CN103834616A - 稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型及其建立方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型及其建立方法与应用。该细胞模型为CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞系，构建方法是以CHO-K1细胞为宿主细胞，将KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位转染入CHO-K1细胞中。本发明通过将组成Iks通道的KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位共同转染到CHO-K1细胞中，建立了体外稳定表达KCNQ1/KCNE1细胞模型，为药物的体外高通量筛选提供了一种新的有效途径。

Description

稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型及其建立方法与应用
技术领域
本发明涉及体外高通量药物筛选领域，特别是涉及一种稳定表达人心肌细胞Iks的CHOK1细胞模型及其建立方法与应用。
背景技术
离子通道是细胞膜上的蛋白质孔道,离子的跨膜流动是细胞传递信息的基础。钾通道是一类普遍存在的膜蛋白,在很多的生理过程中扮演着极为重要的角色。缓慢激活延迟整流钾电流（Iks）对于控制心脏电生理活动有着重要作用，参与人心肌细胞动作电位复极，特别是平台期形成与维持的重要外向离子流。Iks通道是由KCNQ1基因编码的α亚基单位，以及KCNE1基因编码的β亚基单位组成的。
IKs其亚基上的基因突变，会引起Iks功能异常，是多种恶性心律失常的重要原因，深入研究Iks通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。由于人心肌细胞Iks电流密度小，存在多种电流成分干扰，以及组织标本来源困难等原因，直接利用人心肌细胞对药物的高通量筛选来说不是最佳选择，因此建立体外的稳定表达的Iks细胞模型具有很大的价值，有利于药物的稳定高效筛选。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）是来源于中国仓鼠卵巢的细胞系，应用于生物和医学研究以及应用于商业化的治疗蛋白的生产。CHO-K1细胞作为生物制药生产的主要宿主细胞，具有高增长率，高产率，易于遗传操作，本身表面离子通道少，干扰少等特点，所以更适用于表达外源离子通道蛋白，用于药物筛选。
电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。传统的手动膜片钳技术虽然能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，但是其人力资源耗费大，且通量小，效率低，不能进行大量的克隆筛选以及药物化合物的筛选，所以很难成为细胞克隆初期筛选的最好的实验方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，它有利于药物的稳定高效筛选。
为解决上述技术问题，本发明的稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，以CHO-K1细胞为宿主细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。
本发明要解决的技术问题之二是提供上述细胞模型的建立方法。
为解决上述技术问题，本发明的稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型的建立方法，步骤包括：将KCNQ1和KCNE1质粒分别连接到载体上，然后转染入CHO-K1细胞。
本发明要解决的技术问题之三是提供上述细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1．本发明通过将组成Iks通道的KCNQ1基因编码的α亚基单位以及KCNE1基因编码的β亚基单位共同转染到CHO-K1细胞中，在细胞内共表达，发挥通道功能，成功建立了体外稳定表达KCNQ1/KCNE1的CHOK1细胞模型，对进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。
2．本发明使用膜电位试剂盒，通过FLIPR检测荧光信号值，能够快速、高效地筛选表达通道且有通道功能的阳性克隆，为电生理实验提供更有针对性的克隆“候选者”，从而节省了大量的时间和人力，是一种很好的高通量筛选途径。
附图说明
图1是FLIPR检测得到的反应信号图。
图2是手动膜片钳在CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞上记录到的CHOK1/KCNQ1原始电流图。
图3是手动膜片钳记录到的KCNQ1/KCNE1通道的电流-电压关系曲线。
图4是在手动膜片钳验证中，KCNQ1/KCNE1通道的选择性抑制剂Chromanol（色原烷醇）抑制了KCNQ1/KCNE1通道的电流。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合图示的实施方式，详述如下：
实施例1
（一）质粒载体构建
1．全基因合成KCNQ1和KCNE1，在基因5’末端引入酶切位点EcoRI，3’末端引入酶切位点HindIII。
2．在50μl的反应体系中，37℃，用EcoRI和HindIII，双酶切KCNQ1、KCNE1和载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)3小时。
3．在20μl的反应体系中，16℃，用T4连接酶把KCNQ1和KCNE1分别连接到载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)上。
4．连接产物分别转化到Top10感受态细菌中，均匀涂在含有氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）培养基平板上，37摄氏度培养14小时后，挑单克隆进行菌落PCR（20μl的反应体系，94℃变性，58℃退火，72℃延伸，30个循环）鉴定，并测序阳性克隆。
测序结果：
KCNQ1 mRNA序列(2031bp)：
ATGGCCGCGGCCTCCTCCCCGCCCAGGGCCGAGAGGAAGCGCTGGGGTTGGGGCCGCCTGCCAGGCGCCCGGCGGGGCAGCGCGGGCCTGGCCAAGAAGTGCCCCTTCTCGCTGGAGCTGGCGGAGGGCGGCCCGGCGGGCGGCGCGCTCTACGCGCCCATCGCGCCCGGCGCCCCAGGTCCCGCGCCCCCTGCGTCCCCGGCCGCGCCCGCCGCGCCCCCAGTTGCCTCCGACCTTGGCCCGCGGCCGCCGGTGAGCCTAGACCCGCGCGTCTCCATCTACAGCACGCGCCGCCCGGTGTTGGCGCGCACCCACGTCCAGGGCCGCGTCTACAACTTCCTCGAGCGTCCCACCGGCTGGAAATGCTTCGTTTACCACTTCGCCGTCTTCCTCATCGTCCTGGTCTGCCTCATCTTCAGCGTGCTGTCCACCATCGAGCAGTATGCCGCCCTGGCCACGGGGACTCTCTTCTGGATGGAGATCGTGCTGGTGGTGTTCTTCGGGACGGAGTACGTGGTCCGCCTCTGGTCCGCCGGCTGCCGCAGCAAGTACGTGGGCCTCTGGGGGCGGCTGCGCTTTGCCCGGAAGCCCATTTCCATCATCGACCTCATCGTGGTCGTGGCCTCCATGGTGGTCCTCTGCGTGGGCTCCAAGGGGCAGGTGTTTGCCACGTCGGCCATCAGGGGCATCCGCTTCCTGCAGATCCTGAGGATGCTACACGTCGACCGCCAGGGAGGCACCTGGAGGCTCCTGGGCTCCGTGGTCTTCATCCACCGCCAGGAGCTGATAACCACCCTGTACATCGGCTTCCTGGGCCTCATCTTCTCCTCGTACTTTGTGTACCTGGCTGAGAAGGACGCGGTGAACGAGTCAGGCCGCGTGGAGTTCGGCAGCTACGCAGATGCGCTGTGGTGGGGGGTGGTCACAGTCACCACCATCGGCTATGGGGACAAGGTGCCCCAGACGTGGGTCGGGAAGACCATCGCCTCCTGCTTCTCTGTCTTTGCCATCTCCTTCTTTGCGCTCCCAGCGGGGATTCTTGGCTCGGGGTTTGCCCTGAAGGTGCAGCAGAAGCAGAGGCAGAAGCACTTCAACCGGCAGATCCCGGCGGCAGCCTCACTCATTCAGACCGCATGGAGGTGCTATGCTGCCGAGAACCCCGACTCCTCCACCTGGAAGATCTACATCCGGAAGGCCCCCCGGAGCCACACTCTGCTGTCACCCAGCCCCAAACCCAAGAAGTCTGTGGTGGTAAAGAAAAAAAAGTTCAAGCTGGACAAAGACAATGGGGTGACTCCTGGAGAGAAGATGCTCACAGTCCCCCATATCACGTGCGACCCCCCAGAAGAGCGGCGGCTGGACCACTTCTCTGTCGACGGCTATGACAGTTCTGTAAGGAAGAGCCCAACACTGCTGGAAGTGAGCATGCCCCATTTCATGAGAACCAACAGCTTCGCCGAGGACCTGGACCTGGAAGGGGAGACTCTGCTGACACCCATCACCCACATCTCACAGCTGCGGGAACACCATCGGGCCACCATTAAGGTCATTCGACGCATGCAGTACTTTGTGGCCAAGAAGAAATTCCAGCAAGCGCGGAAGCCTTACGATGTGCGGGACGTCATTGAGCAGTACTCGCAGGGCCACCTCAACCTCATGGTGCGCATCAAGGAGCTGCAGAGGAGGCTGGACCAGTCCATTGGGAAGCCCTCACTGTTCATCTCCGTCTCAGAAAAGAGCAAGGATCGCGGCAGCAACACGATCGGCGCCCGCCTGAACCGAGTAGAAGACAAGGTGACGCAGCTGGACCAGAGGCTGGCACTCATCACCGACATGCTTCACCAGCTGCTCTCCTTGCACGGTGGCAGCACCCCCGGCAGCGGCGGCCCCCCCAGAGAGGGCGGGGCCCACATCACCCAGCCCTGCGGCAGTGGCGGCTCCGTCGACCCTGAGCTCTTCCTGCCCAGCAACACCCTGCCCACCTACGAGCAGCTGACCGTGCCCAGGAGGGGCCCCGATGAGGGGTCCTGA
KCNE1 mRNA序列(390bp)：
ATGATCCTGTCTAACACCACAGCGGTGACGCCCTTTCTGACCAAGCTGTGGCAGGAGACAGTTCAGCAGGGTGGCAACATGTCGGGCCTGGCCCGCAGGTCCCCCCGCAGCAGTGACGGCAAGCTGGAGGCCCTCTACGTCCTCATGGTACTGGGATTCTTCGGCTTCTTCACCCTGGGCATCATGCTGAGCTACATCCGCTCCAAGAAGCTGGAGCACTCGAACGACCCATTCAACGTCTACATCGAGTCCGATGCCTGGCAAGAGAAGGACAAGGCCTATGTCCAGGCCCGGGTCCTGGAGAGCTACAGGTCGTGCTATGTCGTTGAAAACCATCTGGCCATAGAACAACCCAACACACACCTTCCTGAGACGAAGCCTTCCCCATGA
（二）细胞株构建
1．转染前一天，将CHOK1细胞消化，计数，以3×105细胞/孔的数量，铺6孔板，以F12+10%FBS（胎牛血清）培养过夜。
2．取一个1.5ml EP管（
Figure BDA00002453351500041
3810型微量离心管），KCNQ1和KCNE1各取1μg，共2μg质粒，用OPTIMEM培养基补齐体积至100μl，小心加入5μl Fugene HD转染试剂，静置15分钟。
3．15分钟后，将混合物小心加入6孔板，缓慢水平晃均匀，37℃进行培养。
4．转染48小时后，将细胞消化，全部转移至100mm培养皿，用F12+10%FBS培养基培养，加入800ug/ml G418进行筛选。等稳定后换成300ug/ml G418维持培养。
5．筛选2周后直至没有细胞再漂浮死亡的现象，将细胞消化计数，稀释成150个细胞/20ml的密度，以200μl的体积，加入96孔板，进行单克隆的培养。
6．培养10天后，在显微镜下挑选单克隆的细胞孔。每组分别稀释了10块96孔板。通过显微镜观察，得到434个单克隆细胞。
（三）细胞株功能验证
1.FLIPR检测
在做FLIPR检测实验前一天，将每个克隆消化、计数，以2万细胞/50μl每孔的数量种入384孔板，每个克隆种4个复孔。
将Membrane Potential kit（膜电位检测试剂盒）的染料粉末溶于缓冲液（配方见表1）中，配制成2×染料。实验前，甩去384孔板中原有的培养基，加入25μl染料，室温孵育3小时。
表1缓冲液配方
Figure BDA00002453351500051
孵育时，配制360mM的KCl溶液。在FLIPR检测时，以相等体积25μl加入384孔板后，立刻读荧光信号值。FLIPR检测结果如图1所示。通过FLIPR检测，在434个克隆种挑取了15个克隆，准备进行电生理实验检测。
2．电生理检测
电生理检测采用手动全细胞膜片钳（电压钳）的方法，在室温下进行。实验仪器采用Axon系统，包括Multiclamp 700B放大器，DigiData 1440A A/D转换板和pCLAMP10软件。细胞内液的成分为（mM）：KCl 120、KOH 31.25、CaCl25.374、MgCl21.75、EGTA 10、HEPES 10、Na2-ATP 4，用1N氢氧化钾调节pH至7.2；渗透压调至280-290mOsm。玻璃微电极由拉制仪拉制而成，入水电阻为2–4mΩ。细胞外液成分为(mM)：HEPES 10、NaCl 145、KCl 4、CaCl22、MgCl2 1、Glucose 10，用1N氢氧化钠调节pH至7.4；渗透压调至290-300mOsm。
实验中选取一个稳定表达KCNQ1/KCNE1的CHOK1细胞，手动操作形成全细胞膜片钳构架，细胞外由细胞外液持续灌流。KCNQ1/E1电流由Axon系统产生的刺激波引出并被该系统显示和记录。给药时将药物加在灌流的细胞外液中直接作用于细胞。
通过电生理实验，获得电流信号较好的CHOK1-KCNQ1/KCNE1细胞，克隆号“P2F11”。
Figure IDA00002453352100011
Figure IDA00002453352100021

Claims (6)

1.稳定表达人心肌细胞Iks的细胞模型，其特征在于，该细胞模型以CHO-K1细胞为宿主细胞，包含有KCNQ1基因编码的α亚基单位和KCNE1基因编码的β亚基单位。
2.权利要求1所述细胞模型的建立方法，其特征在于，步骤包括：将KCNQ1和KCNE1分别构建到载体上，然后转染入CHO-K1细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体包括pFastBac1-pCDNA3.1(-)和杆状病毒BacMam。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将KCNQ1和KCNE1连接到载体上的步骤包括：
1）全基因合成KCNQ1和KCNE1，在基因5’末端引入酶切位点EcoRI，3’末端引入酶切位点HindIII；
2）用EcoRI和HindIII双酶切KCNQ1、KCNE1和载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)；
3）用T4连接酶把KCNQ1和KCNE1分别连接到载体pFastBac1-pCDNA3.1(-)上；
4）生成杆状病毒BacMam载体。
5.权利要求1所述细胞模型在药物体外高通量筛选中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括治疗心律失常的药物。
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