CN103826691B - 用于原位皮肤基因转移的电子微针集成体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电子微针集成体以及该集成体的制备方法,在该集成体中可溶解微针和电穿孔电极彼此集成,以便在待治疗位置进行集中和有效的透皮基因释放并将基因导入靶细胞中。根据本发明的电子微针集成体包括:基础部件;包括从该基础部件上伸出来的多个电极部件的电穿孔电极,该电穿孔电极与人体皮肤接触施加电场脉冲;以及含有生物相容性和可生物降解的粘性材料和基因物质的微针,所述微针粘着在每个电极部件上并插入人体皮肤中。因此,所述微针可以在皮肤内溶解,然后,所述电穿孔电极将电场脉冲施加在微针插入的位置。
Description
技术领域
本发明涉及一种电子微针集成体以及该电子微针集成体的制备方法,在该电子微针集成体中将可溶解的微结构和电穿孔电极集成为一个结构用于在治疗部位进行透皮基因输送。
背景技术
基因输送(基因转移、输送)和基因疗法的目的是通过将外来基因导入人体内替换具有缺陷细胞的基因,或者通过导入需要的基因来提供特别的功能以治疗疾病或研究治疗模型。特别地,由于皮肤的易接近性和易于监测性,以及其中存在各种皮内免疫细胞,因此皮肤的基因转移和基因疗法备受关注,然而,在将外来基因有效输入皮肤靶细胞及其稳定表达的输送技术(基因输送系统)的研究中,基因渗透和导入生物壁,即皮肤最外层的角质层,以及细胞膜,都是待解决的问题。
依据基因和治疗位置作为合适的输送系统而具备高稳定性的非病毒化学-物理方法越来越受关注,其中,Genetronics公司提出的是一种电穿孔方法,在该方法中,基因的细胞内转染通过电场脉冲暂时增加活体内细胞膜的渗透率来实施(PCT申请,WO99/062592“用于体外基因治疗的流通电穿孔系统”)。然而,因为用于基因的细胞内转染的电穿孔需要细胞内的电场脉冲位置存在足够的基因浓度,为此,需要另外的通常使用注射处理的透皮输送装置,因为这样,所述非集成系统不能获得针对原位治疗位置的有效皮内基因输送。因此,人们提出一种在原位治疗位置进行透皮输送和细胞内基因导入的集成系统,其重点在于透皮输送装置和用于细胞内基因输送的电穿孔间的有效集成。
美国的BTX公司提出了一种系统,在该系统内,将使用注射处理的透皮输送和使用电穿孔的细胞内基因输送方法集成在一个装置上(美国授权专利No.5273525,名称“用于药物和基因输送的注射和电穿孔装置”),以在治疗位置进行透皮基因输送。然而,使用注射处理的透皮输送会引起皮内刺激和疼痛,此外,基因在精细皮肤薄膜中的精确释放是有限的。
约翰·霍普金斯大学提出了一种集成了基因枪和电穿孔的电穿孔基因枪(US专利公开No.20090030364,名称“电穿孔基因治疗枪系统”),然而,对于基因枪来说,在治疗位置的精确透皮输送同样是有限的。因此,本领域需要一种新的用于在治疗位置进行透皮基因输送的集成有电穿孔的透皮输送装置,而作为精确、有效和无痛的透皮输送装置,微针受到关注。
通常,微针具有微米尺寸的直径和长度,穿透皮肤时没有疼痛,使用微针的药物输送用于局部皮内释放,而不是在例如血管或淋巴管的循环系统中释放。Talon Biotech提出了一种系统,在该系统内集成了基因涂布的微针和电穿孔电极(“Smallpox DNA vaccinedelivered by novel skin electroporation device protects mice againstintranasal poxvirus challenge(通过新的皮肤电穿孔装置输送的天花DNA疫苗保护老鼠抵抗鼻内痘病毒的挑战)”,Vaccine25,1814-1823,2007),然而,由于涂布微针载荷的基因量有限,其进行皮内基因释放的量是有限的,因此透皮基因输送效率最终很低。
因此,需要提供一种在治疗位置能进行有效透皮基因输送的系统,在该系统内集成有比涂布微针更有效载荷基因的可溶解微针和电穿孔电极。然而,使用制备可溶解微针的常规成形方法即微浇铸法,很难制备将可溶解微针和电穿孔电极集成到一个结构中的单片集成体。
发明内容
技术问题
因此,本发明的目的是提供一种电子微针集成体以及该电子微针集成体的制备方法,在该电子微针集成体中,可溶解微针和电穿孔电极被集成为一体,可以在原位治疗位置进行集中和有效的用于透皮基因输送和细胞内基因输送的皮内基因释放。
技术方案
为了完成所述目的,根据本发明的电子微针集成体包括电穿孔电极和微针;所述电穿孔电极与人体皮肤接触以施加电场脉冲,包括基础部件和从该基础部件上伸出来的多个电极部件;所述微针粘着在每个电极部件上并插入人体皮肤中,包含生物相容性和可生物降解的粘性材料和遗传物质;其中所述微针在皮肤内降解,并且所述电场脉冲通过电穿孔电极被施加在微针插入的位置。
根据本发明的电子微针集成体的制备方法包括:制备包括基础部件和从该基础部件上伸出来的多个电极部件的电穿孔电极,通过混合生物相容性和可生物降解的粘性材料和遗传物质制备混合组合物,和通过将液态的混合组合物供给到电极部件上并使其凝固来形成微针。
根据本发明的一个示例实施方案,所述微针的形成可以包括:将液态的混合组合物涂布在板状基底上,使电极部件与所涂布的混合组合物接触,通过基底与电极部件的相对运动来牵拉混合组合物,并使被牵拉的混合组合物凝固。
根据本发明的另一个示例实施方案,所述方法还可以包括:在使被牵拉的混合组合物凝固之后,通过加热基底使基底一侧的混合组合物液化。
有益效果
根据本发明,所述遗传物质可以被集中输送到治疗位置,并可以通过在同一位置上施加电场脉冲来提高细胞内基因输送的效率。
附图说明
图1显示了根据本发明一个实施方案的电子微针集成体的制备方法的流程图。
图2和图3显示了电穿孔电极的近似透视图。
图4和图5显示了微针形成方法的近似流程图。
具体实施方式
以下将参考附图详细描述根据本发明示例实施方案的电子微针集成体及其制备方法。
图1显示了根据本发明一个实施方案的电子微针集成体的制备方法的流程图,图2和图3显示了电穿孔电极的近似透视图,以及图4和图5显示了微针形成方法的近似流程图。
参见图1-图5,根据本发明实施方案的电子微针集成体的制备方法(M100)包括:制备电穿孔电极(S10),制备混合组合物(S20),和形成微针(S30)。
电穿孔电极(S10)的制备就是制备用于电穿孔的电极的步骤。所述电穿孔电极(10A-10D)用于电穿孔,即用于施加电场脉冲,以便通过微针在皮肤内输送的遗传物质(基因)顺利地穿透细胞。如图2和图3所示,电穿孔电极(10A-10D)具有板状基础部件11和从该基础部件11上伸出来的多个电极部件12。本发明中,电极部件12的形状可以是如图2和图3所示的各种各样的形状。例如,所述电极部件可以是微刀片、微刀、微纤维、微钉、微探针或微倒钩,更优选微钉、微探针或微倒钩,并且最优选微钉或微探针。
所述电穿孔电极可以使用各种微制造工艺和金属沉积工艺进行制备,这些工艺可以单独进行或结合进行。本发明中,微制造工艺表示用于切割和磨蚀金属和聚合物的工艺,金属沉积工艺表示用于在制造的聚合物上选择性沉积金属和电镀金属的工艺。
如图2所示,电穿孔电极(10A和10B)可以以“金属集成微结构”的形式制备,其中使用金属将基础部件和电极部件集成为一体。本发明中,所述金属优选为可以用于活体的金属,并可以由陶瓷或半导体形成。特别地,用于电穿孔电极的材料是钴、钛、不锈钢、铬、镍、铜、银、金、铝或它们的合金,更优选钴、钛、不锈钢、铬、镍、铜、铝或它们的合金,最优选钛、铬、镍、铝或它们的合金。
金属集成的电穿孔电极可以用本领域已知的各种金属微制造工艺制备。例如,金属微制造可以使用轧、锻、磨、切割或车削工艺进行。此外,电穿孔电极的电极部件的有效底部直径为10-1000μm,更优选50-500μm。有效长径比(长度:底部直径)为0.1-10,更优选0.5-5。
同时,如图3所示,电穿孔电极(10C和10D)可以以“金属图案化的聚合物形式”制备。即,该图案化的形式可以通过下面方法制备:首先使用聚合物制备具有基础部件和电极部件的基本结构,接着在整个结构上进行金属沉积或金属电镀,或者在电极部件上进行选择性金属沉积或金属电镀。
本发明中,聚合物优选为生物相容性的,特别是聚合物如丙烯酸、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯腈、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯和它们的共聚物,更优选甲基丙烯酸树脂或聚丙烯酸树脂。所述金属沉积可以通过本领域已知的各种方法进行,可以优选使用物理金属沉积或化学金属沉积,最优选使用溅射或蒸发的物理金属沉积或者Tollens反应的化学金属沉积来沉积金属。此外,可以在金属沉积之后进一步包括金属电镀。所述用于沉积或者电镀的金属是可以用于活体的金属,优选钴、钛、不锈钢、铬、镍、铜、银、金、铝或它们的合金,更优选钴、钛、不锈钢、铬、镍、铜、铝或它们的合金,最优选钛、铬、镍、铝或它们的合金。
同时,图2所示的金属集成的电穿孔电极仅可以用作单个电极,而图3所示的金属图案化的电穿孔电极可以用作双电极(阴极和阳极)。
在混合组合物(S20)的制备中,通过混合粘性材料和遗传物质制备混合组合物。本发明中,所述粘性材料是生物相容性的、可生物降解的和可溶解于活体内的材料。所述生物相容性材料表示在人体内不具有任何实质毒性的材料,其是化学惰性的且不具备免疫原性;所述可生物降解材料表示可以通过活体内的体液或者微生物被分解的材料;所述可溶解于活体内的材料表示可以被活体内的温度或者体液溶解的材料。
用于本发明的粘性材料是碳水化合物,更优选单糖、二糖、三糖、低聚糖、多糖或者它们的醇衍生物。更优选地,所述粘性材料包括葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽果糖(malturose)、乳果糖(lacturose)、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、松三糖、蜜二糖、木二糖、纤维二糖、水苏糖、山梨糖醇、甘露醇、赤藓醇、木糖醇、乳糖醇(lacitol)、麦芽糖醇;醛糖酸(aldonicacid)和它们的内酯衍生物,例如葡糖酸和葡糖酸γ-内酯,醛糖二酸(aldaric acid)和它们的内酯衍生物,例如瑞巴瑞克酸(ribaraic acid)、阿拉伯酸(arabinaric acid)和半乳糖二酸;糖醛酸,例如葡糖醛酸、半乳糖醛酸和甘露糖醛酸;淀粉、蔬菜胶、取代纤维素(例如,羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和烷基纤维素)、结晶纤维素、肝素、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、藻酸盐、黄芪胶、琼脂和角叉菜胶。
此外,用于本发明的粘性材料具有液态的粘度。所述粘度可以根据类型、浓度、气候条件和温度而变化,并可以根据本发明的目的来调节。优选地,用于本发明的粘性材料的粘度为至多200000cSt。
同时,可以通过本领域已知的各种方法进行所述粘性材料的液化。根据本发明的一个示例实施方案,所述液化可以通过在至少所述生物相容性粘性材料的熔点温度下加热来进行,或者通过将所述生物相容性材料溶解在合适的溶剂(例如水、具有1-4个碳原子的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷、二乙醚、乙酸丁酯,等等)中来进行。
根据所述实施方案,粘性材料的熔点为至少50℃,更优选至少60℃,更更优选至少70℃,和最优选至少80℃。对于所述熔点,其上限没有特别限制,可以优选为500℃,更优选400℃,更更优选300℃,和最优选200℃。
所述用于基因疗法的遗传物质(基因)是一种核酸分子,例如用于消炎药物、抗关节炎药物、抗惊厥药物、抗抑郁药物、抗精神病药物、镇静剂、抗焦虑药物、麻醉拮抗药、抗帕金森病药、胆碱能激动剂、抗癌药物、抗血管生成药物、免疫抑制药物、抗病毒药物、抗生素、促进食欲的药物、抗胆碱药物、抗组织胺药物、抗偏头痛药物、激素药物、用于冠状动脉、脑血管或末梢血管的血管扩张剂、避孕药、抗血栓形成药物、利尿药物、抗高血压药物和心血管病药物的DNA、RNA、siRNA和微RNA。优选地,所述遗传物质包括激素、激素激动剂、酶、酶抑制剂、信号输送蛋白质或其部分、抗体或其部分、单链抗体、结合蛋白或其结合域、抗原、粘着蛋白质、结构蛋白质、调节蛋白、毒蛋白、细胞活素、转录调节因子、凝血因子和疫苗,但是本发明不局限于此。
更具体地说,涉及蛋白质/肽/疫苗的遗传物质包括胰岛素、胰岛素类生长因子1(IGF-1)、生长激素、促红细胞生成素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSFs)、粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSFs)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-1α和β、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-2、表皮生长因子(EGFs)、降血钙素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、肿瘤坏死因子(TNF)、阿托西班(atobisban)、布舍瑞林、西曲瑞克、洛瑞林、去氨加压素、强啡肽A(1-13)、依降钙素、依列多森(eleidosin)、依替巴肽、生长激素释放激素-Ⅱ(GHRH-II)、戈那瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、赖氨酸加压素、奥曲肽、催产素、加压素、促胰液素、辛卡利特、特利加压素、胸腺喷丁、胸腺素α1、曲普瑞林、比伐卢定、卡贝缩宫素、环孢素、艾可西定(exedine)、兰瑞肽、促黄体激素释放激素(LHRH)、那法瑞林、甲状旁腺激素、普兰林肽、恩夫韦地(T-20)、胸腺法新、齐考诺肽、防病毒和疫苗蛋白质。
遗传物质和粘性材料的混合可以使用本领域已知的各种方法进行。可以通过搅拌器进行基础混合,且所述制备可以以水包油或油包水乳液形式和多重乳液的形式进行。乳液的制备方法可以通过直接将遗传物质分散在粘性材料中以制备其中包含遗传物质的乳液的方式进行,优选其中不使用乳化剂,或者使用各种天然或合成乳化剂。
当使用乳化剂时,更优选使用天然乳化剂稳定其中包含基因的乳液,所述天然乳化剂是例如卵磷脂、硼砂、硬脂酸、阿米索软化剂、海立尔凝胶(heliogel)、蜂蜡、黄原酸胶、乳化蜡和增溶剂,或者所述乳液使用至少一种选自以下的合成乳化剂制备:包括水包油乳化剂,例如PEG-8二月桂酸酯、PEG-150双硬脂酸酯、PEG-8硬脂酸酯、PEG-40双硬脂酸酯、PEG-100双硬脂酸酯;或者油包水乳液乳化剂,例如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯和它们的组合。最优选所述乳液在没有乳化剂的情况下制备。例如,可以通过使用均化器在水性粘性材料中乳化包含遗传物质的脂质可溶性液体形成水包油(W/O)型乳液的形式制备混合组合物,或者通过使用均化器在脂质可溶性粘性材料中乳化包含遗传物质的水性液体形成油包水(O/W)型乳液的形式制备混合组合物。
微针的形成(S30)是使用混合组合物在电穿孔电极的电极部件12上形成微针,且特别以如下方式进行。
如图4所示,先将混合组合物涂布在板状基底g上,然后使电穿孔电极的电极部件接触涂布的混合组合物。此后,使电穿孔电极10相对于基底g进行相对运动来牵拉所述混合组合物,然后随着时间的流逝,使被牵拉的混合组合物和基底上剩余的混合组合物凝固。当在此状态下加热基底时,使得基底上的粘性组合物液化,由此被牵拉的粘性组合物和基底上的粘性组合物分离,从而在每个电极部件上形成包含混合组合物的微针。
同时,如图5所示,也可以通过将混合组合物点在每个电极部件12上,然后使其凝固来形成微针。
此外,电穿孔电极的电极部件在其中混合组合物被涂布在板状基底上的状态下与混合组合物接触。此后,在将基底保持在至少某个使得基底上的混合组合物不凝固的温度下牵拉所述混合组合物时,电穿孔电极一侧的粘性组合物迅速凝固而基底一侧的粘性组合物相对凝固较慢,从而牵拉出越接近基底直径越小的结构。当在此状态下继续牵拉时,凝固的粘性组合物与基底分离,从而在每个电极部件上形成微针。
同时,这样形成的微针的顶部直径为1至100μm,更优选2至50μm,和最优选5至20μm。
此外,微针的有效长度没有特别的限制,所述长度可以根据待输送基因的类型、基因输送位置和进行电穿孔的位置而变化。根据本发明的实施方案,微针的有效长度优选为100至10,000μm,更优选200至10,000μm,更更优选300至8,000μm,和最优选500至2,000μm。
本发明中,微针的“顶部”表示具有最小直径的微针尾部。此外,“微针的有效长度”表示从微针顶部到电极部件的上表面的垂直长度。
在此结构化的电子微针集成体中,将微针和电极部件插入皮肤中,微针在皮肤内降解,由此释放包含于其中的遗传物质(基因)。当对此状态的电穿孔电极施加电力供应时,电场脉冲就会被施加在遗传物质释放的区域中,由此将遗传物质顺利地输送到细胞中。
如上所述,根据本发明的实施方案,遗传物质可以在治疗位置被集中输送,电场脉冲被施加在同一位置上,从而可以提高细胞内基因输送的效率。
对于本领域技术人员来说,显而易见地,可以在不背离本发明精神或范围的情况下,对本发明的上述示例实施方案进行各种改进。由此,本发明将包括所有这些改进,它们均在附属的权利要求及其等同物的范围内。
Claims (7)
1.一种电子微针集成体,包括:
电穿孔电极,所述电穿孔电极与人体皮肤接触施加电场脉冲,包括基础部件和从该基础部件上伸出来的多个电极部件;和一套微针,
每个微针粘着在每个电极部件上并插入人体皮肤内,每个微针包含生物相容性和可生物降解的粘性材料和遗传物质,
其中,每个微针在皮肤内降解,且所述电场脉冲通过电穿孔电极施加在微针插入的位置,使得包含于微针中的遗传物质能够顺利导入细胞中,
其中,通过混合生物相容性和可生物降解的粘性材料和遗传物质成混合组合物制备微针,和通过将液态的混合组合物供给到从该基础部件上伸出来的多个电极部件的每个电极部件上并使其凝固来形成微针。
2.根据权利要求1所述的电子微针集成体,其中,所述生物相容性和可生物降解的粘性材料选自:聚酯、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚α-羟基酸、聚β-羟基酸、聚3-羟基丁酸酯-共-戊酸酯(PHBV)、聚3–羟基丙酸酯(PHP)、聚3-羟基己酸酯(PHH)、聚4-羟基酸、聚4-羟基丁酸酯、聚4-羟基戊酸酯、聚4-羟基己酸酯、聚酯酰胺、聚己内酯、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚二氧杂环己酮、聚原酸酯、聚酐、聚乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷酸酯氨基甲酸酯、聚氨基酸、聚氰基丙烯酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚碳酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚羟基丁酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯醇缩乙醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯醇缩甲醛、氯乙烯-丙烯-乙酸乙烯酯共聚物、氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、苯并呋喃茚聚合物、二丁基氨基羟丙基醚、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甘油二硬脂酸酯、2-甲基-5-乙烯基吡啶甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物、透明质酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、纤维素或其衍生物、麦芽糖、葡聚糖、葡甘露聚糖、葡糖胺、脱乙酰壳多糖、肝素、藻酸盐、菊粉、淀粉、糖原、壳多糖、软骨素、糊精、硫酸角质素、牛脂、鲸蜡、蜂蜡、石蜡和蓖麻蜡。
3.一种权利要求1所述的电子微针集成体的制备方法,包括:
制备包括基础部件和从该基础部件伸出来的多个电极部件的电穿孔电极;
通过混合生物相容性和可生物降解的粘性材料和遗传物质制备混合组合物;和
通过将液态的混合组合物供给到电极部件上并使其凝固来形成微针。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述形成微针包括:
将液态的混合组合物涂布在板状基底上;
使电极部件与所涂布的混合组合物接触;
通过电极部件与基底的相对运动来牵拉混合组合物;和
使被牵拉的混合组合物凝固。
5.根据权利要求4所述的方法,还包括:在使被牵拉的混合组合物凝固之后,通过加热基底使基底一侧的混合组合物液化而使凝固的混合组合物与基底分离。
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述形成微针包括:
将液态的混合组合物点在电极部件上;和
使所点的混合组合物凝固。
7.根据权利要求3所述的方法,其中所述生物相容性和可生物降解的粘性材料选自:聚酯、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚α-羟基酸、聚β-羟基酸、聚3-羟基丁酸酯-共-戊酸酯(PHBV)、聚3–羟基丙酸酯(PHP)、聚3-羟基己酸酯(PHH)、聚4-羟基酸、聚4-羟基丁酸酯、聚4-羟基戊酸酯、聚4-羟基己酸酯、聚酯酰胺、聚己内酯、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚二氧杂环己酮、聚原酸酯、聚酐、聚乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷酸酯氨基甲酸酯、聚氨基酸、聚氰基丙烯酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚酪氨酸碳酸酯、聚碳酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚羟基丁酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯醇缩乙醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯醇缩甲醛、氯乙烯-丙烯-乙酸乙烯酯共聚物、氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、苯并呋喃茚聚合物、二丁基氨基羟丙基醚、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甘油二硬脂酸酯、2-甲基-5-乙烯基吡啶甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物、透明质酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、纤维素或其衍生物、麦芽糖、葡聚糖、葡甘露聚糖、葡糖胺、脱乙酰壳多糖、肝素、藻酸盐、菊粉、淀粉、糖原、壳多糖、软骨素、糊精、硫酸角质素、牛脂、鲸蜡、蜂蜡、石蜡和蓖麻蜡。
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