CN103865079A

CN103865079A - 一种抗菌丝素蛋白水凝胶及其瞬时制备的方法

Info

Publication number: CN103865079A
Application number: CN201410061786.8A
Authority: CN
Inventors: 卢神州; 孙姗; 邢铁玲; 姚坤玘; 陆奔; 吴佳诗
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2014-06-18

Abstract

本发明涉及一种抗菌丝素蛋白水凝胶及其瞬时制备的方法。按体积比100:1～10，将浓度为20～100克/升的丝素蛋白水溶液与浓度为10～1000毫摩尔/升的季铵盐阳离子表面活性剂溶液混合，瞬时得到一种抗菌丝素蛋白水凝胶。它具有良好的机械性能和抗菌性能，与现有技术相比，本发明的特点在于能瞬时制备抗菌性的丝素蛋白水凝胶，使用方便，可作为敷料等生物医用材料，尤其是可在涂抹的过程中瞬时形成水凝胶，适用于任意形状的皮肤等创面、伤口的覆盖。

Description

一种抗菌丝素蛋白水凝胶及其瞬时制备的方法

技术领域

本发明涉及一种水凝胶材料的制备方法，特别涉及一种可瞬时形成丝素蛋白水凝胶，该丝素蛋白水凝胶材料具有一定的机械性能，良好的抗菌性能，可应用于生物医用、药物辅料等技术领域。

背景技术

水凝胶具有良好的生物相容性、水渗透性。它是一种以水为分散介质的凝胶，是一种高分子网络体系，性质柔软，能吸收大量的水并保持一定的形状，目前被广泛用于药物释放载体、组织工程材料、人工皮肤、人造肌肉、生物传感器、分离装置、重金属离子回收等方面。但是通常水凝胶的形成需要较长的时间，在实际应用上受到一定的限制。瞬时水凝胶的制备能够使水凝胶在瞬间完成并使用，大大提高了它在临床和创口敷料等方面的应用价值。

丝素蛋白无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性, 能够促进人体细胞的生长，具有一定的生物可降解性，通过对多种生物材料的对比研究表明，丝素蛋白具有与胶原同等的体内、体外生物相容性，因此，丝素蛋白具有能够作为生物医用材料的应用潜能。丝素蛋白水凝胶可由丝素蛋白水溶液制得。丝素蛋白溶液在静置下会逐渐向凝胶化转变，但是这个转变的时间比较长，通常要在1个月以上。可以通过改变丝素蛋白溶液的pH值来加快凝胶化的过程。当pH值接近于丝素蛋白的等电点(pH=3.9)时, 丝素蛋白容易发生胶凝作用, 但也需要8天的时间才能完成凝胶化（[J]浙江工程学院学报, 1999，16（3），172－176）。此外，丝素蛋白的浓度对于凝胶时间也有影响，丝素蛋白溶液在浓度大于10％时比较容易形成凝胶（[J]食品科学，2007, 28（12），58－62），但是在浓度小于10％时需要很长的时间才能形成凝胶。而高浓度丝素蛋白溶液形成的凝胶含水量较低，孔隙率也较低，在应用时受到一定的限制。因此低浓度下的丝素溶液凝胶化时间太长制约了丝素水凝胶的使用。

在本发明作出之前，中国发明专利（CN1158338C）公开了一种化学交联结构的丝素凝胶、海绵状丝素凝胶材料制备方法，采用调整丝素蛋白质水溶液的pH，并混入环氧化合物作为交联剂，经冷冻，凝固成凝胶，但是环氧化合物具有一定的毒性（[J]生物医学工程学杂志，2007，24 (6)∶1309～1313）。中国发明专利（CN102174203）采用聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物与丝素蛋白溶液混合得到的水凝胶凝胶同样具有一定毒性。中国发明专利（CN101502670）公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，采用超声波震荡的方法，能够在短时间内形成水凝胶，但在应用时难以做到对凝胶的控制。中国发明专利（CN102220017A）公开了一种可注射丝素蛋白水凝胶的制备方法，也难以达到瞬时凝胶的效果。

发明内容

本发明所要解决的问题是克服现有技术存在的不足，提供一种可瞬时形成适用于皮肤等创面、伤口覆盖的具有抗菌效果的丝素蛋白水凝胶及其制备方法。

本发明所采用的技术方案是提供一种瞬时制备抗菌丝素蛋白水凝胶的方法，按体积比100:1～10，将浓度为20～100克/升的丝素蛋白水溶液与浓度为10～1000毫摩尔/升的季铵盐阳离子表面活性剂溶液混合均匀，瞬时得到一种抗菌丝素蛋白水凝胶。

本发明所述的季铵盐阳离子表面活性剂为十烷基三甲基溴化铵，十二烷基三甲基溴化铵，十四烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基三甲基溴化铵，苄基三甲基溴化铵，苄基三乙基溴化铵，十烷基三甲基氯化铵，十二烷基三甲基氯化铵，十六烷基三甲基氯化铵，十八烷基三甲基氯化铵，十四烷基三甲基氯化铵，苄基三甲基氯化铵，三乙基苄基氯化铵，(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵中的一种，或几种的任意组合。

本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种抗菌丝素蛋白水凝胶。

本发明依据的原理是：丝素蛋白具有一定的表面活性并带有负电荷，在表面活性剂的作用下可进一步降低表面张力，从而使丝素蛋白分子相互靠近，交联缠结。但由于负电荷的斥力，仅仅降低表面活性剂是不能使其凝胶的，非离子表面活性剂不能使其瞬时凝胶。为了克服负电荷相互的斥力，本发明采用阳离子表面活性剂，在降低表面张力的同时，中和丝素蛋白表面的负电荷，排除斥力，使其迅速形成缠结交联点，从而瞬时凝胶。

与现有技术相比，本发明具有以下明显优点：

1、本发明采用丝素蛋白作为水凝胶主体，以阳离子表面活性剂溶液为凝胶剂，所有组份均为液态，在室温放置不会凝胶化，混合瞬间即形成凝胶；无需使用化学交联剂；降解产物无毒无刺激性。

2、本发明所提供的瞬时形成的丝素蛋白水凝胶，具有一定机械性能，良好的抗菌性，可用于创面覆盖、伤口敷料等生物医用材料，对临床应用有重大意义。

附图说明

图1为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌实验结果对比图；

图2为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶对于大肠杆菌的抗菌实验结果对比图；

图3为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶压缩性能测试结果的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明技术方案和效果作进一步描述。

实施例1：

本实施例提供的丝素蛋白水凝胶制备步骤如下：

1、将40克白厂丝放入4升质量浓度为0.075％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理0.5小时，然后洗涤，再次放入4升浓度为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理0.5小时，洗涤，然后放入4升浓度为0.05％的碳酸钠溶液中，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。称取20g纯丝素纤维溶于100mL9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液；

2、将所得的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为60g/L，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制200mM的十烷基三甲基溴化铵（DETAB）溶液，为组分B，存放于4 ℃；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为50g/L,B组份终浓度为60mM，混合均匀即得到一种瞬时丝素蛋白水凝胶。

7、抗菌实验

（1）将培养好的两种试验菌液（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）以 2×10⁸CFU/ml的菌浓度用涂布方式接种到琼脂培养基上

（2）所制备的水凝胶稳定2h后，制成尺寸为 10 ± 2 mm(直径)× 5 mm(高)的凝胶小块，均匀地按压在琼脂培养基上，放入 37 ℃恒温培养箱中培养 24h。

（3）测定抑菌带宽度并用显微镜观察试样下面与琼脂接触区域的细菌繁殖情况。结果参见附图1和2。

8、压缩试验

（1）用打孔模具将水凝胶制备成一定尺寸 10 mm（直径）× 11mm（高）的圆柱型凝胶样品。

（2）在 INSTRON-3356 型万能材料试验机上进行压缩力学测试。测试温度为 25 ℃，压缩变形速度恒定为 5 mm/min，并分别以纯丝素凝胶作为对照，作六个平行样。根据样品截面形状和厚度变化，可计算得出压缩应力（KPa），应变（%），并作图，结果参见附图3。

实施例2

1、将40克白厂丝放入4升质量浓度为0.075％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理0.5小时，然后洗涤，再次放入4升浓度为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理0.5小时，洗涤，重复一次，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。称取20g纯丝素纤维溶于100mL9.3摩尔/升的溴化锂溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为50g/l，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制300mM的十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）溶液，为组分B，存放于4 ℃；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为40g/L, B组份终浓度为40mM，混合均匀即得到一种丝素蛋白水凝胶。

7、抗菌实验

将培养好的两种试验菌液（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）以 2×10⁸CFU/ml的菌浓度用涂布方式接种到琼脂培养基上，然后将所制备水凝胶稳定2h后制成尺寸为 10 ± 2 mm(直径)× 5 mm(高)的凝胶小块分别均匀地按压在琼脂培养基上，放入 37 ℃恒温培养箱中培养 24h，测定抑菌带宽度并用显微镜观察试样下面与琼脂接触区域的细菌繁殖情况。结果参见附图1和2。

8、压缩试验

用打孔模具将所制水凝胶成一定尺寸 10 mm（直径）× 11mm（高）的圆柱型凝胶样品。在万能材料试验机上进行压缩力学测试。测试温度为 25 ℃，压缩变形速度恒定为 5 mm/min，并分别以纯丝素凝胶作为对照，每种样品作六个平行样。根据样品截面形状和厚度变化，可计算得出压缩应力（KPa），应变（%），并作图，结果参见附图3。

实施例3

2、将所得的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除氯化钙、乙醇等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为70g/l，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制100mM的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液，为组分B，存放于4 ℃；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为45 g/L, B组份终浓度为20mM，混合均匀即得到一种丝素蛋白水凝胶。

7、抗菌实验

8、压缩试验

用打孔模具将所制水凝胶成一定尺寸 10 mm（直径）× 8-11mm（高）的圆柱型凝胶样品。在万能材料试验机上进行压缩力学测试。测试温度为 25 ℃，压缩变形速度恒定为 5 mm/min，并分别以纯丝素凝胶作为对照，每种样品作六个平行样。根据样品截面形状和厚度变化，可计算得出压缩应力（KPa），应变（%），并作图，结果参见附图3。

实施例4

2、将所得的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；存放于 4 ℃；

3、调节丝素蛋白溶液浓度为60g/l，为组分A，存放于4 ℃；

4、配制500mM的十八烷基三甲基氯化铵溶液，为组分B，存放于4 ℃；

5、取一定量超纯水，为C组份；

6、将上述组分A与组分B以终浓度混合，通过C组份的加入调节得到A组份终浓度为55g/L, B组份终浓度为10mM，混合均匀即得到一种丝素蛋白水凝胶。

7、抗菌实验

8、压缩试验

用打孔模具将所制水凝胶制成尺寸为 10 mm（直径）× 8～11mm（高）的圆柱型凝胶样品。在万能材料试验机上进行压缩力学测试。测试温度为 25 ℃，压缩变形速度恒定为 5 mm/min，并分别以纯丝素凝胶作为对照，每种样品作六个平行样。根据样品截面形状和厚度变化，可计算得出压缩应力（KPa），应变（%），结果参见附图3。

参见附图1，为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌实验结果对比图，图1中,位于中间的测试样品为纯丝素凝胶作为对比例，测试样品从正上方开始按顺时针依次为实施例1、2、3和4的测试样品结果，由图1可以看出，实施例2中采用十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）为原料制备的丝素蛋白水凝胶其抑菌圈最大，抗菌效果最好，其余的都有抑菌圈,但相对较小，而纯丝素的没有抑菌圈，说明活性剂的加入增加了抑菌效果。

参见附图2，为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶对大肠杆菌的抗菌实验结果图，中间为纯丝素凝胶作为对比，由正上方开始顺时针依次为实施例1、2、3和4的结果，由图2可以看出，实施例2采用的十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）的抑菌圈最大，抗菌效果最好，其余的都有抑菌圈但相对较小，而纯丝素的没有抑菌圈，说明活性剂的加入增加了抑菌效果。

参见附图3，为本发明各实施例提供的丝素蛋白水凝胶与纯丝素凝胶压缩性能测试的结果对比曲线，由图3可以看出，纯丝素凝胶压缩时在30%左右出现了断裂，而加入表面活性剂的水凝胶在压缩范围内直到70%也没有出现断裂，压缩强度还在上升，说明所制备的水凝胶压缩韧性比纯丝素蛋白水凝胶好。

Claims

1.一种瞬时制备抗菌丝素蛋白水凝胶的方法，其特征在于：按体积比100:1～10，将浓度为20～100克/升的丝素蛋白水溶液与浓度为10～1000毫摩尔/升的季铵盐阳离子表面活性剂溶液混合均匀，瞬时得到一种抗菌丝素蛋白水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种瞬时制备抗菌丝素蛋白水凝胶的方法，其特征在于：所述的季铵盐阳离子表面活性剂为十烷基三甲基溴化铵，十二烷基三甲基溴化铵，十四烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基溴化铵，十八烷基三甲基溴化铵，苄基三甲基溴化铵，苄基三乙基溴化铵，十烷基三甲基氯化铵，十二烷基三甲基氯化铵，十六烷基三甲基氯化铵，十八烷基三甲基氯化铵，十四烷基三甲基氯化铵，苄基三甲基氯化铵，三乙基苄基氯化铵，(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵中的一种，或几种的任意组合。

3.按权利要求1制备方法得到的一种抗菌丝素蛋白水凝胶。