CN103849685A - 一种多重pcr同时检测gstm1、gstt1、gstp1基因多态性的简易方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法，在GSTP1A313G多态性TP-ARMS-PCR的基础上，加入3个多态性位点的扩增引物，配成引物混合物后一起扩增，扩增后琼脂糖凝胶电泳即可对3个多态性位点进行分型。本发明中的有益效果为：对GSTP1A313G多态性的分型不需要内切酶，分型所需时间更短、成本更低，且同时对GSTM1、GSTT1缺失多态性进行了分型，进一步较低了成本，缩短了检测时间，不需要昂贵的设备，可以在普通实验室开展，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于遗传学领域，具体涉及一种多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法。
背景技术
GSTM1、GSTT1缺失多态性和GSTP1 A313G（Ile105Val）多态性是3个在遗传学上研究得比较多的多态性位点。因为都是谷胱甘肽转移酶的功能性多态性位点，这3个多态性通常一起被研究。目前，对GSTM1、GSTT1缺失多态性的检测通常使用多重PCR的方法，而对GSTP1 A313G多态性的检测通常使用酶切的方法，该方法需要昂贵的内切酶对PCR产物进行消化，然后再电泳分型，因此成本较高。有必要建立一种能在普通实验室开展的能同时对3个多态性位点同时进行检测的方法。
四引物扩增抗拒突变体系PCR（tetraprimer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，TP-ARMS-PCR）是在等位基因特异性扩增的基础上建立的1次PCR反应即可对SNP分型的技术。该技术用4条引物一次PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳就可以区分SNP的3种基因型，不需要内切酶，是一种可在单管中对SNP进行快速测定的高效廉价方法。如果在GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR的基础上，加入GSTM1、GSTT1缺失多态性的引物一起扩增，从而可以实现1次PCR反应即可同时对3个多态性位点进行分型。因为该方法对GSTP1 A313G多态性的分型不需要内切酶，因此所需时间更短、成本更低，且同时对GSTM1、GSTT1缺失多态性进行了分型，进一步较低了成本，缩短了检测时间，有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法，该简易方法可以对GSTM1、GSTT1缺失多态性和GSTP1 A313G多态性进行检测，从而降低成本，缩短检测时间。
本发明是这样实现的，其特征是：在GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR的基础上，加入3个多态性位点的扩增引物，配成引物混合物后一起扩增，扩增后琼脂糖凝胶电泳即可对3个多态性位点进行分型。
本发明所述3个多态性位点的扩增引物共计8条，各引物的核苷酸序列及其在反应体系中的浓度、扩增产物长度见下表1：
表1 GSTP1 A313G多态性和GSTM1、GSTT1缺失多态性多重PCR扩增引物
引物中GSTP1-G和GSTP1-A引物3' 端有下划线的核苷酸为多态性位点（A或G），斜体加粗的核苷酸为增加特异性的错配核苷酸。
本发明中的有益效果为：对GSTP1 A313G多态性的分型不需要内切酶，因此分型所需时间更短、成本更低，且同时对GSTM1、GSTT1缺失多态性进行了分型，进一步较低了成本，缩短了检测时间，不需要昂贵的设备，可以在普通实验室开展，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为6株细胞3个多态性位点多重PCR琼脂糖凝胶电泳图。
在图中， 1为乳腺癌细胞T-47D，2为乳腺癌细胞MDA-MB-231，3为乳腺癌细胞MDA-MB-435，4为肺癌细胞95-D，5为肝癌细胞HEPG-2，6为肺癌细胞A549，7为阴性对照，M为DNA 分子量标准。
具体实施方式
以下结合附图说明对本发明的实施例作进一步详细描述，但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用本发明的相似结构及其相似变化，均应列入本发明的保护范围。
本发明多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法是在GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR的基础上，加入GSTM1、GSTT1缺失多态性的引物一起扩增，从而实现1次PCR即可同时对3个多态性位点进行分型。
本发明中GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR所用引物的设计是本发明的关键和难点，在设计引物时考虑了以下因素：1）GSTP1 A313G多态性等位基因特异性引物扩增片段的长度与GSTM1、GSTT1缺失多态性扩增产物的长度差别在50bp以上，使其易于在琼脂糖凝胶电泳上区分。2）GSTP1 A313G多态性扩增引物的Tm与GSTM1、GSTT1缺失多态性扩增引物的Tm相近，使其能在单管内扩增。
在对GSTP1 A313G多态性扩增引物多次优化的基础上，得到了表1中GSTP1 A313G多态性扩增的4条引物。对6种细胞GSTP1 A313G多态性的分型表明该引物能有效的对GSTP1 A313G多态性进行分型。
本发明的多重PCR在普通PCR仪上即可完成，PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳即可得到3个位点的多态性，不需要昂贵的设备，在普通实验室即可完成，具有较好的应用前景。
本发明使用以下仪器和试剂：
1）PCR仪 MG96G型，杭州朗基科学仪器有限公司
2）水平电泳槽 DYCP-32B型，北京市六一仪器厂
3）电泳仪 EPS-300型，上海天能科技有限公司
4）高速台式离心机 TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂
5）凝胶成像系统 JS-680B型，上海培清科技有限公司
6）移液器 大龙医疗设备(上海)有限公司
7）2×Taq master mix 上海近岸科技有限公司
如图1所示，以下用6株细胞3个多态性位点的具体检测过程说明本发明：从图中可以看出本发明能清晰的对GSTM1、GSTT1缺失多态性和GSTP1 A313G多态性进行分型。
a、用酚氯仿法提取6株细胞基因组DNA，根据琼脂糖凝胶电泳结果稀释为10ng/μl，作为扩增模板。
b、用步骤a中的DNA模板，以下述体系进行扩增：2×Taq master mix 5 μl，DNA模板1 μl（10ng），8条引物混合物（每条引物终浓度见表1）共1.8 μl，ddH2O 2.2 μl。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃ 延伸5 min。
c、琼脂糖凝胶电泳。
凝胶浓度为2%，PCR产物上样4 μl，室温下120V电泳30 min，凝胶成像系统照相。不同多态性位点的基因型判定：GSTM1：出现219 bp为GSTM1 (+)基因型，否则为GSTM1 (-)基因型。GSTT1：出现459 bp为GSTT1 (+)基因型，否则为GSTT1 (-)基因型。GSTP1：只出现284 bp为GSTP1 GG基因型，只出现347 bp为GSTP1 AA基因型，出现284 bp、347 bp为GSTP1 AG基因型。图1的结果显示本发明能清晰的对GSTM1、GSTT1缺失多态性和GSTP1 A313G多态性进行分型。
以上结果还分别用GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR、GSTM1和GSTT1缺失多态性多重PCR进行验证，GSTP1 A313G多态TP-ARMS-PCR、GSTM1和GSTT1缺失多态性多重PCR琼脂糖凝胶电泳结果与本发明的结果一致，证明了本发明的准确性。
Claims (2)
1.一种多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法，其特征是：在GSTP1 A313G多态性TP-ARMS-PCR的基础上，加入3个多态性位点的扩增引物，配成引物混合物后一起扩增，扩增后琼脂糖凝胶电泳即可对3个多态性位点进行分型。
2.根据权利要求1所述一种多重PCR同时检测GSTM1、GSTT1、GSTP1基因多态性的简易方法，其特征在于：所述3个多态性位点的扩增引物共计8条，各引物的核苷酸序列及其在反应体系中的浓度、扩增产物长度见下表：
引物中GSTP1-G和GSTP1-A引物3' 端有下划线的核苷酸为多态性位点（A或G），斜体加粗的核苷酸为增加特异性的错配核苷酸。
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|---|---|---|---|---|
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| CN107164492A (zh) * | 2017-06-08 | 2017-09-15 | 上海龙鼎医药科技有限公司 | 一种基于定量pcr技术的gstt1分型检测方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘颖等: "基于四引物扩增受阻突变体系PCR的多重乳腺癌相关SNP位点检测方法的建立", 《中国科学：生命科学》 * |
| 管峰等: "一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术", 《生命的化学》 * |
| 许青松等: "应用多重PCR技术同时分析GSTM1,GSTT1 ,GSTP1基因型", 《延边大学医学学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058586A (zh) * | 2017-06-08 | 2017-08-18 | 上海龙鼎医药科技有限公司 | 一种基于定量pcr技术的gstm1分型检测方法 |
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