CN103805523A - 内生真菌菌株ycef191及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种内生真菌菌株YCEF191，以及其在促进植物生长和降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。一种内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2013594，保藏时间2013年11月24日。本发明所述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191对烟草具有明显的促进生长作用，或增加植株的生物量，简称促生作用。同时通过测定叶片中重金属元素镉的含量，内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191在降低烟草的重金属含量方面有明显作用，相比对照组，处理的实验组中重金属Cd镉的含量下降了13.32%。

Description

内生真菌菌株YCEF191及其用途

技术领域

本发明涉及一种内生真菌菌株YCEF191，以及其在促进植物生长和降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。  

背景技术

吸烟与健康是国内外广泛关注的热点问题，降低烟草制品有害成分是烟草行业科技发展的焦点。烟叶和烟气中的重金属是最重要的有害成分之一，另外烟草病害也严重影响烟草产量和烤烟品质。而烟草农业对烟叶有害成分和烟叶品质具有重要影响，利用农业生物技术进行调控，尽量减少烟叶有害成分的本底含量，以达到降低烟草制品对人类健康危害的目的。

烟草中含有多种重金属元素，如砷、镉、铅、汞等，在抽吸过程中，这些重金属可通过主流烟气进入人体，对人体造成潜在的危害。烟草是对镉转移能力极强的作物，烟草中镉含量比其生长的土壤高出许多倍，镉在成熟烟株的不同叶位含量几乎相当，而在根中最低，烟叶中镉的积累量占总吸收量的79-96%。

内生真菌（endophytic fungi）即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌（Petrini，1991；Wilson，1995），与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在（Faeth & Fagan, 2002）。内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时在一些植物及农作物的广泛应用具有重要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体存在有益的内生细菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能量的循环交流，植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应，部分是通过植物内生真菌分泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。目前研究较多的是根瘤共生体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。

内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。烟草作为我国重要的经济作物，在国民经济中占据着不可替代的地位，烟草产量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过研究内生真菌与烟草的互作关系，对研究内生真菌与烟草的共生体系具有重大意义。

发明内容

    本发明要解决的技术问题是提供一种内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2013594，保藏时间2013年11月24日。

内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的特征为：该菌株生长速度中等，在PDA上25℃暗培养7天的菌落直径为6cm；PDA培养上菌落初期白色，成熟培养物呈白色略带黄棕，菌落略微凸起易与培养基分离；气生菌丝稠密，菌丝有隔，无色，直径约3.0-3.5 um。分生孢子器、分生孢子均未见。

菌株Pyrenochaetasp.YCEF191来源于烟草的内生真菌，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales，格孢腔菌科Pleosporaceae，棘壳孢属Pyrenochaeta。

本发明提供内生真菌菌株YCEF191的内转录间隔区核糖体DNA的全序列如SEQ ID NO: 1所示。

本发明还提供上述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的用途：促进植物生长。

本发明所述的促进植物的生长包括烟草。

本发明还同时提供了上述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的用途：降低植物中重金属的含量。

作为本发明的内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的用途的改进：所述植物为烟草。

本发明中内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191对于烟草中重金属含量的降低作用，主要部位为烟叶。

本发明中所述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的用途改进：所述菌株降低烟叶中镉的含量。

本发明所述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191对烟草具有明显的促进生长作用，或增加植株的生物量，简称促生作用。同时通过测定叶片中重金属元素镉的含量，内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191在降低烟草的重金属含量方面有明显作用，相比对照组，处理的实验组中重金属Cd镉的含量下降了13.32%。

附图说明

图1为Pyrenochaetasp.YCEF191在PDA培养基上的菌落形态。

图2为Pyrenochaetasp.YCEF191与云烟87共培养两周的照片，与对照相比，Pyrenochaetasp.YCEF191具有明显的促生作用。

图3为Pyrenochaetasp.YCEF191移入盆栽的生长2个月，处理了重金属溶液后生长30天的照片，与对照相比，Pyrenochaetasp.YCEF191具有明显的促生作用。

生物保藏声明

内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2013594，保藏时间2013年11月24日。

具体实施方式

参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

备注说明：下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处理（121℃、0.24 MPa、20分钟）。

实施例1、内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191分离获得

2%麦芽汁琼脂培养基（malt extract agar, MEA）：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar, PDA）：在马铃薯200g、 葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL；然后进行常规的高温灭菌（1.1个大气压，121℃下灭菌20min）。

以云南烟草品种园区采集Tennessee86（美国白肋烟栽培种）为植物材料，将采集的烟草用自来水漂洗干净，烟草根茎在75％（v/v）酒精溶液中消毒30秒，然后在1%（v/v）次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于含50μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素的2%麦芽汁琼脂培养基（MEA）平皿上，25℃暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落，25℃暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，命名为YCEF191。

菌株编号为Pyrenochaetasp.YCEF191, 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学 ，保藏编号：CCTCC NO:M 2013594，保藏时间2013年11月24日。

 

实施例2、内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的形态鉴定

本发明的Pyrenochaetasp.YCEF191（即Pyrenochaetasp.YCEF191 CCTCC NO:M 2013594）具有如下特性：Pyrenochaetasp.YCEF191在PDA培养基上的形态如图1所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25℃，具有以下特征：该菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales，格孢腔菌科Pleosporaceae，棘壳孢属Pyrenochaeta。该菌株生长速度中等，在PDA上25℃暗培养7天的菌落直径为6cm；PDA培养上菌落初期白色，成熟培养物呈白色略带黄棕，菌落略微凸起易与培养基分离；气生菌丝稠密，菌丝有隔，无色，直径约3.0-3.5 um。分生孢子器、分生孢子均未见。

实施例3、内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191的分子鉴定

用真菌基因的快速提取法提取DNA。采用ITS扩增的通用引物ITS-4(‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)进行PCR扩增，PCR扩增反应采用50ul的反应体系:ddH2O39.5ul、10*PCR Buffer(withMg2+)5ul、10mmol/L dNTP 0.4ul、20μmol/L Primer-F 0.8ul、20μmol/L Primer-R 0.5ul、DNA模板3ul、5U/ul Taq聚合酶0.8ul。PCR体系为：PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸60s，35个循环后,72℃延伸10min。反应结束后用1.0% 琼脂糖凝胶分析扩增产物。PCR产物回收后经上海生工生物工程有限公司测序，得到其ITS序列，内生真菌菌株YCEF191的内转录间隔区核糖体DNA的全序列如SEQ ID NO: 1所示。测序结果在GenBank 数据库中进行同源序列搜索以进一步确定其分类地位。

实施例4、内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF191对植物的促生作用

MS培养基（1L）：硝酸钾 1900mg/L，硝酸铵 1650 mg/L，硫酸镁370 mg/L，磷酸二氢钾 170 mg/L，氯化钙 440 mg/L，硫酸锰 22.3 mg/L，硫酸锌 8.6 mg/L，硼酸 6.2 mg/L，碘化钾 0.83 mg/L，钼酸钠 0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025 mg/L，硫酸亚铁27.8 mg/L，Na2EDTA37.3 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，烟酸0.5 mg/L，肌醇100 mg/L，30g蔗糖，琼脂粉8g， H₂O定容至1L；pH值5.8。

(1)          选择烟草品种云烟87的种子，无菌水浸泡48h后，搓种20~30min。种子用70%的酒精灭菌1min，2%（质量%）的次氯酸钠灭菌10min，无菌水冲洗5~6次后点在MS培养基上，于25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗交替下萌发两周（约长至4片叶），备用。

(2)          挑选大小一致烟草苗用于同供试菌株的共培养。将长至4片叶的烟草幼苗转移至10*10（厘米）的方形1/2MS培养基上（3株/皿），为保持烟草的良好长势，将茎叶部分的培养基去掉，根部舒展在1/2MS培养基上。挑取培养一周左右的内生真菌菌丝，置于烟草苗根部下方1cm左右进行共培养。空白对照不接菌丝，平皿封口后置于25℃、16h光照80μmm-2sec-1与22℃、8h黑暗的条件下培养两周左右。备注说明：1/2 MS培养基即为大量元素（硝酸钾 、硝酸铵 、硫酸镁、磷酸二氢钾 、氯化钙）减半，其余元素含量不变的MS培养基。

(3)          共培养两周后，供试菌株表现出良好的促生效果（如图2所示）。将烟草苗从平皿中取出，叶片和根部分开，分别置于1.5ml的离心管中，烘箱中烘干，精密天平称重统计。

 

表1：YCEF191与云烟87共培养后叶片生物量统计

表2：YCEF191与云烟87共培养后根部生物量统计

相比对照组，实施组在叶片干重和根部干重上都明显优于对照组，对烟草的生长具有正调作用。共培养两周后，供试菌株表现出良好的生长效果。移入盆栽2个月后重新对生物量进行统计。

表3：YCEF191与云烟87移入盆栽后叶片干重生物量统计

上述实验结果表明，实验组Pyrenochaetasp.YCEF191长势良好，叶片大而厚，植株较壮，盆栽中叶片干重和根部干重数据也表明，Pyrenochaetasp.YCEF191对云烟87这个品种的烟草具有明显的促进生长作用，或增加植株的生物量，简称促生作用。

实施例5、内生真菌菌株在降低烟草烟叶重金属含量的作用

共培养两周后，供试菌株表现出良好的生长效果。移入盆栽，正常养护2个月，对照组CK与实验组Pyrenochaetasp.YCEF191均生长良好。在生长正常的植株盆栽内浇灌含Cd（镉）的重金属溶液（氯化镉溶液），重金属镉含量为5mg/kg，培养1个月(如图3照片所示)后供烟叶重金属测试。

采用IPC-MS同时测定烟叶中重金属的含量。

（1）        前处理：

将烟叶样品去梗，存40℃下烘干(约14h)，粉碎，过40目筛。称取0.2000g烟粉样品，置于聚四氟乙烯消化罐内，加入2 mL 1 μg／mL Au标准溶液、5 mL 65％ 硝酸、1 mL 30％ 过氧化氢，按照如下微波消解程序进行消解：500 W(5 min)→ O w(2 min) →500 w(5 min) →8OO w(15min)消解结束后，待温度降至低于40℃：，取出消解罐，在通风橱内将样品消解液转移至预先称重的50 mL聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)样品瓶中，用超纯水洗涤消解罐内罐和瓶盖3次，洗涤液也转移至样品瓶中，称量，摇匀，得待测溶液。对照为未加烟叶的空白处理液。

（2）        测定所用仪器和溶液：

10 ng／mL Mg，Cu，Rh，Cd，In，Ba，Ce，Pb，U调谐溶液、10 ng／mL Be，Mg，In，Co调谐溶液、10 g／mL Cr，Ni，As，se，cd，cs，Pb混合标准溶液、l0 g／mL Hg标准溶液、1000~g／mL Au标准溶液(美国Perkin Elmer公司)；1000 g／mL钇标准溶液、GBW10016茶叶(中国计量科学研究院)；30％过氧化氢、浓硝酸(GR，Mer．ck公司)；超纯水(18．2M~／em)；烟叶样品（采收实施例5中所述每盆栽所有成熟烟叶)。

ELAN动态反应池(DRC)一电感耦合等离子体(ICP)一质谱(MS)仪(美国Perkin Elmer公司)；Rotor16微波消化器(美国Perkin Elmer公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；PL601-L电子分析天平(0．0001g，瑞士梅特勒公司)。

 

表4：Cd²⁺处理45d后烟草的生长状况

对植物和共生微生物的互作研究表明，植物根系和共生微生物的互作对植物吸收重金属和对重金属的耐受性具有重要影响。很多植物都有菌根真菌（AM），菌根真菌在植物根部定殖增加了根的吸收表面积，在土壤中扩展延伸的真菌菌丝帮助植物吸收包括重金属在内的营养物质。菌根真菌种类和寄主植物基因型对菌根真菌在植物根部的定殖及对营养吸收的效果有显著的差异。结果表明，菌根真菌的根外菌丝能将土壤中的重金属吸收固定，但重金属从真菌到植物的迁移受到限制，或很少迁移到植物地上部。因此共生微生物能否限制或降低烟草对重金属元素的吸收，或改变重金属从植物根系到地上部的迁移，对于降低烟草重金属含量非常关键。筛选发现造成烟草重金属低积累或根茎超积累而烟叶低积累的共生微生物在烟草重金属减害方面显示良好的应用潜力。表4中，有4株对照组烟草和5株Pyrenochaetasp.YCEF191实验组烟草，我们通过测定叶片中重金属元素镉的含量，Pyrenochaetasp.YCEF191在降低烟草的重金属含量方面有明显作用，相比对照组，处理的实验组中重金属Cd镉的含量下降了13.32%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江中烟工业有限责任公司

 

<120>内生真菌菌株YCEF191及其用途

 

<160> 2

 

 

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> Pyrenochaeta sp.

 

<400> 1

cattaactgt attacggggg gccggcgtgg gattgcgtgc tttggtgcgc cttccctccc      60

cgccctgtct gatactaccc gtgtcttttg cgtaccaatt gtttcctcgg taggcttgcc     120

tgccggccgg acaccataaa accttttgtg attgcagtca gcgtcagaaa actacaataa     180

ttacaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc     240

gataagtagt gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc     300

cccttggtat tccatggggc atgcctgttc gagcgtcatt tgtaccctca agctctgctt     360

ggtgttgggt gtttgtcccg ctttgcgcgt ggactcgcct caaagcaatt ggcagccggc     420

aatctggtta tagagcgcag cacattttgc gcttcttgcc acggatgtcg gcgtccatca     480

agcctacact tttgctcttg acctcggatc aggtagggat ac                        522

 

Claims (6)

1.内生真菌（Pyrenochaetasp.）菌株YCEF191，其特征是：该菌株的保藏名称为： Pyrenochaeta sp.YCEF191，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2013年11月24日，保藏编号：CCTCC NO:M 2013594。

2.根据权利要求1所述的内生真菌菌株YCEF191的用途，其特征在于：该用途用于促进烟草生长或增加生物量。

3.根据权利要求1所述的内生真菌菌株YCEF191的用途，其特征在于：该用途用于降低烟草中重金属含量。

4.根据权利要求3所述的内生真菌菌株YCEF191的用途，其特征在于：所述的重金属包括镉。

5.根据权利要求1所述的内生真菌菌株YCEF191的用途，其特征在于：该用途用于降低烟草烟叶中重金属含量。

6.根据权利要求5所述的内生真菌菌株YCEF191的用途，其特征在于：所述的重金属包括镉。

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