CN103865937B - 水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用。本发明提供了从水稻分离克隆的野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf4的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因，它通过负调控线粒体基因组中的不育基因WA352的表达水平而恢复育性。将Rf4转化导入原来不含有恢复基因的水稻品种，可培育新的恢复系。将转基因恢复系与野败型不育系杂交可产生育性正常的杂交种用于生产。

Description

水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用。

背景技术

植物可以通过异花受粉产生杂种，杂种在生长势、适应性、产量等方面具有优势，称为杂种优势。在农作物中利用杂种优势可以提高产量、质量和抗性。植物雄性生殖器官不能产生正常育性的雄配子即花粉的现象称为雄性不育。具有雄性不育遗传特性的作物品种或品系称为不育系。另一方面，有些作物品种（品系）与不育系杂交产生的杂种具有恢复正常的育性，这些作物品种（品系）称为恢复系。利用不育系作母本和恢复系作父本杂交，可省去除雄的操作，配制出高纯度的杂交种子。因此，不育系和恢复系在杂交作物育种有重要的生产应用价值。

关于雄性不育性及其育性恢复性的研究已在多种农作物如小麦、玉米、水稻(Oryza sativa)、油菜中报道，在生产上已大规模用于杂交种生产。雄性不育的遗传基础有核基因控制的核不育和细胞质控制的细胞质不育（cytoplasmic male sterility，简称为CMS）。利用CMS不育和恢复特性的杂交育种方法通常称为“三系法”，即不育系、恢复系、和保持系。其中不育系的不育细胞质基因组通常为线粒体基因组，具有特异的CMS基因。恢复系具有正常的细胞质或不育细胞质，其特点是核基因组中携带有功能（显性）的细胞质雄性不育恢复基因（fertility restorer，简称为恢复基因或Rf基因），花粉正常可育，可自交结实。保持系具有正常的细胞质，但其核基因组不携带有功能的恢复基因(即携带无功能的隐性恢复基因rf)，其花粉正常可育，可自交结实。生产上应用的配套“三系”中，保持系和不育系具有相同的核基因组，其差别是细胞质不同。保持系与不育系杂交产生不育系种子，称为不育系繁殖；恢复系与不育系杂交产生杂种F₁种子，称为杂交制种。F₁中的恢复基因能抑制CMS不育基因的功能而恢复花粉育性，因此可自交结实（Chen and Liu，2014）。

水稻细胞质雄性不育被分为多种类型，其中主要有：（1）包台型（CMS-BT），其雄性不育细胞质来源于印度籼稻Chisurah Boro II（Shinjyo，1975），属于配子体不育类型；（2）野败型（Wild Abortive，简称CMS-WA），其雄性不育细胞质来源于中国海南省的普通野生稻（Oryza rufipogon），属于孢子体不育类型；（3）红蓮型（CMS-HL），其雄性不育细胞质来源于中国海南省的普通野生稻，属于配子体不育类型（Chen and Liu，2014），普通野生稻是栽培稻的祖先种。

目前水稻恢复系育种方法主要是：（1）用现有品种（系）与不育系测交，选出有恢复育性能力的品种作为恢复系使用；（2）以恢复系为恢复基因供体亲本，与不携带恢复基因的优良亲本杂交和多代回交选育而成。由于水稻的恢复基因主要存在于少数籼稻（O. sativa ssp. indica）品种，大部分的水稻品种不携带有功能的恢复基因，尤其是粳稻（O. sativa ssp. japonica）品种基本上不携带有功能的恢复基因，因此水稻恢复系的育种主要用第（2）种方法，而这种方法也需要多代回交才能育成。

大部分三系杂交稻是利用野败型细胞质雄性不育系统。对不同类型的水稻细胞质雄性不育，已发现有相应的恢复基因。包台型恢复基因Rf1a和Rf1b已被克隆（Komori etal., 2004；Wang et al., 2006）。红莲型的1个恢复基因Rf5实际上与包台型Rf1a是相同的基因（Hu et al., 2012）。Rf1a和Rf1b编码具有PPR（pentatrico peptide repeat）结构域的蛋白。PPR基因是植物中一类超基因家族。

本发明人在中国专利号为ZL 200810167024.0的专利中公开了一种从线粒体基因组克隆得到的野败型CMS基因WA352。而野败型雄性不育的恢复性主要由2对主效恢复基因Rf3和Rf4控制。Rf3和Rf4已被分别定位在第1和第10染色体的特定区间(Zhang et al.,1997；张群宇 et al., 2002；Ahmadikhah and Karlov, 2006)，但尚未被分离克隆。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有水稻雄性不育恢复系育种研究技术的不足，提供从不同的水稻恢复系分离克隆得到的水稻细胞质雄性不育恢复等位基因。

该不育恢复等位基因有Rf4-M、Rf4-I，Rf4-W1,Rf4-W2, Rf4-W8，编码具有恢复野败型杂交稻的雄性育性的蛋白，其蛋白的序列分别为：

（1）SEQ ID NO:6至 SEQ ID NO:10，或

（2）所述序列（1）经替换、缺失或/和添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列、功能片段和/或突变体，或

（3）其它Rf4等位基因编码的与（1）或（2）同源的蛋白序列。

本发明所述的术语Rf4同等基因，是定义为与SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5的核苷酸序列相比有一个或若干个核苷酸的差别，包括若干碱基的改变、缺失、或插入，且其表达产物的功能与Rf4表达产物的功能相当的基因。

所述的Rf4等位基因（allele）是指存在于水稻不同品种（系）的或野生稻的基因组染色体中的与本发明所述Rf4的相同染色体座位(locus)的基因，其核苷酸序列与编码SEQID NO:6至 SEQ ID NO:10的氨基酸序列相同或有一个或多个碱基变异。

SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10所示的蛋白该序列由782个氨基酸残基组成，具有18个PPR重复单位组成的功能结构域，其生物学功能为恢复植物细胞质雄性不育的育性。这些蛋白序列相互差别110个氨基酸残基。

典型的PPR是由35个氨基酸残基构成的重复单位，在不同的含PPR蛋白中以2个以上的同向PPR单位形成功能结构域，不同PPR单位的氨基酸序列存在不同程度的差异。

Rf4能够降低CMS基因WA352的mRNA表达水平，因而产生育性恢复，即Rf4所编码的蛋白质RF4具有恢复野败型杂交稻的雄性育性的功能。

本发明的另一个目的是提供上述水稻细胞质雄性不育恢复等位基因，其核苷酸序列分别为：

（1）SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5，或

（2）所述序列（1）经替换、缺失和/或添加一个或多个核苷酸且编码权利要求1所述蛋白同等功能的基因序列，或

（3）所述序列（1）或（2）的互补序列。

所述的Rf4等位基因（allele）是指存在于水稻不同品种（系）的或野生稻不同居群的基因组染色体中的与本发明所述Rf4的相同染色体座位(locus)的基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5相同或有若干碱基变异。这些相同座位的多种变异基因也称为复等位基因。

SEQ ID NO: 1是从水稻恢复系明恢63克隆的Rf4等位基因Rf4-M，其第12381 bp为含有启动子调控元件和5’端非翻译区的序列，第23824730 bp为一个没有内含子的开放读码框(ORF，即编码区序列CDS)，第47317832 bp为包括3’端非翻译区的下游序列； SEQ IDNO:2是从水稻恢复系IR24克隆的等位基因Rf4-I,其第12315 bp为含有启动子调控元件和5’端非翻译区的序列，第23164664 bp为一个没有内含子的开放读码框，第46657845 bp为包括3’端非翻译区的下游序列；SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:5分别是从水稻恢复系HNF-W1、HNF-W2、HNF-W8克隆的Rf4等位基因Rf4-W1、Rf4-W2、Rf4-W8的CDS序列。

根据本发明提供的Rf4基因序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Rf4同等功能的基因：（a）通过与数据库对比，获得已经公开但功能未知的Rf4等位基因序列；（b）用Rf4基因片段为探针筛选水稻的基因组文库获得阳性克隆和测序；（c）根据SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR方法从水稻或野生稻的基因组扩增获取Rf4基因片段和测序；（d）在SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5序列的基础上用分子生物学方法改造获得；（e）参照SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5序列用化学合成的方法获得。

优选地，序列（2）中替换、缺失和/或添加的核苷酸残基数量至少7099%的同源性的核苷酸序列，其编码保留该全长序列的生物学活性的肽，更优选为至少75%的同源性，更优选为80％的同源性，更优选为85％的同源性，更优选为90%的同源性，更优选为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个核苷酸残基替换、缺失和/或添加。因为如SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:5所示，水稻等位基因在不同的亚种或种间会存在一个或多个核苷酸残基替换、缺失和/或添加但其仍具备相同的生物学功能。

所述的水稻细胞质雄性不育是水稻野败型细胞质雄性不育，或虽然命名为其它类型的雄性不育，如印度水田谷型、冈型、K型、D型、矮败型等，但其线粒体基因组实际上携带相同的水稻野败型CMS基因WA352或其同源基因的水稻细胞质雄性不育（Luo et al.,2013）。

本发明还提供了上述水稻细胞质雄性不育恢复等位基因在水稻育种，特别是水稻杂交育种中的应用，所述应用为：将所述的基因或含有基因的载体转化水稻，培育能表达和/或增强表达所述基因的转基因恢复系；用转基因恢复系与相应的水稻细胞质雄性不育系杂交，产生育性正常的杂交种子。

具体地，将所述的不育恢复基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将此恢复基因导入水稻或其它植物细胞，可获得能表达所述基因的转基因恢复系。转基因的方法属于本领域公知的方法。用转基因恢复系与野败型不育系杂交，或与具有WA352或其同源基因的植物不育系杂交，可产生杂交种子用于生产。用本发明所述的基因构建植物转化载体时，可以对所述的基因或其调控序列作适当修饰，也可以用其它启动子取代Rf4原有的启动子。

本发明还提供了含有上述不育恢复等位基因或其片段的表达载体。

本发明还提供含有上述不育恢复等位基因或其片段的表达载体的宿主细胞和/或组织；所述的宿主细胞和/或组织是植物或水稻细胞和/或组织；所述的组织是水稻的愈伤组织。

本发明还提供了上述表达载体或宿主细胞和/或组织在水稻育种，特别是水稻杂交育种中的应用，所述应用为：将所述的基因或含有基因的载体转化水稻，培育能表达和/或增强表达所述基因的转基因恢复系；用转基因恢复系与相应的水稻细胞质雄性不育系杂交，产生育性正常的杂交种子。

本发明还提供了水稻细胞质雄性不育恢复等位基因或其片段的基因序列本身产生特异性的PCR分子标记，或所述基因附近的序列产生的紧密连锁分子标记。所述基因附近的序列是指离所述基因编码区转录启始密码子上游或下游1bp-4M bp距离的序列，优选1bp-3M bp，优选1bp-2M bp，优选1bp-1.9M bp，优选1bp-1.8M bp，优选1bp-1.7M bp，优选1bp-1.6M bp，优选1bp-1.5M bp，优选1bp-1.4M bp，优选1bp-1.3M bp，优选1bp-1.2M bp，优选1bp-1.1M bp，优选1bp-0.9M bp，优选1bp-0.8M bp，优选1bp-0.7M bp，优选1bp-0.6Mbp，优选1bp-0.5M bp，优选1bp-0.4M bp，优选1bp-0.3M bp，优选1bp-0.25M bp，优选1bp-0.2M bp，优选1bp-0.15M，优选1bp-0.1M，优选1bp-0.05M，优选1bp-0.05M，优选1bp-40kbp，优选1bp-30k bp，优选1bp-20k bp，优选1bp-10k bp，优选1bp-5k bp，优选1bp-4k bp，优选1bp-3k bp，优选1bp-2k bp，优选1bp-1k bp。

本发明还提供所述分子标记在水稻育种，特别是杂交育种中的应用。

本发明提供的恢复基因的另一个应用是所述的Rf4识别分子标记，或根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP（单核苷酸多态）、InDel (插入/缺失)、SSR（简单序列重复多态）、RFLP（限制性内切酶长度多态）、CAP（切割扩增片段多态）。用这些标记可鉴定水稻或野生稻的雄性不育恢复系或恢复植株和非恢复系或非恢复植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种。所述的非恢复系为不携带有功能的恢复基因的品种、品系、可以是不育系或保持系，或其它水稻或野生稻的遗传育种材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了国际上首次分离克隆得到的水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因Rf4。Rf4能够降低CMS基因WA352的mRNA表达水平，因而产生育性恢复。本发明还提供了Rf4所编码的蛋白质RF4，RF4具有恢复野败型杂交稻的雄性育性的功能。这是发明人经过长期研究取得科学成果，具有重大的学术和经济价值。

本发明还提供了恢复基因Rf4及相关分子标记在水稻育种中的应用，利用该基因可进行分子水平的育种。用转基因方法培育恢复系可加快育种进程，还可以同时导入其它有用基因，如抗病抗虫基因，培育出抗病虫的恢复系。另外，常规的杂交育种方法培育恢复系，需要对育种中间材料和育成品系与不育系测交筛选，而用本发明提供的分子标记辅助选择育种，可对遗传群体的任何生长阶段进行快速鉴定基因型，免去大量的测交工作，提高恢复系育种的选择效率。

附图说明

图1为水稻恢复基因Rf4的图位克隆示意图；其中重组染色体数是指特定分子标记与Rf4座位之间的区域发生染色体交换的染色体数；BAC为细菌人工染色体（Bacterialartificial chromosome）克隆序列；Rfa为CMS-BT型恢复基因（Wang et al, 2006）；

图2为水稻Rf4转基因恢复系与不育系金23A杂交F₁杂种(F₁-1和F₁-2)的花粉育性(A)以及小穗育性（B）检测图；

图3为代表性的功能型和非功能型恢复基因编码蛋白的序列结构图；它们是恢复系明恢63的Rf4-M编码的蛋白PPR782-M，IR24的Rf4-I编码的蛋白PPR782-I，和不育系珍汕97A的rf4-Z编码的截断型蛋白PPR409-Z；N端下划线为线粒体定位信号序列，虚线框内是PPR结构域；

图4为Rf4基因及Rf4转基因表达特性的RT-PCR检测图；Actin1基因为内参；

图5为定量RT-PCR检测Rf4转基因恢复系与不育系杂交F₁杂种的不育基因WA352表达水平图；线粒体基因atp6为内参。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法和技术，所使用的试剂配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径得到，所用的水稻材料可以从中国水稻研究所的国家稻种资源库获得。

实施例1 水稻恢复基因Rf4的定位与克隆

本发明用图位克隆法克隆Rf4基因。

首先用水稻野败型细胞质雄性不育系珍汕97A和恢复系明恢63杂交，建立了一个F₂分离群体，选出约2000株不育株用于Rf4定位。根据已报道的水稻第10号染色体上初步定位的Rf4位点的大致位置(Zhang et al., 1997；张群宇 et al., 2002；Ahmadikhah andKarlov, 2006)，在该区域创建了如表1中所示的多个多态性分子标记。用这些标记和F₂不育群体进行连锁分析，构建了一个Rf4位点区域的连锁图，即图1。图中有2个标记即M19391和M19256与Rf4位点之间分别只有1个重组事件，有4个标记与Rf4完全共分离，即零重组。即Rf4被定位在M19391 和M19256之间的相距约137 kb区域。值得注意的是，水稻胞台型CMS（CMS-BT）的恢复基因Rf1a与Rf4连锁，但遗传重组分析表明，Rf1a附近的分子标记M19391将Rf1a排除在Rf4定位区之外，表明Rf1a不是野败型恢复基因，对野败型不育没有育性恢复效果。

表 1 Rf4座位的连锁分子标记引物序列

注：M19291同时使用2条正向引物（F1，F2）和2条反向引物（R1, R2）；所述标记的使用方法参照（Wang et al, 2006） 。

根据公共数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的水稻（粳稻品种日本晴，含有非功能型rf4）基因组序列和基因预测（http://rapdb.dna.affrc.go.jp)，这个定位区间内存在3个编码PPR蛋白的功能未知基因，基因代号分别为Os10g0495400、Os10g0495200和Os10g0495100。这3个基因位于细菌人工染色体序列OsJNBa0041P03内（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。因为在Rf4座位附近存在2个CMS-BT恢复基因Rf1a，Rfb (Komoriet al., 2004；Wang et al., 2006)，它们也编码PPR蛋白，因此推测Rf4也是PPR基因。由于恢复系明恢63的Os10g0495400 和Os10g0495100的等位基因都是编码只有454氨基酸残基的截断型的蛋白，而Os10g0495200的等位基因编码一个782氨基酸残基的全长蛋白，因此将恢复系的Os10g0495200等位基因作为Rf4候选基因，通过以下的基因功能分析实验确认其功能。

实施例2 Rf4候选基因的转化与功能检测

根据Os10g0495200上下游序列设计基因特异性PCR扩增寡核苷酸引物，其引物序列如SEQ ID NO:11 (下划线为限制性内切酶Kpn I 切点)和SEQ ID NO:12 (下划线为XbaI 切点)所示。

SEQ ID NO:11：5’-ACTTATggtaccTAGCAACTGCGAACACACCCTCAAT-3’

SEQ ID NO:12：5’-CGGTCAtctagaACCAGCAACCTCCCAACCATGACTAT-3’

用PCR技术从恢复系明恢63将含有启动子、编码区、和下游终止序列的长度为7.8kb基因组片段扩增出来。PCR反应体系和反应条件如下：在50 μl 反应中含有 1 x 反应缓冲液，200 μM dNTPs，100 ng明恢63基因组DNA, 引物各0.3 μM， KOD FX聚合酶 1.0 U。30循环：97 ℃ 15S, 68 ℃ 6 min。用限制性内切酶Kpn I和Xba I切割后克隆到植物双元转化载体pCAMBIA1300 (CAMBIA公司，Canberra，Australia)。将此载体导入农杆菌EHA105。将水稻野败型细胞质雄性不育保持系珍汕97B的成熟种子在诱导培养基上诱导出愈伤组织。把含有目的基因转化载体的EHA105在YM琼脂培养基28˚C培养1天，收集在含有100 mol/L的乙酰丁香酮的MB液体培养基中。将水稻愈伤组织浸入农杆菌EHA 105菌液20分钟，吸干菌液后转移到MB琼脂培养基培养。转移愈伤组织至含有50mg/L潮霉素的培养基培养，每14天继代一次，继代2次。抗性筛选后，转入再生培养基分化出转化苗。经用分子标记M19291的 PCR检测，获得了11株阳性转化体。

将2个阳性转化株系作为父本（提供花粉）与野败型不育系金23A杂交，获得F₁杂交种子。将杂种和金23A种植，待水稻抽穗开花时取花粉用碘化钾染色镜检，结果如图2所示，F₁杂种的可育花粉率达到约95%以上，且自交小穗结实率达到80%以上；而对照的不育系的可育花粉率为零，自交不能结实。本实验的结果说明，将恢复基因Rf4转化导入到到原来不含功能型Rf4的品种（如保持系），可创造新的恢复系。此实验也证明了该基因的生物学功能为恢复野败型细胞质雄性不育的育性。本发明将这个从水稻恢复系基因组的Rf4座位克隆获得的基因确认为目的基因，即细胞质雄性不育恢复基因Rf4。

实施例3 Rf4基因的序列分析

利用PCR扩增和测序分析了5个野败型恢复系明恢63、IR24、 HNF-W1、HNF-W2、HNF-W8的功能型Rf4等位基因(Rf4-M、 Rf4-I、Rf4-W1、Rf4-W2、Rf4-W8)和2个野败型不育系珍汕97A和金23A的非功能型rf4等位基因(rf4-Z、 rf4-J)。其中，HNF-W1、HNF-W2、HNF-W8的Rf4等位基因（Rf4-W1、Rf4-W2、Rf4-W8) 来源于普通野生稻，是通过以籼稻品系和不同普通野生稻株系杂交和回交获得。 SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2所示序列分别为明恢63和IR24的Rf4-M和Rf4-I等位基因的基因组DNA片段（包括启动子区、CDS、以及3’端非翻译区的序列）；SEQ ID NO:3至 SEQ ID NO:5所示序列分别为HNF-W1、HNF-W2、HNF-W8的Rf4-W1、Rf4-W2、 Rf4-W8等位基因CDS序列。这些功能型Rf4等位基因的开放读码框有2349个核苷酸，是一个没有内含子的基因，编码由782个氨基酸残基组成的蛋白多肽，含有18个PPR基序。Rf4-M、Rf4-I、Rf4-W1、Rf4-W2、Rf4-W8编码的蛋白之间存在110个氨基酸变异。在不育系珍汕97A和金23A的非功能型rf4等位基因(rf4-Z和rf4-J)中存在2个片段插入。第一个是在编码区第1072位插入1个长度为1476 bp的片段；第二个是在第1607位插入1个长度为105 bp的片段。第一个片段插入造成在第410位密码子出产生一个终止密码，即rf4-Z（rf4-J）编码一个大小有409个氨基酸残基的截断蛋白。图3所示为2个代表性的功能型蛋白和1个非功能型蛋白的序列及其功能域，表2所示为Rf4等位基因编码蛋白序列的相同性（%）比较，括号内为差异氨基酸数。

表2 Rf4等位基因编码蛋白序列的相同性（%）比较

实施例4 Rf4基因的表达特性分析

用RT-PCR对该基因表达进行了分析。RT-PCR使用引物序列如SEQ ID NO:13和SEQID NO:14所示。

SEQ ID NO:13：5’-GCAAAGAAGGGAGGGTTATAGA-3’

SEQ ID NO:14：5’-GCTTCATCCATTCTTCCACATT-3’

RT-PCR反应体系和条件参照Ji et al.（2013）。

RT-PCR分析结果如图4所示，图4中的结果表明，恢复系IR24的内源基因Rf4-I和转基因恢复系的转基因Rf4-M在水稻的根、茎、叶和幼穗等各种组织中均有表达，这种表达即组成型表达，因此该基因属于组成型表达的基因。

实施例5 Rf4对CMS基因WA352表达的负调控作用

用不育基因WA352的特异引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16对用转基因恢复系和不育系金23A杂交所得F₁植株进行定量RT-PCR检测，反应条件参照Luo et al. (2013)。结果如图5所示，发现与不育系相比，杂种中的WA352 mRNA水平下调到15.2%24.2%。由此可知，Rf4是通过负调控WA352的表达水平达到恢复花粉育性的作用。

SEQ ID NO:15：5’-CATGCAAATGTCCCGGATTCAAGC-3’

SEQ ID NO:16：5’-GTAAGCGGACTCTTTCGACCAAG-3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 水稻细胞质雄性不育恢复基因及其应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7832

<212> DNA

<213> Rf4-M

<400> 1

gcaaagacct gcttactcac agccataccc gccctatggc gcgccaccgc aacagcctcc 60

atatggtgcg ccgtcgcaac agcctcctta tggcgcgccc caccctggtc actaccaacg 120

gccaccacac cagcaacctc ccaaccatga ctatggccaa caagcatatc ctggaggatg 180

gcgcgggcag tactacaatc cacatcagcc ccagccgcag ccgcagccgc catatcctca 240

gccaccgtac aatgcccagg gttcttaccc tcctcaccag agcagctact acaggcctca 300

atgagagatg gttttgggat gtggcagaac atgtttgtgt gcctcttttt atttttcttc 360

agactgcgca tatgtgaatt acgttttatg gtgtactgct tacaaagtga ggtggtgtaa 420

tatcgattgg ttcaggttgg ttagacaata gcctgtatca tttggtccgt attaataatg 480

ttgaatatga tatatacagg ccacgcgcct gcaatcccca ttaatatgtg ccattgttga 540

gcagtatttc tctctcttgc caaattttgt actacttgtc agtgaacacc atcctgacgt 600

ttttccgcga aggatgtcga agggatattg aaggtacaaa ctgcacaata actgaaagga 660

ggatacttac gaaaataata gagaatgatc cacaaaaata tgtgattttg ctaggtactc 720

cctctgttct aaatataaca aggtttttac atcacgttta tagaaaaata tattaacatt 780

tataatacaa aataaataca ttctcatgac ctattttaat tatggattta ataactgatt 840

taacgttgca atactaaaat aaatatgtta ttaagagcta ttttaattat agatttaatg 900

aaaatgtttg ttaatactgg tgtattcttt tttacttccc ctatttcaca ctataaatcg 960

tgttgagttt tgaatagatt tacgtgtgga tttatgcata tgttttacac ttcctctatc 1020

acataataca agggatttta gaggatatga catatcgcat tactacgaat ctggacacta 1080

tctaaattcg tagtactaga atgtgtcaca ttcctttaaa atctcttata tcgtactctc 1140

tctgtctcac aaaaagtcca atgtggatat aagaggataa acaaaggatc aaagtacccc 1200

taattaatag caaagttata ttgatgggtg ggtagatggg ggatattgaa gatataaaac 1260

ttctcgattt tacggatgga tggtaggtaa gaagttagaa attgtttatt ttggaacaaa 1320

ttttaaactt tagaagttgg tttattttga gacggagaga ctatatgtgt ttggatcgag 1380

ggactaattt tttttgtctc tgacatatcg gatgtttgga cattaatttg gagtattaaa 1440

catagactaa taataaaact aattacataa atgagagcta atccacaaga caaatttttt 1500

aagcctaatt aatccacaat tagcacatgt ttactataac attgattagg caaatcatgg 1560

attaattagt ctcaataggt tcctctcacg aattagtcca ggatcatgga atgggttttg 1620

tcattagtat acgtttaata cttctaatta gtgtcgaaac atccgatgtg acagagacta 1680

atttttagtc cctggatcta aacaccacct ggaaaacatc atataacgtg aaacggaggg 1740

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tcagggggtg atgctacagt aaacatatgc taattatgga ttaattaaat ttaaaagatt 1860

cgtctcgcta attagctttc atttatacaa ttagttttat tattagtcta tgtttaatac 1920

tcttaattag cgcctaaatt tctaaagtga caaggactaa aatttaggcc ccgtttgatg 1980

tgaactacta gagacaaatt tttatggcac gcaaaacgag aaagcttact agcacatgat 2040

taattaatta ttaactatta taaattttaa aaaatagatt tattttcttt tttaaaacaa 2100

cttttatata gatatttttt ttaaaaaaat acaccattta atagtttgaa gagcgtgcta 2160

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<210> 2

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Claims (5)

1.水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf4的等位基因Rf4-M，Rf4-I，Rf4-W1，Rf4-W2， Rf4- W8，编码具有恢复野败型杂交稻的雄性育性的蛋白，其特征在于，该蛋白的序列分别为：

（1）SEQ ID NO:6至 SEQ ID NO:10。

2.如权利要求1所述的水稻细胞质雄性不育恢复等位基因，其特征在于，其核苷酸序列分别为：

（1）SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5。

3.含有权利要求1或2所述基因的表达载体。

4.权利要求1或2所述基因或权利要求3所述表达载体在水稻育种中的应用。

5.根据权利要求4所述基因或表达载体在水稻育种中的应用，其特征在于，将所述的基因或含有所述基因的表达载体转化水稻，培育能表达和/或增强表达所述基因的转基因恢复系；用转基因恢复系与相应的水稻细胞质雄性不育系杂交，产生育性正常的杂交种子。

6. 含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞和/或组织在水稻育种中的应用。