且在20分钟内就能完成几千个碱基的DNA片段的突变分析。在PCR基础上利用毛细管电泳技术对DNA已知点突变及未知点突变的检测发展十分迅速，已经应用于基因突变引起的遗传疾病的临床诊断和法医检验。

发明内容

本发明的目的是提供快速、简便、准确、经济的一种帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒及其检测方法，本发明可检测rs2066842，rs75932628两个突变点。

所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，设有包装盒、两对引物序列、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品和阴性标准品；

所述两对引物序列为：

rs2066842的正向引物F1：AGCCCATTGTCTGGTTAGGT；

rs2066842的反向引物R1：ACAGTGTCCGCATCGTCAT；

rs75932628的正向引物F2：ATCATGGGGTTGTAGATTCCG；

rs75932628的反向引物R2（CCACAACACCACAGTGTTCCA；

所述PCR扩增反应试剂包括脱氧单核苷酸（dNTP）、10×PCR缓冲液、MgCl₂、无菌双蒸水和DNA聚合酶（Taq酶）；

所述酶切反应试剂包括限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HhaI，100×牛血清蛋白（BSA），10×酶切缓冲液；

所述阳性标准品是含有rs2066842和rs2066842双链DNA突变的质粒；

所述阴性标准品是连接正常目的DNA序列的质粒。

所述PCR扩增反应试剂由1ml的脱氧单核苷酸（dNTP）（2.5mM）、1ml的10×PCR缓冲液（100mM pH8.3Tris-HCl，500mM KCl）、1ml的MgCl₂（25mM）、2ml的无菌双蒸水和50μl的DNA聚合酶（Taq酶）（5U/μl）组成。

所述酶切反应试剂由200μl的限制性内切酶BamHI（20U/μl）和200μl的限制性内切酶HhaI（20U/μl），100μl的100×牛血清蛋白（BSA），1ml的10×酶切缓冲液（100mM pH7.9Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM的DTT）组成。

所述阳性标准品（50nM）500μl。

所述阴性标准品（50nM）500μl。

本发明的一个优选实施方案是rs2066842和rs75932628的引物既可分别扩增，也可以同时在一个PCR管中扩增，而且特异性良好。

所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒在检测金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628中的应用。

所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒在检测金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628中应用的检测方法如下：

（1）特异性PCR扩增：使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据人类CARD15基因（Gene ID:64127）和TREM2基因（Gene ID:54209）序列获得分别包含rs206684和rs75932628的特异性PCR扩增产物；

（2）酶切鉴定：将上述的特异性PCR扩增产物，分别用限制性内切酶BamHI和HhaI进行酶切；

（3）突变检测：联合毛细管电泳检测，直接根据酶切片段的数量和酶切片段的大小，检测这两个位点是否发生了突变以及突变类型。

在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对rs2066842和rs75932628突变点的位置各设计一对引物：rs2066842的正向引物F1的5’端位于突变点上游225bp处，反向引物R1的5’端位于突变点下游84bp处，；rs75932628的正向引物F2的5’端位于突变点上游173bp处，反向引物R2的5’端位于突变点下游86bp处（见图3）。

本发明针对的是rs2066842突变形成BamHI酶切位点（见图4），rs75932628突变失去HhaI酶切位点（见图5）。

以提取被检测样品的基因组DNA为模板，分别用以上rs2066842和rs75932628的引物，通过PCR扩增后获得特异性的目的片段309bp和259bp（见图6）。

在上述帕金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628的检测方法中，结合PCR-RFLP技术和毛细管电泳技术，在PCR管中基因组DNA在特异性引物的作用下进行扩增，扩增的PCR产物分别进行酶切反应，然后通过毛细管电泳技术便可在2小时内对96个样品检测出与帕金森病和脑白质疏松症的相关突变：rs206684和rs75932628。

根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得引物，与PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂，阳性标准品、阴性标准品以及使用说明书组合起来，制成了用于体外检测帕金森病和脑白质疏松症相关突变：rs2066842，rs75932628的试剂盒，使得特异性PCR扩增和酶切反应可以在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成。其中，PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、无菌双蒸水、Taq酶；酶切反应试剂包括限制性内切酶BamHI和HhaI、10×酶切缓冲液、BSA。

本发明提供一种用于检测帕金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842和rs75932628的试剂盒，由引物序列，PCR扩增反应试剂，酶切反应试剂，阳性标准品，阴性标准品以及使用说明书构成。本发明要点在于以基因组DNA为模板，通过PCR特异性扩增，然后利用限制性内切酶BamHI与HhaI分别与rs2066842和rs75932628的PCR产物反应，反应产物可直接用于毛细管电泳检测这两种突变位点。与现有的方法相比，本发明具有无创伤，耗时短，成本低，分辨率高，操作简便，并且对设备及环境要求低，利于推广和应用，适用于帕金森病和脑白质疏松症相关人群的大规模筛查和预防性检查。

本发明具有以下特点：

1.本发明可以从基因组DNA中只扩增出相应的目的DNA片段，无需二次扩增或纯化就可以进行酶切反应，而且酶切反应产物可以直接电泳。特别是联合毛细管电泳技术，只需要微量上样产物（5μl PCR产物，碱基数小于300bp）就能快速得到高分辨率（10bp，检测时间为1min）的检测结果。

2.目前国内外进行基因诊断的方法有：直接测序，荧光定量PCR，基因芯片，但是这些方法存在价格昂贵、操作繁琐和分析复杂的缺点，所以不易于临床推广。与这些方法比较，PCR-RFLP结合了PCR特异性扩增及限制性酶切技术两者的优点，每份DNA样品用特异性引物F和R，于PCR管中进行扩增，然后酶切，就可以在2h内检测出rs2066842和rs75932628两种突变，而且阳性标准品和阴性标准品可以作为整个PCR-RFLP的内控指标，有利的避免了假阳性和假阴性结果的出现，提高了检测结果的真实性和稳定性。

3.应用本发明提供的帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒进行rs2066842，rs75932628突变点检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对操作人员无特殊要求，适合在基层医院，分子生物实验开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行帕金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842和rs75932628的大规模筛查和预防性检查。

附图说明

图1是本发明帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒实施例的结构组成示意图。包括反应试剂15管，其中字母F1为rs2066842的正向引物，R1为rs2066842的反向引物，F2为rs75932628的正向引物，R2为rs75932628的反向引物，ddH₂O为无菌双蒸水，dNTP为脱氧单核苷酸，Buffer1为10×PCR缓冲液，MgCl₂为Mg离子，Taq为DNA聚合酶，Control1为阴性标准品，BamHI和HhaI为限制性内切酶，BSA为100×牛血清蛋白，Buffer2为10×酶切缓冲液组成，Control2为阳性标准品。

图2是本发明检测方法的流程图。

图3是本发明的PCR引物示意图。其中字母F1和R1为rs2066842的正向引物和反向引物，F2和R2为rs75932628的正向引物和反向引物；字母为G/GATCC为限制性内切酶BamHI的识别序列，字母GCG/C为限制性内切酶HhaI的识别序列。

图4是根据本发明的帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒和检测方法，对rs2066842特异性PCR后使用限制性内切酶BamHI所得到的阴性标准品1（没有突变），阴性样品2（没有突变），杂合子突变样品3，阳性标准品4（纯合子突变）的毛细管电泳结果。其中箭头指示的峰和条带为酶切片段。图4A和图4B是毛细管电泳检测结果的两种呈现方式：A为峰状图，B为胶状图。

图5是根据本发明的帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒和检测方法，对rs75932628特异性PCR后使用限制性内切酶HhaI所得到的阴性标准品1（没有突变），杂合子突变样品2，纯合子突变样品3，阳性标准品4（纯合子突变）的毛细管电泳结果。其中箭头指示的峰和条带为酶切片段。图5A和图5B是毛细管电泳检测结果的两种呈现方式：A为峰状图，B为胶状图。

图6是根据本发明的帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒和检测方法，利用rs2066842和rs75932628的引物对基因组DNA进行分别扩增和共同扩增的结果。其中M为DNA Marker，1和2为rs2066842引物单独扩增的PCR产物309bp，3和4为rs75932628引物单独扩增的PCR产物259bp，5和6为rs75932628引物和rs75932628引物共同扩增的PCR产物309bp与259bp，7为模板空白对照（NTC）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

参见图1，所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒实施例，设有包装盒1（其中盒内设有隔板2）、两对引物序列、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品和阴性标准品，在图1中，包括反应试剂15管。其中字母F1为rs2066842的正向引物，R1为rs2066842的反向引物，F2为rs75932628的正向引物，R2为rs75932628的反向引物，ddH₂O为无菌双蒸水，dNTP为脱氧单核苷酸，Buffer1为10×PCR缓冲液，MgCl₂为Mg离子，Taq为DNA聚合酶，Control1为阴性标准品，BamHI和HhaI为限制性内切酶，BSA为100×牛血清蛋白，Buffer2为10×酶切缓冲液组成，Control2为阳性标准品，15管反应试剂分隔在隔板2上。

所述两对引物序列为：

rs2066842的正向引物F1：AGCCCATTGTCTGGTTAGGT；

rs2066842的反向引物R1：ACAGTGTCCGCATCGTCAT；

rs75932628的正向引物F2：ATCATGGGGTTGTAGATTCCG；

rs75932628的反向引物R2（CCACAACACCACAGTGTTCCA；

所述PCR扩增反应试剂包括脱氧单核苷酸（dNTP）、10×PCR缓冲液、MgCl₂、无菌双蒸水和DNA聚合酶（Taq酶）；

所述酶切反应试剂包括限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HhaI，100×牛血清蛋白（BSA），10×酶切缓冲液；

所述阳性标准品是含有rs2066842和rs2066842双链DNA突变的质粒；

所述阴性标准品是连接正常目的DNA序列的质粒。

所述PCR扩增反应试剂由1ml的脱氧单核苷酸（dNTP）（2.5mM）、1ml的10×PCR缓冲液（100mM pH8.3Tris-HCl，500mM KCl）、1ml的MgCl₂（25mM）、2ml的无菌双蒸水和50μl的DNA聚合酶（Taq酶）（5U/μl）组成。

所述酶切反应试剂由200μl的限制性内切酶BamHI（20U/μl）和200μl的限制性内切酶HhaI（20U/μl），100μl的100×牛血清蛋白（BSA），1ml的10×酶切缓冲液（100mM pH7.9Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，1mM的DTT）组成。

所述阳性标准品（50nM）500μl。

所述阴性标准品（50nM）500μl。

实施例1使用本发明对200例散发性帕金森病人，200例散发性脑白质疏松症病人的检测。

1.检测样本

所有病人由2名神经内科医师独立诊断，其中帕金森病的诊断标准参照英国帕金森病储存库（UKPBB），严重程度参照帕金森病联合评分标准（UPDRS）；脑白质疏松症的CT表现为双侧大脑白质内有斑片状或弥散性低密度、边缘模糊呈月晕状、CT值低于脑白质、不强化，MRI表现为T1加权像上呈等或低信号，T2加权像上呈高信号。

2.基因组DNA提取

抽取外周血2ml，乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝。建议根据DNA提取试剂盒（MagCoreGenomic DNA Whole Blood Kit，Cat.No.MGB400-04，Taiwan）说明书操作，由配套的自动核酸抽提仪提取血液基因组DNA。通过仪器NanoDrop ND1000（ThermoScientific，USA）检验提取的基因组DNA浓度和纯度，并在2%的琼脂糖凝胶上检测DNA的完整性。

3.引物设计4

使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据公开的人类CARD15基因（Gene ID:64127）和TREM2基因（Gene ID:54209）序列进行引物设计（见图3）。

4.PCR扩增

根据上述设计的2对引物序列，通过人工合成（委托生物公司）获得，以上述提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；其中PCR反应体系为25μl：DNA模板（50ng）1μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，MgCl₂（25mM）1.5μl，Taq酶（5U/μl）0.125μl，无菌双蒸水15.875μl；PCR反应条件：预变性94℃，10min；变性94℃，30sec；退火55℃，30sec；延伸72℃，1min，共30个循环；延伸72℃，10min。

5.酶切分析

酶切反应体系为20μl：特异性的目的PCR产物10μl，HhaI/BamHI（20U/μl）0.5μl，BSA（100×）0.2μl，10×酶切缓冲液2μl，无菌双蒸水7.3μl，37℃，1小时。

6.毛细管电泳检测

酶切产物的上样体积为20μl，然后在4kV×15sec条件下电动上样，8kV恒压电泳，在590nm处检测激光诱导的溴化乙锭的发射波长，然后比较电泳图谱上酶切片段的数量和大小，从而鉴定rs2066842，rs75932628是否发生突变以及突变类型。

7.检测结果：

（1）rs2066842的检测结果：待测样品、阴性标准品和阳性标准品的PCR特异性产物经限制性内切酶BamHI酶切后通过毛细管电泳进行基因型分析：若待测样品为阴性（没有突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有1个峰：309bp，若待测样品为阳性且为杂合子突变（单链突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有3个峰：309bp、225bp、84bp，若待测样品为阳性且为纯合子突变（双链突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有2个峰：225bp和84bp（见图4）。

（2）rs75932628的检测结果：待测样品、阴性标准品和阳性标准品的PCR特异性产物经限制性内切酶HhaI酶切后通过毛细管电泳进行基因型分析：若待测样品为阴性（没有突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有2个峰：173bp和86bp，若待测样品为阳性且为杂合子突变（单链突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有3个峰：259bp、173bp、86bp，若待测样品为阳性且为纯合子突变（双链突变），则Marker（20bp和1000bp）中间有1个峰：259bp（见图5）。

8.可靠性分析：

联合限制性内切酶检测和毛细管电泳鉴定后，选取了100例以上四种检测结果，进一步将这些酶切产物进行测序分析，测序结果与毛细管电泳结果完全一致，说明使用本发明方法检测rs2066842，rs75932628突变的可靠性和稳定性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，其特征在于设有包装盒、两对引物序列、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品和阴性标准品；

所述两对引物序列为：

rs2066842的正向引物F1：AGCCCATTGTCTGGTTAGGT；

rs2066842的反向引物R1：ACAGTGTCCGCATCGTCAT；

rs75932628的正向引物F2：ATCATGGGGTTGTAGATTCCG；

rs75932628的反向引物R2（CCACAACACCACAGTGTTCCA；

所述PCR扩增反应试剂包括脱氧单核苷酸（dNTP）、10×PCR缓冲液、MgCl₂、无菌双蒸水和DNA聚合酶（Taq酶）；

所述酶切反应试剂包括限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HhaI，100×牛血清蛋白（BSA），10×酶切缓冲液；

所述阳性标准品是含有rs2066842和rs2066842双链DNA突变的质粒；

所述阴性标准品是连接正常目的DNA序列的质粒。

2.如权利要求1所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，其特征在于所述PCR扩增反应试剂由1ml的脱氧单核苷酸（dNTP）、1ml的10×PCR缓冲液、1ml的MgCl₂、2ml的无菌双蒸水和50μl的DNA聚合酶（Taq酶）组成；所述PCR缓冲液的组成为100mM pH8.3Tris-HCl，500mM KCl。

3.如权利要求1所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，其特征在于所述酶切反应试剂由200μl的限制性内切酶BamHI和200μl的限制性内切酶HhaI，100μl的100×牛血清蛋白，1ml的10×酶切缓冲液组成；所述酶切缓冲液的组成为100mM pH7.9Tris-HCl，100mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM的DTT。

4.如权利要求1所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，其特征在于所述阳性标准品为500μl；所述阴性标准品为500μl。

5.如权利要求1所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒，其特征在于rs2066842和rs75932628的引物分别扩增或同时在一个PCR管中扩增。

6.如权利要求1所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒在检测金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628中的应用。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于所述帕金森病和脑白质疏松症的突变检测试剂盒在检测金森病和脑白质疏松症相关突变rs2066842，rs75932628中应用的检测方法如下：

（1）特异性PCR扩增：使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据人类CARD15基因（Gene ID:64127）和TREM2基因（Gene ID:54209）序列获得分别包含rs206684和rs75932628的特异性PCR扩增产物；

（2）酶切鉴定：将上述的特异性PCR扩增产物，分别用限制性内切酶BamHI和HhaI进行酶切；

（3）突变检测：联合毛细管电泳检测，直接根据酶切片段的数量和酶切片段的大小，检测这两个位点是否发生了突变以及突变类型。

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