CN103814958B - 硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用和黑胫病制剂的制备方法，首先将硬骨藤粉碎，过200目筛，按料液重量比1∶3加入甲醇，浸提3次，每次浸提时间为7-10天，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，得到硬骨藤提取物，取提取物100g，用95％浓度乙醇1000ml溶解，制成浓度为100mg／ml的硬骨藤抗黑胫病剂，放入-20℃冰箱内保存备用。本发明的有益效果是硬骨藤植物制剂在抗烟草黑胫病中高效、低毒且不会污染环境。

Description

硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用及制备方法

技术领域

本发明属于生物杀菌技术领域，涉及硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用及制备方法。

背景技术

黑胫病是烟草植物的重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40％-50％，甚至绝产，严重影响烟叶的质量和产量，在世界各烟区均有发生。随着社会经济的发展，气候的变化，烟草黑胫病害的发生也越来越严重。同时，现有的许多化学杀菌剂由于存在污染环境、对有益生物有害、易产生抗药性等多种弊端，已不能适应社会的发展。新型高效、低毒、低残留的天然源杀菌剂的研究倍受人们的关注。以植物提取物作为杀菌剂，具有易降解，不污染环境，无残留的特点，同时，对病原菌有多种作用靶点和独特的作用机理，病原菌不易产生抗药性，对病原菌有很强的控制作用。利用植物提取物可以开发出高效、低毒、广谱、不易产生抗性、与环境友好的新型杀菌剂。

硬骨藤Pycnarrhenapoilanei是属于防己科植物，主要分布于我国南部，我省产自西双版纳、屏边、河口等地，常生于海拔600米左右的林中。目前仅用于入药，治疗跌打肿痛、风湿关节痛等病，利用率较低，应用范围窄。将其开发成杀菌剂，有效提高硬骨藤的资源利用率，并为开发源自天然的杀菌剂提供了有利的依据。

发明内容

本发明提供了硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用。解决了抗烟草黑胫病目前使用药物非植物提取，有毒副作用，污染环境。

本发明的另一个目的是提供一种黑胫病制剂的制备方法：首先将硬骨藤粉碎，过200目筛，按料液重量比1∶3加入甲醇，浸提3次，每次浸提时间为7-10天，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，得到硬骨藤提取物，取提取物100g，用95％浓度乙醇1000ml溶解，制成浓度为100mg／ml的硬骨藤抗黑胫病剂，放入-20℃冰箱内保存备用。

本发明的有益效果是硬骨藤植物制剂在抗烟草黑胫病中高效、低毒且不会污染环境。

具体实施方式

本发明药用植物硬骨藤Pycnarrhenapoilanei的植物形态特征优选为：木质藤本或攀援灌木，高2-3米或过之，枝圆柱状，有直纹，被微柔毛或近无毛。叶片薄纸质，卵形或长圆状卵形，有时阔卵形，长9-16厘米，宽3-6厘米，先端长渐尖，基部圆或阔楔形，或近截平，仅下面中脉和侧脉上被微柔毛，侧脉约7-10对，上面凹，下面明显凸起，并于近边缘处连成清楚的边脉，叶柄细而直，顶端稍肿胀，常不明显盾状着生。聚伞花序腋生，疏散，有花数朵，花序梗和分枝均柔弱，长2-3.5厘米，被微柔毛，单生或几个簇生；雄花：萼片6-9，外面的微小，长约0.5毫米，里面的大，椭圆形或阔椭圆形，长2-2.8毫米，花瓣4-5，卵形，有短爪，长约1.5毫米，聚药雄蕊长1.5-1.8毫米；雌花花被未见，心皮黑色，长约1毫米。核果椭圆形，干时红色，长1.1-1.3厘米。花期夏季，果期秋季。

本发明的硬骨藤制剂的制备方法：首先将硬骨藤粉碎，过200目筛，按料液比1∶3加入甲醇，浸提3次，每次浸提时间为7-10天，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，得到硬骨藤提取物，取提取物100g，用95％浓度乙醇1000ml溶解，制成浓度为100mg／ml的硬骨藤抗黑胫病剂，放入-20℃冰箱内保存备用。

本发明硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用，采用室内毒力测定(抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法)及活体药效试验(温室盆栽活体试验)相结合的方法，试验该制剂对黑胫病的防治作用。室内毒力测定结果表明：用上述方法制备得到的硬骨藤抗黑胫病剂在抑制孢子萌发法试验中，对黑胫病病原菌孢子萌发的抑制率为67.43％；在平板抑菌试验中，对黑胫病病原菌的抑菌圈直径平均为0.16cm(3次重复)，两项试验结果表明该制剂对烟草黑胫病病原菌具有较强的抑制活性。温室盆栽活体试验结果表明：硬骨藤抗烟草黑胫病制剂对盆栽烟草黑胫病表现出了较好的防治效果，在50ppm浓度下其对黑胫病的防治效果经计算超过60％。

利用本发明生产的制剂对烟草黑胫病具有较好的离体及活体防治效果，可用于黑胫病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。

下面列举具体实施例来进行说明：

实施例一：抑制孢子萌发法试验，1.按照上述本发明方法制备试验用抗黑胫病剂。2.制备黑胫病病原菌，烟草黑胫病(TobaccoBlackShank)病原菌为疫霉菌烟草变种(Phytophthoranicotianae)属原生生物界(或藻物界)、卵菌门、卵菌纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属。将公知的黑胫病病原菌接种到固体培养基上25℃培养6-8天，培养基配方为每1000ml水中含燕麦片50.0g，蔗糖15g，琼脂粉15g，pH7.2。待菌丝长满培养基后，移植入V8培养基培养。依据疫霉菌(黑胫病菌)的生活循环和浸染烟苗植株的特性，在培养病原菌的过程中，关键是要促使培养基上形成菌丝的过程中，产生出大量游动子囊和游动孢子(Zoospore)，作为抑制孢子试验的前提。尽管菌丝体也可以随着植株的伤口部位浸入，但最容易浸入的方式为游动子囊和游动孢子在发芽时候的浸入。因此，对游动子囊和游动孢子的抑制是关键的位点。V8培养基培养之后，加入灭菌水，形成在10×10低倍显微镜下，每个视野30-40个游动孢子的黑胫病病原菌孢子悬浮液备用。3.抑制孢子萌发试验方法：将抗黑胫病制剂供试样品与配置好的黑胫病病原菌孢子悬浮液等体积混合，平铺于水琼脂培养基上，培养及配方为葡萄糖10g，琼脂10g，水1000mL，pH自然，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在28℃下保湿培养24小试后，察看空白对照的孢子萌发情况，黑胫病菌的游动孢子以牙管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发，当空白对照孢子萌发达到95％后，察看抗黑胫病制剂供试样品对黑胫病病原菌孢子萌发的抑制情况。按以下公式计算孢子萌发抑制率：

孢子萌发抑制率(％)=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)／对照孢子萌发率×100，

实验结果表明：硬骨藤提取物对黑胫病病原菌的孢子萌发平均抑制率为89.32％。

实施例二：平板抑菌试验，硬骨藤抗黑胫病制剂由本发明方法制备。黑胫病病原菌的制备同实施例一中抑制孢子萌发试验法中的方法。

黑胫病菌平板抑菌试验：

将培养好的黑胫病病原菌取0.5cm²大的试管种斜面与10mL燕麦培养基(制法同抑制孢子萌发法中的方法)混合均匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌试验采用常规滤纸片法，即在每个带菌平板上放置灭菌滤纸片，在滤纸片上滴加制备好的抗黑胫病制剂供试样品15u，以无菌清水作为空白对照，每处理3个重复，放置于28℃培养箱中培养48小时候，用十字交叉法测定抑菌圈直径。如下表1所示硬骨藤抗黑胫病制剂对黑胫病病原菌的抑制结果。

表1

实验结果表明硬骨藤抗黑胫病制剂对黑胫病病原菌的抑菌圈直径平均值为15.83mm，对黑胫病菌的生长有明显的抑制作用。

实施例三：温室盆栽活体实验，1.黑胫病病原菌的制备同实施例一中抑制孢子萌发试验法中的方法。2.烟草活体药效试验：a.供试烟苗，本实验采用的烤烟品种为黑胫病易感品种红花大金元。将红花大金元种子，播于装有基质的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，每盒50苗，在温度为25-28℃的温室内育苗，按0.2克／盒追施复合肥(N∶P∶K=15∶15∶15)，共2-3次，试验用药前一天选择5.5-6.5叶期长势一致的盆栽烟苗，按序排放，供试验用。b.活体药效试验，将硬骨藤抗黑胫病制剂喷洒在盆栽烟苗的茎基部和叶片部位，同时设清水为空白对照，以60％的精甲霜灵锰锌悬浮剂制剂为阳性对照。在温度为25-28℃的温室内放置24小时后，喷雾接种黑胫病菌游动孢子悬浮液(制法同抑制孢子萌发法中的方法)，在25℃保湿培养箱中黑暗条件下培养20h，取出放入温度为25-28℃的温室内培育5-7天后观察发病情况，待空白对照叶片充分发病时，采用十字测量法测量每个病斑直径，以病斑大小作为病害分级标准，病斑分级标准：0级：无病斑；1级：病斑直径0.1-5mm；3级病斑直径5.1-7.0mm；5级：病斑直径7.1-9.1mm；7级：病斑直径9.1-11.0mm；9级：病斑直径11.1mm以上。抗黑胫病防效的计算采用下列两公式：

病情指数=[〔(各级病叶数×相对级数值)〕／(调查总叶数×最高级值)]×100，

防治效果(％)=[(空白对照施药后病情指数-药剂处理施药后病情指数)／空白对照施药后病情指数]×100，

3.试验结果，盆栽试验结果显示，硬骨藤抗黑胫病制剂在施药后7天，其三个处理(有效成份量为100mg／kg、50.00mg／kg、10.00mg／kg)对烟草黑胫病的平均防效分别为80.78％、61.14％、30.08％；阳性对照药剂精甲霜灵锰锌悬浮剂(有效成份用量为100mg／kg)对烟草黑胫病的防治效果分别为63.82％，施药后14天，其三个处理(有效成份量为100mg／kg、50.00mg／kg、10.00mg／kg)对烟草黑胫病的平均防效分别为79.01％、63.43％、38.40％；阳性对照药剂对烟草黑胫病的平均防治效果分别为65.66％。采用新复极差法对试验结果进行统计分析，表明硬骨藤抗烟草黑胫病制剂在有效成份用量为100mg／kg、50mg／kg时对烟草黑胫病的防治效果之间差异不显著，与阳性对照药剂对烟草黑胫病的防治效果之间差异不显著；发明专利保护的申请制剂硬骨藤抗烟草黑胫病制剂在有效成份用量为100mg／kg时，对烟草黑胫病的防治效果优于对照药剂。如表2所示硬骨藤制剂对烟草黑胫病的防治效果。

表2

Claims (1)

1.硬骨藤制剂在抗烟草黑胫病中的应用。