CN103816149A - 细胞松驰素化合物cytochalasin H在制备抗帕金森病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞松驰素化合物cytochalasin H在药学上的新应用，具体涉及的是cytochalasin H在制备抗帕金森病的神经保护性药物方面的用途。本发明经一系列体外试验证明，细胞松弛素化合物cytochalasin H对MPP⁺诱导的PC12细胞损伤具有显著保护作用，可用于开发抗帕金森病药物。

Description

细胞松驰素化合物cytochalasin H在制备抗帕金森病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物——细胞松驰素化合物cytochalasin H在药学上的新应用，具体涉及的是cytochalasin H在制备抗帕金森病的神经保护性药物方面的用途。 

背景技术

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，临床症状主要表现为肢体静止性震颤、行动迟缓、肌肉僵直、步态异常和姿势不稳，这是由黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）神经通路渐进性和选择性缺失所引起。目前临床治疗主要采用多巴胺类药物如左旋多巴，这些药物只能在发病初期缓解症状，而无力缓解PD的基本进程和渐进性DA神经元的丧失。随着用药时间的延长，药效逐渐下降，且常出现严重的毒副作用，严重影响病人的顺从性和生活质量。因此，临床治疗急需疗效高、副作用小，能真正阻止自然病程的神经保护性药物。 

帕金森病以纹状体多巴胺能神经元变性为病理特征，其病因及发病机制近年来取得较大研究进展。多数学者认为它是遗传多态性和易感性与环境因素共同作用的结果。遗传因素是发病的背景基础，而环境毒素则为诱发因素。两者共同作用启动或促发了氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白水解应激和免疫异常等多种机制，最终通过多种级联反应导致多巴胺能神经细胞死亡。氧化应激和活性氧（ROS）的毒性损伤作用是主要原因，细胞凋亡是细胞死亡的主要方式。随着PD细胞凋亡机制研究的深入，PD治疗思路也拓展到保护黑质神经元和防止细胞凋亡等方面，对细胞凋亡的负调控（阻止凋亡发生的调控）可应用于神经退行性病变的预防和治疗。帕金森病药物治疗开始由直接补充多巴胺转向多环节治疗，重点集中于对多巴胺能神经元的保护作用（如对抗神经元氧化应激、对抗细胞凋亡等），寻找安全有效的药物来保护黑质神经元和防止细胞凋亡已成为抗帕金森病新药研制的发展趋势。 

研究已发现一些天然产物具有神经保护活性。Surh等发现白藜芦醇Resveratrol对H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡有保护作用。Resveratrol能消减H₂O₂产生的细胞毒性、DNA降解和胞内ROS的积累，并缓解H₂O₂诱导的PC12细胞NF-κB活化，从而阻止氧化应激引起的细胞死亡。 

细胞松驰素化合物cytochalasin H具有多种生理生化活性，但目前尚未发现cytochalasin H在抗帕金森病的神经保护性药物方面的应用。本发明揭示cytochalasin H对体外培养的甲基苯基吡啶离子（MPP⁺）诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，能阻止其凋亡，其可能机制与减少细胞内活性氧（ROS）有关。cytochalasin H具有良好的神经细胞保护活性，极具研究开发潜力。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：揭示细胞松驰素化合物cytochalasin H的新用途，即cytochalasin H应用于抗帕金森病的神经保护性药物的制备。 

cytochalasin H的化学结构式如下： 

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案： 

cytochalasin H具有对甲基苯基吡啶离子（MPP⁺）诱导的PC12细胞损伤的保护作用。 

cytochalasin H在制备抗帕金森病的神经保护性药物中的应用。 

MPP⁺是神经毒素MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）的活性形式，它能选择性破坏黑质多巴胺能神经元，引起与人类帕金森病极为相似的病理、生化和症状改变，被广泛用于制备帕金森病细胞模型和动物模型。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，与中脑多巴胺能神经元有许多相似的特征。研究证实MPP⁺诱导的PC12细胞损伤模型是探索帕金森病发病机制及筛选神经保护性药物的良好模型。 

本发明经一系列体外试验证明，细胞松弛素化合物cytochalasin H对MPP⁺诱导的PC12细胞损伤具有显著保护作用，可用于开发抗帕金森病药物。本发明具有如下优点： 

①cytochalasin H不仅有预防而且有修复和治疗MPP⁺损伤细胞的作用； 

②cytochalasin H能预防、减轻或对抗MPP⁺诱导的乳酸脱氢酶（LDH）的释放，对MPP⁺诱导的PC12细胞损伤有预防和治疗作用； 

③cytochalasin H能改善MPP⁺诱导的PC12细胞超微结构的变化； 

④cytochalasin H对MPP^＋诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用，能显著降低细胞凋亡率； 

⑤cytochalasin H能显著抑制MPP⁺升高ROS含量的作用，具有一定的剂量依赖性。 

⑥有效药物浓度低，与临床抗帕金森病药物司来吉兰相比，cytochalasin H对MPP^＋诱导的PC12细胞凋亡保护作用更强（效价强度强），应用前景广阔。 

附图说明

图1：MPP⁺抑制PC12细胞存活率的量效和时效关系。 

图2：cytochalasin H三种干预方法对MPP⁺诱导的乳酸脱氢酶（LDH）释放的影响（n=3）。A：预处理；B：后干预；C：同时干预。^###P<0.001与对照组比较；^**P<0.01，^***P<0.001与模型组比较。 

图3：透射电镜下各组细胞形态（48h）。 

图4：AO/EB染色荧光倒置显微镜下各组细胞形态（×400倍，48h） 

A：对照组；B：模型组；C：阳性药物组；D：药物低剂量组；E：药物中剂量组；F：药物高剂量 组。 

具体实施方式

实施例1.MPP⁺复制PD细胞模型量效和时效关系 

实验仪器与材料： 

PB11OS电子天平（德国赛多利斯公司）； 

SW-CJ-1F型超净台（苏州净化设备有限公司）； 

Forma3111水套式二氧化碳培养箱（Thermo/美国）； 

ELX-800UV酶标仪（美国BIO-TEK公司）； 

大鼠嗜铬细胞瘤PCl2细胞（中国科学院上海生命科学研究院）； 

新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）； 

DMEM（GIBCO公司）； 

MPP⁺（SIGMA-Aldrich公司）； 

MTT（AMROSCO公司）； 

DMSO（AMROSCO公司）。 

实验方法： 

将PC12细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养基培养，置于CO₂培养箱（37℃，5%的CO₂，相对湿度为95%），3-4天传代一次。取对数生长期细胞配成单细胞悬液，以5×10⁴/m1接种于96孔培养板。连续培养24小时后换液，在每孔中分别加入不同浓度的MPP⁺溶液，使其终浓度分别为100，200，300，400，500μmol/L，各做6个复孔。再继续培养12h，24h，48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃孵育4小时。终止培养后小心吸空培养基，每孔加入150μl DMSO，振荡15分钟，使结晶充分溶解。酶标仪检测每孔在490nm处吸收值（OD值）（参考波长630nm），计算细胞存活率%=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。以细胞存活率为指标，确定MPP⁺造模的最佳浓度和作用时间。 

实验结果： 

从图1可看出，MPP⁺抑制细胞存活率呈浓度和时间依赖性，500μmol/L MPP⁺作用48h时，细胞存活率为60%左右，选定为后面实验中的造模条件。 

实施例2.cytochalasin H对MPP⁺诱导的PC12细胞损伤的影响 

实验仪器与材料： 

PB11OS电子天平（德国赛多利斯公司）； 

SW-CJ-1F型超净台（苏州净化设备有限公司）； 

Forma3111水套式二氧化碳培养箱（Thermo/美国）； 

ELX-800UV酶标仪（美国BIO-TEK公司）； 

大鼠嗜铬细胞瘤PCl2细胞（中国科学院上海生命科学研究院）； 

cytochalasin H（可以从Santa Cruz Biotechnology或Sigma-Aldrich购买；也可以从青皮内生菌Phomopsis sp.IFB-E060（GenBank号：GU989315）固体发酵产物中分离得到，内生菌株IFB-E060的分离、鉴定及发 酵和化合物的提取分离及结构鉴定可参照文献【Xu S,et al.Chem Biodivers2009,6(5):739-745】进行）； 

新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）； 

DMEM（GIBCO公司）； 

MPP⁺（SIGMA-Aldrich公司）； 

R-(-)-Deprenyl·HCl（司来吉兰，Enzo Life Sciences，Inc.公司）； 

MTT（AMROSCO公司）； 

DMSO（AMROSCO公司）； 

LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所） 

实验方法： 

1、MTT（四氮唑盐）比色法测定细胞存活率 

同上细胞培养，按照下列分组和加药方法加入药物：（1）对照组：0.01%DMSO溶剂；（2）模型组：500μmol/L MPP⁺；（3）阳性药物组：100μmol/L司来吉兰；（4）受试药物组。采用3种加药方法：①预处理：药物预处理4h后加入MPP⁺；②后干预：MPP⁺作用4h后再加药；③同时干预：药物与MPP⁺同时加入。各组MPP⁺作用时间均持续48h。培养结束后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，同上处理，测定每孔OD值，计算细胞存活率。每组6个复孔，各3个平行板。 

2、乳酸脱氢酶（LDH）释放的测定 

细胞同上处理后，分别收集培养液上清和贴壁活细胞，用1%～2%的曲拉通裂解细胞，分3份冻存备用。测定时按照LDH试剂盒操作。释放率%=上清液中LDH活性/培养液中总LDH活性×100。 

3、统计学分析 

数据以均数±标准差（

）表示，用SPSS10.0软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析和Dunnett检验。P<0.05为有统计学意义。 

实验结果： 

1、对细胞存活率的影响 

由表1可看出，cytochalasin H预处理在0.001～0.1μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升；药物后干预（0.01～0.15μmol/L）以及同时干预（0.01～0.2μmol/L）亦呈类似效果。表明cytochalasin H不仅有预防而且有修复和治疗MPP⁺损伤细胞的作用。 

表1 cytochalasin H不同给药方式对MPP⁺诱导的PC12细胞存活率的影响（

n=3） 

^###P<0.001与对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001与模型组比较 

2、对乳酸脱氢酶（LDH）释放的影响 

从图2可看出，模型组LDH释放率较高，而cytochalasin H三种干预方法均能使LDH释放率下降，高剂量组与阳性药物组之间没有显著性差异（P>0.05）。表明cytochalasin H能预防、减轻或对抗MPP⁺诱导的LDH的释放。 

实施例3.cytochalasin H对MPP⁺诱导PC12细胞凋亡的影响 

实验仪器与材料： 

PB11OS电子天平（德国赛多利斯公司）； 

SW-CJ-1F型超净台（苏州净化设备有限公司）； 

OPTIPHOT-2荧光显微镜（日本NIKON公司）； 

XDS-1B倒置生物显微镜（重庆光学仪器有限公司）； 

Forma3111水套式二氧化碳培养箱（Thermo/美国）； 

流式细胞仪（FACSAria，美国BD）； 

大鼠嗜铬细胞瘤PCl2细胞（中国科学院上海生命科学研究院）； 

cytochalasin H（同实施例2）； 

DMSO（AMROSCO公司）； 

新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）； 

DMEM（GIBCO公司）； 

MPP⁺（SIGMA-Aldrich公司）； 

R-(-)-Deprenyl·HCl（Enzo Life Sciences，Inc.公司）； 

AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡试剂盒（南京建成生物工程研究所）； 

荧光染色试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。 

透射电镜样品制备用试剂由扬州大学测试中心提供。 

实验方法 

1、透射电镜观察细胞超微结构 

药物与MPP⁺一起加入细胞中，培养48h后收集细胞，离心，2.5%戊二醛固定2h以上，PBS清洗3～4次，1%四氧化二锇染色后固定2h，PBS清洗3～4次，乙醇梯度洗脱后用丙酮树脂浸透，纯树脂包埋法制样，聚合，制作超薄切片，透射电镜观察PC12细胞超微结构。 

2、AO/EB荧光染色观察细胞形态 

药物处理同上，48h后用冰PBS洗涤细胞两次，加入PBS1ml，将吖啶橙（AO，100μg/ml）及溴化乙锭（EB，100μg/ml）等体积混匀，吸取5μl的混和染液，5～10min后于荧光显微镜下观察。 

3、流式细胞仪分析PC12细胞凋亡比率 

PC12细胞以2×10⁵/ml接种于培养瓶中，细胞进入对数生长期后加入cytochalasin H低、中、高三个浓度，然后加入MPP⁺，使其终浓度为500μmol/l，37℃、5%CO₂培养24h后收集细胞，按Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒操作，上机检测并分析结果。 

4、统计学分析 

数据以均数±标准差（）表示，用SPSS10.0软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析和Dunnett检验。P<0.05为有统计学意义。 

实验结果： 

1、透射电子显微镜下观察细胞凋亡 

细胞电镜结果（图3）显示，正常的PC12细胞表面的微绒毛丰富，细胞核位于细胞中部，椭圆形或圆形，细胞核膜双层结构清晰，核仁明显，常染色质丰富且分布相对均匀；细胞质内可见正常的线粒体，内质网和溶酶体等细胞器。MPP⁺作用后可见细胞发生凋亡的形态学改变：细胞表面的微绒毛减少或者消失；细胞核膜皱缩，细胞核体积缩小；染色质致密并凝聚成块状聚于细胞核周边；细胞质中可见线粒体明显肿胀，甚至产生空泡状改变。 

经过低、中、高剂量（0.05，0.1，0.2μmol/L）的cytochalasin H干预，与模型组相比，细胞的超微结构趋于正常，细胞核膜清晰，核内染色质相对正常，细胞质中可见正常完整的细胞器，尤其高剂量组与正常组最为接近。结果表明cytochalasin H各剂量组能够部分改善PC12细胞的变化，减少细胞器的丢失。提示cytochalasin H能改善MPP⁺诱导的PC12细胞超微结构的变化。 

2、荧光双染法观察细胞凋亡 

从图4可以看出，正常组细胞大多呈长梭形，核质体被均匀染成绿色，部分细胞荧光强度变暗；模型组细胞大多呈椭圆形，核质体被均匀染成橙色或亮黄色；阳性药物组以及药物各剂量组（0.05，0.1，0.2μmol/L）均能明显改善这一现象，其中高剂量组作用最明显，效果接近于司来吉兰阳性组，该结果表明cytochalasin H对MPP⁺诱导的PC12细胞凋亡有一定的保护作用。 

3、流式细胞仪分析PC12细胞凋亡比率 

由表2可以看出，模型组早期凋亡细胞（P<0.05）、晚期凋亡和坏死细胞（P<0.01）以及总凋亡率（P<0.001）均呈显著增加；药物各剂量组与模型组相比，总凋亡率显著下降（P<0.001）。结果表明cytochalasin H能降低MPP^＋诱导的PC12细胞的凋亡率。 

表2.cytochalasin H对MPP^＋诱导PC12细胞凋亡的影响（

n=3） 

^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001与对照组比较；^*P<0.05，^***P<0.001与模型组比较。 

实施例4.cytochalasin H对细胞内ROS含量的影响 

实验仪器与材料： 

PB11OS电子天平（德国赛多利斯公司）； 

SW-CJ-1F型超净台（苏州净化设备有限公司）； 

XDS-1B倒置生物显微镜（重庆光学仪器有限公司）； 

Forma3111水套式二氧化碳培养箱（Thermo/美国）； 

流式细胞仪（FACSAria，美国BD）； 

大鼠嗜铬细胞瘤PCl2细胞（中国科学院上海生命科学研究院）； 

cytochalasin H（同实施例2）； 

DMSO（AMROSCO公司）； 

新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）； 

DMEM（GIBCO公司）； 

MPP⁺（SIGMA-Aldrich公司）； 

R-(-)-Deprenyl·HCl（Enzo Life Sciences，Inc.公司）； 

活性氧（ROS）测试盒（南京建成生物工程研究所）； 

实验方法 

1、细胞培养同实施例3，24h后用冰PBS缓冲液轻轻漂洗1次，加入10μmol/L2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），37℃细胞培养箱内孵育30分钟，每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。收集细胞，1500rpm离心5分钟，弃上清取沉淀，冰PBS缓冲液漂洗2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。4℃放置2小时后流式细胞仪测定DCF的平均荧光强度。 

2、统计学分析 

数据以均数±标准差（

）表示，用SPSS10.0软件进行统计学处理，组间差异采用方差分析和Dunnett检验。P<0.05为有统计学意义。 

实验结果： 

从表3中可以看出500μmol/L MPP⁺可使细胞内ROS比值极显著升高（P<0.001）。0.1μmol/L和0.2μmol/Lcytochalasin H能显著抑制MPP⁺升高ROS比值的作用（P<0.05），有一定的剂量依赖性。提示cytochalasin H可能是通过减少细胞内活性氧（ROS）来抑制细胞凋亡的。 

表3.cytochalasin H对MPP^＋诱导的PC12细胞内ROS含量的影响（n=3） 

^###P<0.001与对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型组比较。 

Claims (2)

1.细胞松驰素化合物cytochalasin H在制备抗帕金森病药物中的应用。

2.细胞松驰素化合物cytochalasin H在制备预防治疗MPP⁺损伤细胞药物中的应用。

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