CN103823007B - 固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法。所述方法首先利用可拆卸式固相微萃取探针对待测样品进行萃取，再用N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）对萃取物进行衍生，最后利用气相色谱-质谱联用仪进行分析测定，并用外标法定量。该方法绿色环保、操作简便且省时省力，检测时间仅仅为90分钟，样品前处理成本低于1元，可以非常方便地应用于各种不同样品中盐酸克伦特罗的快速筛查，具有很好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及农产品质量检测领域。更具体地，涉及一种固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法。
背景技术
盐酸克伦特罗为一种人工合成的兴奋剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时，具有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此在中国俗称为“瘦肉精”。由于盐酸克伦特罗有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的效果，目前被应用于畜牧业作为瘦肉精使用。但是盐酸克伦特罗对人类的健康有严重的影响，因此盐酸克伦特罗的检测对畜牧农产品的质量监控至关重要。
目前，我国公布的盐酸克伦特罗检测技术标准中样品前处理方法主要以固相萃取、液液萃取为主，分离分析方法主要以色谱质谱联用技术、酶联免疫技术为主。这些标准检测法检出限低，结果准确，但是样品前处理方法耗时长，成本高，极大地阻碍了瘦肉精普查的进行。
另外，近年来各国政府对环境的关注度日益提高，大力倡导“绿色GDP”、“环境的可持续发展”等理念，在此背景下，标准法中大量有机溶剂的使用日益凸显其对环境的不友好性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有盐酸克伦特罗标准检测法样品前处理方法耗时长、成本高、大量有机溶剂对环境不友好等技术不足，提供一种快速、准确、环保、低成本的检测盐酸克伦特罗的方法。
本发明的目的在于提供一种利用固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法，包括如下步骤：
S1.将待测样品洗净绞碎后，将可拆卸式固相微萃取探针插入绞碎后的待测样品中，室温静置萃取10～120min；
S2.萃取后的探针插入装有N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺的密封瓶中，在30～100℃下顶空衍生10～60min；
S3.衍生结束后直接进样，解析2～12min，利用气相色谱-质谱联用技术测定待测样品中的盐酸克伦特罗，并用外标法定量。
优选地，S1所述室温静置萃取的时间为45min。
优选地，S2所述顶空衍生的条件为50℃下顶空衍生30min。
优选地，S3所述解析的时间为5min。
所述可拆卸式固相微萃取探针优选为申请号为201010224148.5所述的萃取头可拆卸式固相微萃取探针。
为了使萃取效果达到最优，每次使用前，需将可拆卸式固相微萃取探针插入固相微萃取套管中老化10min。
萃取时间和顶空衍生的条件(包括温度和时间)对本发明至关重要，原因在于：如萃取时间不像一股意义上的那么简单，其实要比想象的更复杂，虽然萃取时间直接涉及到萃取效率和浓度的关系，但是他们的关系未必一定是成正比的，本发明经过大量的研究和探索，发现在一定范围内随着萃取时间的延长，萃取峰面积不断增加，之后随着萃取时间的延长反而下降，但是下降到一定程度后，却又有一定幅度的上升，因此萃取时间和顶空衍生的条件对检测结果的影响是未知的，更是不可预测的。并且，萃取时间、顶空衍生的时间和温度各单因素并不是单独起作用的，而是相互影响、相互制衡的。
正如发明人实验发现，根据单因素优选实验得出的最优的萃取时间为60min；最优的衍生条件为50℃顶空衍生36min；最优的解析时间为5min。但是在研究的过程中发现这并不是最优的工艺条件。发明人经过大量的研究和探索，得出一种最优的检测工艺，如下：将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取45min，萃取后的探针插入装有MTBSTFA的密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，解析5min，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。
优选地，S3所述利用气相色谱质谱联用技术测定的条件如下：
气相色谱条件：色谱柱为Agilent公司的AgilentHP-5MS气相毛细管柱(19091S-433)，30m×0.25mm×0.25μm；载气为氦气，纯度≥99.999％；采用不分流进样，进样口温度250℃，柱流速1.2mL/min；GC/MS总运行时间为12.83min，升温程序如下：
S1.初始温度设定值为80℃，保持时间0min；
S2.梯度1：升温速率为30℃/min，温度设定值为220℃，保持时间0min；
S3.梯度2：升温速率为5℃/min，温度设定值为245℃，保持时间0min；
S4.梯度3：升温速率为30℃/min，温度设定值为280℃，保持时间2min；
质谱条件：离子源为EI源；电离能量70eV；离子源温度200℃；四极杆温度150℃；接口温度230℃；溶剂延迟4min，扫描质量范围50～650amu；
分析物为盐酸克伦特罗N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺衍生物，定性离子为86，187，243，277，304；定量离子为86。
本发明还提供了上述方法在检测猪肉中的盐酸克伦特罗方面的应用。
本发明所述固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法，经方法学验证结果表明，对猪肉中盐酸克伦特罗的检测范围为50～1000μg/kg，且线性良好，线性相关系数(R2)为0.9946，检出限为29μg/kg，相对标准偏差均小于26％，方法稳定，重现性好，且回收率为79.3～120.0％。
该方法环保、快速、准确、成本低，检测时间仅仅为90分钟，不仅仅适用于猪肉中盐酸克伦特罗的检测，也可以非常方便地应用于各种不同样品中盐酸克伦特罗的快速筛查，具有很好的推广应用价值。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了提供了一种利用可拆卸式固相微萃取探针检测盐酸克伦特罗的方法，即固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法，该方法采用固相微萃取技术对样品进行前处理，是一种集采样、分离、富集于一体的新型绿色环保的样品前处理技术，所用可拆卸式固相微萃取探针的成本低于1元/支，使用简单方便，一次性使用防止污染，且易于与色谱分析仪联用，可用不同的定量方法进行结果的定量分析。
该方法单样品全检测时间仅需要90分钟即可完成，对猪肉中盐酸克伦特罗的检测范围为50～1000μg/kg，且线性良好，线性相关系数(R2)为0.9946，检出限为29μg/kg，相对标准偏差均小于26％，方法稳定，重现性好，且回收率为79.3～120.0％。
本发明所述方法具有操作简单方便、快速、准确、无需大量化学试剂、绿色环保、省时省力等优点，且所需仪器设备少、成本低、效率高，克服了传统方法操作复杂繁琐、费用昂贵等缺点，不仅仅适用于猪肉中盐酸克伦特罗的检测，也可以非常方便地应用于各种不同样品中盐酸克伦特罗的快速筛查，在食品安全监测方面具有很大的推广应用价值。
附图说明
图1为本发明所制备的可拆卸式固相微萃取探针的示意图。
图2为本发明所述方法的检测标准曲线。
图3为萃取时间优化曲线图。
图4为衍生化时间优化曲线图。
图5为衍生化温度优化曲线图。
图6为解析时间优化曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规试剂、设备和方法。除非特别说明，实施例所用材料和试剂均为市购。
实施例1可拆卸式固相微萃取(SPME)探针的制备
本发明所述可拆卸式固相微萃取(SPME)探针的制备方法如下：
S1.将不锈钢丝剪成3～4cm的一段，聚二甲基硅氧烷(PDMS)管剪成1cm的一段；
S2.将S1裁剪好的不锈钢丝依次用超纯水、丙酮进行超声清洗10min，晾干备用；
S3.取等量高温环氧树脂胶的A胶与B胶，混匀，将混匀胶薄而均匀的涂在处理后的不锈钢丝表面，然后套上裁剪好的1cm聚二甲基硅氧烷(PDMS)管，室温下让胶水自然固化，得到萃取涂层；
S4.将萃取涂层置于250℃下，氮气流中老化30min，除去萃取涂层上的杂质，即得到可拆卸式固相微萃取探针，保存备用。
另外，每次使用前，需将可拆卸式固相微萃取探针插入固相微萃取套管中老化10min。
本实施例制备得到可拆卸式固相微萃取(SPME)探针的成本低于1元/支。所制备的SPME探针示意图如附图1所示。
实施例2盐酸克伦特罗衍生物标准溶液GC-MS进样实验
1、盐酸克伦特罗标准溶液的制备
S1.称量盐酸克伦特罗0.010g于20mL棕色瓶中，用甲醇稀释至瓶上的刻度、摇匀，制成500mg/L的储备液，4℃冷藏保存；
S2.量取适量S1所得储备液于500mL容量瓶中，用甲醇稀释，配制成浓度为2000μg/L、1600μg/L、1000μg/L的标准溶液，4℃冷藏保存；
S3.分别量取1mL的S2所得2000μg/L、1000μg/L标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释，配制成浓度为200μg/L、100μg/L的标准溶液，4℃冷藏保存。
2、盐酸克伦特罗衍生物标准溶液制备
S1.取1mL上述1000μg/L盐酸克伦特罗标准溶液于色谱小瓶中，常温下用微弱的氮气流吹干，迅速加入50μL衍生化试剂N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)，并盖紧色谱盖，涡旋30s混匀，75℃下恒温衍生90min；
S2.衍生后取出涡旋30s，氮气流下浓缩至干，准确加入1mL正己烷，涡旋振荡2min至充分混匀，制备得1000μg/L盐酸克伦特罗衍生物标准溶液，用于GC-MS直接进样。将盐酸克伦特罗衍生物标准溶液直接进样的目的是确定分析物(即盐酸克伦特罗衍生物)在色谱图中的出峰位置。
3、盐酸克伦特罗衍生物标准溶液GC-MS直接进样检测的色谱、质谱条件
(1)色谱条件：
色谱柱：AgilentHP-5MS气相毛细管柱(19091S-433)，30m×0.25mm×0.25μm；载气：氦气(纯度≥99.999％)；气相色谱条件：不分流进样，进样口温度：250℃，柱流速：1.2mL/min。GC/MS总运行时间：12.83min。升温程序如表1所示：
表1
(2)质谱条件：
离子源：EI源；电离能量：70eV；离子源温度：200℃；四极杆温度：150℃；接口温度：230℃；溶剂延迟：4min，扫描质量范围：50～650amu。
分析物为盐酸克伦特罗N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺衍生物，定性离子为：86，187，243，277，304；定量离子为：86。
实施例3检测条件优化实验
1、实验材料
(1)材料：购买新鲜空白的瘦猪肉，用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
(2)加标猪肉：分别称取2.00g绞碎的空白猪肉样品于10mL的样品瓶中，加入100μL浓度为200μg/L的盐酸克伦特罗标准溶液，配制成浓度为100μg/kg的加标猪肉。
2、萃取时间优化实验
上述准备的100μg/kg的加标猪肉设置多个重复，将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，分别室温静置萃取不同的时间，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，解析8min，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。色谱、质谱条件同实施例2。
根据测定结果制作成曲线，截取最优结果相关的一段，如附图3所示，峰面积随着萃取时间的延长而升高，60min时达到最大值，之后随着时间的延长峰面积反而有所下降，因此，本发明所述检测猪肉中盐酸克伦特罗方法的最优的萃取时间是60min。
3、衍生化时间优化实验
上述准备的100μg/kg的加标猪肉设置多个重复，将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取60min，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，在50℃的条件下，分别顶空衍生不同的时间，衍生结束后直接进样，解析5min，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。色谱、质谱条件同实施例2。
根据测定结果制作成曲线，如附图4所示，峰面积随着衍生化时间的延长而升高，36min时达到最大值，之后随着时间的延长峰面积一直保持稳定不再增加，因此，本发明所述检测猪肉中盐酸克伦特罗方法的最优衍生化时间为36min。
4、衍生化温度优化实验
上述准备的100μg/kg的加标猪肉设置多个重复，将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取60min，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，分别在不同温度条件下，顶空衍生36min，衍生结束后直接进样，解析5min，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。色谱、质谱条件同实施例2。
根据测定结果制作成曲线，截取最优结果相关的一段，如附图5所示，峰面积随着衍生化温度的上升而上升，50℃时达到最大值，之后随着温度的继续升高反而有所下降，因此，本发明所述检测猪肉中盐酸克伦特罗方法的最优衍生化温度为50℃。
5、解析时间优化实验
上述准备的100μg/kg的加标猪肉设置多个重复，将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取60min，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，在50℃条件下，顶空衍生36min，衍生结束后直接进样，解析不同的时间，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。色谱、质谱条件同实施例2。
根据测定结果制作成曲线，截取最优结果相关的一段，如附图6所示，峰面积随着解析时间的延长而增加，解析时间为5mim时达到最大值，之后随着解析时间的延长反而有所下降，因此，本发明所述检测猪肉中盐酸克伦特罗方法的最优解析时间为5min。
6、最优检测工艺条件的确定
根据上述单因素优化实验所得，最优的萃取时间为60min；最优的衍生条件为50℃顶空衍生36min；最优的解析时间为5min。
但是在研究过程中，发明人发现各条件因素之间并不是单独起作用的，而是相互影响、相互制衡的。发明人经过大量的研究和探索，得出一种最优的检测工艺，如下：
将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取45min，萃取后的探针插入装有MTBSTFA的密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，解析5min，利用气相色谱-质谱联用技术测定盐酸克伦特罗，并用外标法定量。
实施例4检测方法重现性实验
1、实验材料
(1)材料：购买新鲜空白的瘦猪肉，用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
(2)加标猪肉：分别称取2.00g绞碎的空白猪肉样品于6个10mL样品瓶中，分别加入100μL浓度为200μg/L的盐酸克伦特罗标准溶液，配制成浓度为100μg/kg的加标猪肉。
(3)将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取45min，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，用GC-MS分析测定，色谱、质谱条件同实施例2。结果如表2所示，相对标准偏差仅为18.78％，表明本发明的检测方法重现性很好。
表2加标猪肉的方法重现性实验数据
实施例5检测加标猪肉中盐酸克伦特罗的标准曲线
1、材料：购买新鲜空白的瘦猪肉，用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
2、加标猪肉：分别称取2.00g绞碎的空白猪肉样品于5个10mL样品瓶中，分别加入100μL浓度为100、200、1000、1600、2000(单位为μg/L)的盐酸克伦特罗标准溶液，配制成一系列浓度的加标猪肉，浓度依次为：50，100，500，800，1000(单位为μg/kg)。
3、标准曲线制作：将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入加标猪肉中，室温静置萃取45min，萃取后的探针插入装有50μLMTBSTFA的10mL密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，用GC-MS分析测定，色谱、质谱条件同实施例2。实验重复三次。测定结果如表3所示。
将测定一系列不同浓度盐酸克伦特罗加标猪肉得到的色谱峰面积，对盐酸克伦特罗浓度作图，得到标准曲线，如附图2所示。该曲线的线性相关系数为0.9946。
表3不同浓度检测线性范围实验数据
如表3数据所示，本发明所述可拆卸式固相微萃取探针对猪肉中盐酸克伦特罗的检测在50～1000μg/kg的检测范围内，检测效果都很好。
另外，重复实验3次，盐酸克伦特罗浓度分别为50、100、500、800、1000μg/kg加标猪肉的相对标准偏差分别为25.39％、23.59％、11.35％、16.67％、10.54％，也表明了本发明检测方法的稳定性及重现性较好。
实施例6检出限实验
1、空白猪肉的测定
(1)材料：购买新鲜空白的瘦猪肉，用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
(2)空白猪肉的测定：分别称取2.00g绞碎的空白猪肉样品于9个10mL样品瓶中，各加入100μL甲醇，测定空白猪肉峰面积。
表4对照组猪肉测定数据表
2、检出限的确定，将表4中的平均值数据代入实施例5得到的标准曲线，计算得出的浓度值即为本方法的检出限，为29μg/kg。
实施例7新鲜猪肉中盐酸克伦特罗的检测
1、材料
(1)按照实施例1所述方法制备得到的可拆卸式固相微萃取(SPME)探针。
(2)新鲜购买的瘦猪肉(购于广州市海珠区滨江东路百佳超市，一号土猪，产自广东)。
2、检测方法如下：
S1.将新鲜购买的瘦猪肉用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
S2.称取2.00g绞碎的猪肉样品于10mL样品瓶中，将新制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入绞碎的猪肉中，室温静置萃取45min。
S3.萃取后的探针插入装有50μLN-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)的10mL密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min。
S4.衍生结束后直接进样，用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析测定，并用外标法定量。
其中，S4所述色谱、质谱的条件同实施例2。
3、检测结果：实验结果表明，购买的猪肉未检出盐酸克伦特罗。
实施例8新鲜猪肉中盐酸克伦特罗的检测
1、材料
(1)按照实施例1所述方法制备得到的可拆卸式固相微萃取(SPME)探针。
(2)新鲜购买的瘦猪肉(购于广州市海珠区滨江东路百佳超市，优级猪肉，产自广西)。
2、检测方法同实施例7。
3、检测结果
实验结果表明，购买的猪肉未检出盐酸克伦特罗。
实施例9加标猪肉中盐酸克伦特罗回收率实验
1、材料：将新鲜购买的瘦猪肉(购于广州市海珠区滨江东路百佳超市，优级猪肉，产自广西)用自来水冲洗干净表面后用搅拌器充分绞碎。
该猪肉经实施例8未检出盐酸克伦特罗。
2、加标猪肉：分别称取2.00g绞碎的猪肉样品于9个10mL样品瓶中，分别加入100μL浓度为200、1000、1600(单位为μg/L)的盐酸克伦特罗标准溶液，拌匀，配制成一系列浓度的加标猪肉，浓度依次为：100，500，800(单位为μg/kg)。
3、检测方法
将制备并老化好的可拆卸式固相微萃取探针插入上述加标猪肉中，室温静置萃取45min，萃取后的探针插入装有50μLN-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)的10mL密封样品瓶中，50℃顶空衍生30min，衍生结束后直接进样，用GC-MS分析测定。色谱、质谱条件同前所述。每个处理重复实验3次。将测得的峰面积取平均值，代入标准曲线，得到的浓度值与加标浓度作比较，可以算出回收率。结果如表5所示。
表5不同浓度下盐酸克伦特罗加标回收率测定
如表5所示，所得回收率在79.3～120.0％，方法回收率较好。且重复实验3次，盐酸克伦特罗浓度分别为100、500、800μg/kg加标猪肉的相对标准偏差分别为14.0％、1.6％、8.6％。表明本发明所述可拆卸式固相微萃取探针稳定性、重现性好。
综上所述，本发明所述的固相微萃取与气相色谱质谱联用技术能够快速检测猪肉中盐酸克伦特罗。集采样、分离、富集于一体，具有操作简单方便，绿色环保的特点，可解决传统方法操作复杂、繁琐的缺点；所需仪器设备少、成本低、效率高，可解决传统方法费用昂贵的缺点。单样品全检测时间仅90分钟，所用探针成本低于1元/支，一次性使用防止污染，利于推广，可用于猪肉中盐酸克伦特罗的检测，可推广用于其他样品中的盐酸克伦特罗的检测，在实际食品安全监测中潜力巨大。
Claims (2)
1.一种固相微萃取与气相色谱质谱联用技术快速检测盐酸克伦特罗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将待测样品猪肉洗净绞碎后，将可拆卸式固相微萃取探针插入绞碎后的猪肉中，室温静置萃取45min；
S2.萃取后的探针插入装有N-特丁基二甲基硅烷-N-甲基三氟乙酰胺的密封瓶中，在50℃下顶空衍生30min；
S3.衍生结束后直接进样，解析5min，利用气相色谱-质谱联用技术测定猪肉中的盐酸克伦特罗，并用外标法定量；
其中，步骤S1所述可拆卸式固相微萃取探针的制备方法如下：
S11.将剪好的3～4cm不锈钢丝依次用超纯水、丙酮进行超声清洗，晾干备用；
S12.将高温环氧树脂胶涂在S11处理后的不锈钢丝表面，然后套上裁剪好的1cm长的聚二甲基硅氧烷管，胶水自然固化后得到萃取涂层；
S13.将萃取涂层置于250℃下，氮气流中老化30min，除去萃取涂层上的杂质，保存备用；
S14.每次使用前，需将S13处理后的萃取涂层插入固相微萃取套管中老化10min。
2.权利要求1所述方法在检测猪肉中的盐酸克伦特罗中的应用。
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