CN103849659A - 一种利用固定化脂肪酶制备共轭亚油酸甘油酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种固定化脂肪酶法制备共轭亚油酸甘油酯的方法。采用含有部分游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯/乙酯与甘油为原料，固定化脂肪酶为催化剂，前期共轭亚油酸酯与甘油交替进料，有效地增加甘油与固定化酶的接触几率，增加反应效率，后期共轭亚油酸酯与甘油混合进料的方法制备共轭亚油酸甘油酯，由于游离脂肪酸与甘油反应生成水分子，有利于酶活的发挥，加快了反应效率，同时反应过程中利用充入氮气或抽真空的方式在线脱甲醇或乙醇，大大缩短反应时间，整个制备过程无需添加任何有机试剂，不会带来任何有机溶剂的残留。与已知的甘油酯的制备方法相比，本发明的方法更简单、成本更低、得到的共轭亚油酸甘油酯产品品质更高，适合工业化生产。

Description

一种利用固定化脂肪酶制备共轭亚油酸甘油酯的方法

技术领域

本发明涉及一种利用固定化脂肪酶制备共轭亚油酸甘油酯的方法。

背景技术

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acids，简称CLA）是亚油酸（Linoleic acids，简称LA）分子的几种立体和位置异构体的通称，是一系列含有共轭双键的十八碳二烯酸。CLA的双键在碳链上主要有四种位置的排列方式：8,10-、9,11-、10,12-和11,13-，且由于共轭双键两端的碳原子都具有顺式（cis）和反式（trans）两种几何构型，即每种位置异构又具有cis-cis、cis-trans、trans-cis、trans-trans四种几何异构体，所以CLA异构体的种类众多。其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA是含量最多且已经被证实具有生理活性的两种主要异构体。天然的CLA主要存在于瘤胃动物如牛、羊的乳脂及肉制品中，每克乳脂中含量从2～25mg不等，并主要以c9,t11-CLA异构体的形式存在。在天然的植物种子中，并不存在具有生理活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA这两种异构体。无论是从动物来源还是植物来源中，人们都无法从直接大量获取CLA。

共轭亚油酸（CLA）具有明显的抗癌作用，对胃癌、乳腺癌、肠癌、皮肤癌和前列腺癌有明显的抑制作用。CLA具有抗动脉硬化、降低血脂及调节血压的作用。CLA能有效地发挥“血管清道夫”的作用。可清除血管中的垃圾。有效调节血液粘稠度，达到舒张血管，改善微循环，平稳血压的作用。同时CLA具有抗氧化、抗疲劳作用、免疫调节及减肥增肌等生理活性被越来越多的国内外科研和医疗机构关注。由于CLA无毒，无用量上限，CLA产品的开发将在食品、医药和饲料工业中得到广泛的应用。

多不饱和脂肪酸作为保健食品已经产业化，但其产品形式主要为乙酯型和游离脂肪酸型，研究结果表明，多不饱和脂肪酸在人体中不仅消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患；游离型多不饱和脂肪酸易于被人体消化和吸收，但易氧化产生对人体有害的过氧化物，直接食用难以被人们接受；甘油酯型是其天然存在形式，易于被人体消化和吸收，且不存在安全性问题，因此甘油酯型多不饱和脂肪酸是作为食用的最好产品形式，其中尤以三甘酯为最理想的形式。

目前，用于制备高CLA含量的甘油酯的方法主要有传统化学法和生物酶法。传统化学法存在反应温度高，对设备腐蚀严重，产品色泽差等缺点；而酶催化法由于具有特异的选择性，具有反应条件温和及对环境友好等优点，在油脂工业中的应用日益受到人们的青睐。

脂肪酶(EC3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，多被用来催化一些酯类合成和转化反应。脂肪酶是作为重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，具有其他酶蛋白无法比拟的优点。可以利用脂肪酶催化酯化、酯交换反应将CLA结合到甘油骨架上，但是一般的游离脂肪酶在无溶剂体系中催化反应活性低并且难以回收，会造成产品分离困难以及成本的增加。目前用于此方面的固定化脂肪酶多为Novozym435，这是一种来源于南极假丝酵母的脂肪酶，但脂肪酶Novozym435的价格昂贵，这是制约其应用的最重要因素。

专利US20030175914利用固定化酶（Novozym435）催化共轭亚油酸乙酯与甘油或者甘油酯进行反应，在添加有机试剂（甲苯，二氧杂环环己烷）及真空度比较大的条件下，反应1-7h，生成的三甘酯含量为84-90%。此工艺存在的问题是有机溶剂毒性大、易残留在产品中，同时有机溶剂挥发性较大造成生产成本较高。

专利CN200710030862.9利用固定化酶（Novozym435）在正己烷存在下，催化甘油与ω-3多不饱和脂肪酸游离脂肪酸酯化反应制备三甘酯，反应24h，甘油三酯含量为甘油酯量的31%，此工艺反应时间比较长，产率比较低。此工艺存在的问题是整个工艺过程耗时较长，易造成产物氧化，降低产品品质，增加成本。

专利CN200810196271.3是通过化学法与酶法结合的方法进行制备甘油酯，首先利用化学法水解鱼油，然后利用固定化酶（Novozym435）在正己烷存在下，催化甘油与水解产物多不饱和脂肪酸进行酯化反应制备甘油酯，利用分子筛除去反应中生成的水，反应48h，甘油三酯含量为90%以上。此工艺存在的问题是有机溶剂毒性大、易残留在产品中，同时有机溶剂挥发性较大造成生产成本较高。

专利CN200810162265.6采用多不饱和脂肪酸游离脂肪酸与甘油进行脂肪酶（Novozym435）催化反应制备n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）甘油酯，添加1,4-二氧六环。反应2-4h，酯化率达到50%，甘油三酯含量占10-20%。用到的添加剂会在最终产品中残留，同时工艺中用到分子筛，不易重复利用，增加了反应成本。此外，该工艺存在的问题是有机溶剂毒性大、易残留在产品中，同时有机溶剂挥发性较大造成生产成本较高。

专利CN200820168426.8设计了一套新型的制备甘油酯产品的装置，酶层析柱与分子筛柱为一组反应器，进行酶催化，可以实现几组反应器串联的连续化反应设备。同时利用有机溶剂（1,4-二氧六环）对物料进行混匀。但没有具体的实验数据支撑。此工艺存在的问题是有机溶剂毒性大、易残留在产品中，同时有机溶剂挥发性较大，造成生产成本较高。

通过以上专利对比分析可以看出，由于脂肪酸和甘油难于形成均一反应体系，往往需要选用适宜的有机溶剂体系的同时加强搅拌。但能扩大到商业规模的很少，原因是有机溶剂的毒性、挥发性和昂贵的价格。无溶剂体系酶促反应不仅解决了有机溶剂的毒性或表面活性剂问题，而且减少了纯化过程的许多步骤，大大降低了对环境的污染，有很好的应用前景。同时无溶剂体系为反应提供了与传统溶剂不同的新的分子环境，有可能使反应的选择性或转化率得到提高。在脂肪酶催化的酯交换反应和酯合成反应中，常使用无溶剂体系。但是，无溶剂体系也存在较大的问题。例如专利CN201010147162利用多不饱和脂肪酸乙酯与甘油进行酶催化反应，真空脱除乙醇促使反应进行，不添加任何有机溶剂，反应300h，甘油三酯含量为甘油酯的80%以上。但是可以看出，无溶剂体系反应时间比较长，不利于工业化生产。

产品化的共轭亚油酸甘油酯的制备大部分是化学法，起始原料为共轭亚油酸乙酯及甲酯，制备共轭亚油酸乙酯及甲酯是通过红花油与甲醇酯酯交换得到亚油酸甲酯产品，然后通过碱性催化剂催化共轭化后，得到共轭亚油酸乙酯及甲酯，物料中含有部分皂化的游离脂肪酸，需要进行去酸值得到酸值≤1的物料才能进行酯交换反应，工序繁琐，影响产品品质。

发明内容

本发明提供一种利用固定化脂肪酶催化共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯与甘油反应制备共轭亚油酸甘油酯型产品的方法，目的是提供一种反应时间比较短，利于工业化生产的无溶剂体系的生物酶法制备共轭亚油酸甘油酯型产品的方法。本发明的方法是以具有酸值的共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯和甘油为起始料，固定化脂肪酶为催化剂，采用在制备工艺的前期甘油与共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯交替进料，后期甘油与共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯混合进料的工艺。与已知的酶法制备甘油酯的工艺相比，此工艺更简单、成本更低、得到的共轭亚油酸甘油酯产品品质更高，适合工业化生产。

本发明是以如下的技术方案来实现的。

一种制备共轭亚油酸甘油酯的方法，包括以下步骤：

（1）物料罐中加入含游离脂肪酸的共轭亚油酸酯原料与甘油，静置分层，预热至65-85℃；

（2）将在物料罐上层的共轭亚油酸酯与在物料罐下层的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，分别匀速循环；

（3）将步骤（2）的物料罐中物料，混合均匀，匀速泵入步骤（2）的酶反应柱中，酶催化反应20-30h，收集反应产物；

其中，所述共轭亚油酸酯原料中所述的共轭亚油酸酯为共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯；在步骤（3）所述的酶催化反应过程中物料罐物料连续通入氮气或者抽真空，脱除甲醇或乙醇。

本发明所述固定化脂肪酶是申请人申请的专利CN103224926A中所述的方法制备。具体为，所述的固定化脂肪酶来源于南极假丝酵母（C.Antarctica）、产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）、曼赫根毛霉（R.miehei）。制备固定化脂肪酶时，将含脂肪酶、水溶性蛋白以及糖类化合物的液体介质吸附于载体，载体可以为高分子有机合成材料，主要有Amberlite XAD761、AmberliteXAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES-1环氧树脂。然后通过交联剂将脂肪酶连接至载体上，不易脱落。交联剂可以是聚乙烯亚胺，碳化二亚胺、聚丙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、对苯二醛中的一种。再加入适当浓度的包埋剂，包埋剂可以选择阿拉伯胶、海藻酸钙、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸钠和明胶中的一种，使吸附的脂肪酶更紧密的结合于载体上，使其不易泄露，增加酶活性，提高重复使用次数。

本发明的技术方案中，所述的固定化脂肪酶的含水量控制在1-10%。

本发明的技术方案中，所述的固定化脂肪酶可以循环利用100次以上，每次更换新的物料，只需用共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯浸润即可。

本发明的技术方案中，所述的共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯所含游离脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、共轭亚油酸的混合物，游离脂肪酸的质量百分含量优选为0-15%，更优选为5-15%，最优选为5-10%。所述的共轭亚油酸(CLA)，由四种异构体组成，其中顺9，反11（“c9，t11”）-CLA和反10，顺12（“t10，c12”）-CLA含量为80%及以上，其它的异构体反9，反11（“t9，t11”）-CLA与反10，反12（“t10，t12”）-CLA的含量≤1%。

本发明采用含有部分游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯为原料进行制备甘油酯反应。技术人员在实践中，出乎意料地发现，含有少量游离脂肪酸的共轭亚油酸酯比不含游离脂肪酸的共轭亚油酸酯反应效率更高，分析认为，含有游离脂肪酸的共轭亚油酸酯在反应中能够产生部分水分子，对固定化脂肪酶起到润滑作用，有利于酶活的发挥，加快了反应效率。这一应用克服了通常认为的必须采用不含游离脂肪酸的共轭亚油酸酯制备共轭亚油酸甘油酯的技术偏见。同时，这一应用与通常的技术相比，既省去了反应前使用硫酸氢钠等二次酯化去酸值的过程，也省去了其后水洗去除中和产物以及杂质的步骤，大大减少了反应时间，简化了反应步骤，减少了反应最终产物杂质含量,在本领域中尚未见采用含有部分游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯或乙酯为原料，制备共轭亚油酸甘油酯。

本发明的技术方案中，步骤（1）中所述的共轭亚油酸酯与甘油的摩尔比为3-5:1。

本发明的技术方案中，步骤（3）所述的酶催化反应温度优选为35-60℃，即在整个反应过程中酶反应柱温度要控制在35-60℃。

本发明的技术方案中，所述的固定化脂肪酶的使用量为共轭亚油酸酯质量的5-10%。

上述制备方法的步骤（2）为反应第一阶段，在优选的技术方案中，反应起始5-10h进行交替进料，即①将共轭亚油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，匀速循环1-3次，停止循环；②将甘油泵入酶反应柱中，匀速循环1-3次，停止循环；③反复步骤①～②5-10h；其中步骤①和②中，物料循环速率为0.5-3ml/min，最优的流速控制在1-2.5ml/min。在具体实施方式中，也可以首先用共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯对固定化酶进行浸润10-20min，然后对共轭亚油酸甲酯或者乙酯与甘油进行交替进料,进料顺序任意。反应起始阶段，体系中没有单甘脂，物料的混合效果不好，形成的是水包油的体系，固定化酶接触共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯的几率远远大于甘油，导致反应效率比较慢，采用共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯与甘油交替进料，可以有效地增加甘油与固定化酶的接触机率，增加反应效率。反应体系中产生一定量的单甘脂后，反应体系中物料在单甘脂乳化作用下，形成均一体系，反应效率提高。

上述制备方法的步骤（3）为反应第二阶段，在优选的技术方案中，在步骤（2）中，物料通过恒流泵循环于物料罐与酶反应柱后，被收集在物料罐中的物料搅拌混合均匀，搅拌速率为100-200rpm/min，通过恒流泵匀速，速度控制在0.5-3ml/min，最优的流速控制在1-2.5ml/min，将物料液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中酶催化合成甘油酯反应。

在优选的技术方案中，所述酶催化反应的温度为35-60℃，优选为40-60℃,更优选为45-55℃。

本发明的共轭亚油酸甘油酯的制备方法，在酶催化反应过程中产生的反应副产物为甲醇或乙醇，本发明采用在整个酶催化反应过程中不断通入氮气或者抽真空的方式除去甲醇或乙醇，其中氮气流量控制在0.1-1.0L/min，抽真空的负压控制在0.3-1.0Mpa，以保证在最少的能源与物料消耗的前提下，去除反应副产物。另一方面，甲醇、乙醇的沸点分别为64.65℃、78.4℃，本发明将反应物料的混合温度控制在65-85℃可以更好的去除甲醇或乙醇，加快反应速度，提高反应效率。

本发明的方法制备得到的共轭亚油酸甘油酯，色泽浅淡，除c9，t11CLA和t10，c12CLA活性异构体以外的其它共轭亚油酸异构体不增长，产品中共轭亚油酸甘油单酯质量百分含量为0-1%，共轭亚油酸甘油二酯的质量百分含量为1-20%，共轭亚油酸甘油三酯的质量百分含量为75-90%。

本发明中，共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯的共轭亚油酸甘油酯酯化率均达70-90%。

本发明的总反应时间为25-40h，缩短到以往技术300h的反应时间的8-13%，大大缩短了反应时间，有利于工业化生产。

本发明的制备共轭亚油酸甘油酯的方法，也适用于其它多不饱和脂肪酸甘油酯的制备。

本发明的有益效果：

（1）本发明的制备方法，直接利用固定化脂肪酶催化共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯为原料与甘油反应制备共轭亚油酸甘油酯。工艺中以含有游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯为原料省去了共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯的去酸值的前处理工艺，同时整个工艺中不添加任何有机试剂，省去了其后水洗去除中和产物以及杂质的步骤，也省去了后续分离纯化的繁琐工序，大大减少了反应时间，简化了反应步骤，减少了反应最终产物杂质含量，提高了产品的品质，降低了生产成本。

（2）本发明中使用的固定化脂肪酶成本低廉，约是脂肪酶Novozym435价格的1/3，重复利用率高，后续处理简单，大大节省了成本，利于工业化生产。

（3）本发明利用升高物料温度，同时冲入低流量的氮气除去生成的甲醇或者乙醇，此工艺脱除副产物的条件简单，易于实验，成本低，易于工业化。

（4）本发明制备得到的共轭亚油酸甘油酯色泽浅淡，除c9，t11-CLA和t10，c12-CLA活性异构体以外的其它共轭亚油酸异构体不增长，产品中，共轭亚油酸甘油单酯的质量百分含量为0-1%，共轭亚油酸甘油二酯的质量百分含量为1-20%，共轭亚油酸甘油三酯的质量百分含量为75-90%。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学试剂公司购买。

本发明所述固定化脂肪酶是我公司申请的专利CN103224926A中所述的方法制备。

在下述实施例中使用的固定化脂肪酶是专利CN103224926A中公开的实施例4中制备的固定化脂肪酶。

酶反应柱的准备：下述实施例中使用的酶反应柱为带加热套的玻璃层析柱，反应柱的规格为:长度20cm,直径1.6cm。酶反应柱与恒流泵相连接。反应液在反应过程中匀速流经恒流泵然后进入酶反应柱中，反应液在物料罐和酶反应柱中匀速循环。在下述实施例中，进行物料罐上层的共轭亚油酸循环时，由上层低端出料循环回到共轭亚油酸层，避免与下层的甘油混合。同样，进行物料罐上层的甘油循环时，由下层的低端出料循环回到下层的甘油层，避免与下层的甘油混合。

装柱方法：将固定化脂肪酶以干法装住的方式进行填充，装柱时先利用固定化脂肪酶自然沉降入柱中，然后用转换头将其压实。

原料：含游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯原料由下述方法制备：

①将红花籽油、甲醇和氢氧化钠投入到反应釜中，红花籽油与甲醇的投料摩尔比为1:3.5，氢氧化钠的加入量为红花籽油质量的20-30%，氮气置换后在200℃条件下搅拌反应7h；

②反应产物酸化至pH为2，搅拌，静置，分离出油相产物，水洗至近中性，减压脱水，得到共轭亚油酸初产物；

③将共轭亚油酸初产物与甲醇或乙醇以摩尔比1:6混合，加入共轭亚油酸质量的7%的硫酸氢钠或硫酸氢钾，80℃条件下反应7h；生成酸值≤30mg KOH/g的共轭亚油酸甲酯或乙酯；

④将步骤③的产物加入其质量1%的活性白土及其质量1%的活性炭，在75℃搅拌1.5h后过滤；

⑤步骤④所得滤液于175℃，真空度20Pa条件下进行分子蒸馏分离纯化得含有0-30%游离酸共轭亚油酸甲酯产品。

在上述步骤①-⑤中，当步骤③的反应时间为7h时，得到含有1%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯产品。

在上述步骤①-⑤中，当步骤③的反应时间为4h时，得到含有5%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯产品。

在上述步骤①-⑤中，当步骤③的反应时间为2.5h时，得到含有10%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯产品。

在上述步骤①-⑤中，当步骤③的反应时间为1h时，得到含有15%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯产品。

本发明采用高效液相色谱测定共轭亚油酸产品中所含的组分及其含量，测定条件为：色谱柱为C18柱（4.6mm×250mm×5μm），流动相为丙酮与乙腈混合物（丙酮:乙腈=70:30（v/v）），流速为1ml/min,检测波长为210nm。

实施例1

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在45℃；

（2）将含有1%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比3:1投入至物料罐里，预热至65℃；

（3）将步骤（2）中的物料搅拌混合均匀，进行搅拌速度为100rpm/min，混合均匀的料液通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，在45℃、连续反应35h，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的共轭亚油酸甲酯，得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例2

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在45℃；

（2）将含有0%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比3:1投入至物料罐里，静置，反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至65℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应8h，停止循环；

（4）将步骤（3）中物料罐中的反应液搅拌混合均匀，搅拌速度为100rpm/min，混合均匀的料液通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，在45℃、连续反应20h，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的共轭亚油酸甲酯，得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例3

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在50℃；

（2）将含有5%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比3.5:1投入至物料罐里，静置，反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至65℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应8h，停止循环；

（4）将步骤（3）中物料罐中的反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在50℃、酶催化反应20h，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例4

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在55℃；

（2）将含有5%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比3.5:1投入至物料罐里，静置，反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至65℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应8h，停止循环；

（4）将步骤（3）的物料罐中的反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在55℃、酶催化反应20h，其中在酶催化反应的过程中同时通入氮气，氮气流量为0.5l/min。反应完毕后，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯，得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例5

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在60℃；

（2）将含有5%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比4:1投入至物料罐里，静置反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至80℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应8h，停止循环；

（4）将步骤（3）的物料罐中的反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在60℃、酶催化反应20h，其中在酶催化反应的过程中同时通入氮气，氮气流量为0.1l/min。反应完毕后，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯，得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例6

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在60℃；

（2）将含有10%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比4:1投入至物料罐里，静置反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至75℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应8h，停止循环；

（4）将步骤（3）的物料罐中反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在60℃、酶催化反应20h，其中在酶催化反应的过程中同时通入氮气，氮气流量为0.5l/min，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯，得到最终产物；

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例7

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在50℃；

（2）将含有15%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比4:1投入至物料罐里，静置反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至75℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应9h，停止循环；

（4）将步骤（3）的物料罐中的反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在50℃、酶催化反应20h，其中在酶催化反应的过程中同时通入氮气，氮气流量为0.3l/min，反应完毕后，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯，得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

实施例8

（1）将2.4g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在55℃；

（2）将含有10%游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯与甘油按摩尔比4:1投入至物料罐里，静置反应液分两层，其中上层为共轭亚油酸甲酯，下层为甘油，反应液预热至85℃；

（3）将连接恒流泵的进样管通入在反应液上层的共轭亚油酸甲酯料底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次后，将进料管通入到在反应液下层的甘油层底端，通过恒流泵泵入酶反应柱中，流速为0.5ml/min，循环两次，以此反复交替进料反应10h，停止循环；

（4）将步骤（3）的物料罐中的反应液搅拌均匀，通过恒流泵泵入步骤（3）的酶反应柱中，反应液搅拌速度为100rpm/min，流速为0.5ml/min，在55℃、酶催化反应16h，反应过程中抽真空，真空负压为0.6Mpa，反应完毕后，收集反应产物，在175℃下，20Pa进行分子蒸馏除掉过量的甲酯得到最终产物。

最终产物经高效液相色谱测定其组成及含量，结果如表1所示。

在实施例8的反应条件下，固定化酶能够被循环利用50次，酶活损失≤10%。

在实施例6的反应条件下，固定化酶能够被循环利用40次，酶活损失≤10%。

表1.反应产物组成及其在反应产物中的含量

表1的结果显示，采用交替进料的方式（实施例2）有利于CLA三甘酯的合成，使用含有游离脂肪酸的共轭亚油酸甲酯或者共轭亚油酸乙酯能够大大提高反应效率，尤其是提高了最希望获得的有效成分CLA甘油三酯的含量20-30%不等。酶反应温度、CLA甲酯或者乙酯与甘油的摩尔比及甲醇的除去速度（氮气流量影响甲醇除去速度）是影响CLA三甘酯的合成效率主要因素。酶反应温度越高，CLA甲酯或者乙酯与甘油的摩尔比越大并且甲醇除去速度越快越有利于CLA三甘酯的合成。但是温度越高会造成酶活的损失，影响固定化脂肪酶的循环利用率，对于本实例中的固定化脂肪酶最适温度为55℃，摩尔比越大反应产物中残留的甲酯量越多，最适摩尔比为3.5:1，通入氮气或者抽真空都可以将甲醇除去，提高CLA三甘酯的合成效率。

Claims (9)

1.一种酶法制备共轭亚油酸甘油酯的方法，包括以下步骤：

（1）物料罐中加入含游离脂肪酸的共轭亚油酸酯原料与甘油，静置分层，预热至65-85℃；

（2）将在物料罐上层的共轭亚油酸酯原料与在物料罐下层的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，分别匀速循环；

（3）将步骤（2）的物料罐中物料，混合均匀，匀速泵入步骤（2）的酶反应柱中，酶催化反应20-30h，收集反应产物；

其中，所述共轭亚油酸酯原料中所述的共轭亚油酸酯为共轭亚油酸甲酯或共轭亚油酸乙酯；在步骤（3）所述的酶催化反应过程中充入氮气或者抽真空，脱除甲醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的游离脂肪酸在共轭亚油酸酯原料中的质量百分含量为0-15%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的共轭亚油酸酯与甘油的摩尔比为3-5:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化脂肪酶的使用量为共轭亚油酸酯质量的5-10%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）包括如下过程：①将共轭亚油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反应柱中，匀速循环1-3次，停止循环；②将甘油泵入酶反应柱中，匀速循环1-3次，停止循环；③反复步骤①～②5-10h；其中步骤①和②中，物料循环速率均为0.5-3ml/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮气流量为0.1-1.0L/min，抽真空的负压为0.3-1.0Mpa。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的酶催化反应温度为35-60℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应产物中共轭亚油酸甘油单酯的质量百分含量为0-1%，共轭亚油酸甘油二酯的质量百分含量为1-20%，共轭亚油酸甘油三酯的质量百分含量为75-90%。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共轭亚油酸酯的共轭亚油酸甘油酯酯化率为70-90%。