CN103804303A - Egfr小分子抑制剂嘧啶衍生物及其制备方法与用途 - Google Patents

Egfr小分子抑制剂嘧啶衍生物及其制备方法与用途 Download PDF

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CN103804303A CN201410092409.0A CN201410092409A CN103804303A CN 103804303 A CN103804303 A CN 103804303A CN 201410092409 A CN201410092409 A CN 201410092409A CN 103804303 A CN103804303 A CN 103804303A
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Abstract

本发明涉及一种EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物及其制备方法，EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的分子通式如下：

Description

EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种嘧啶衍生物，具体涉及一种EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法与作为抗癌药物的用途。
背景技术
酪氨酸激酶在一系列细胞活动(例如细胞生长、分化和死亡)的信号传导途径中起着重要的作用。很多类型的肿瘤因为有功能紊乱的生长因子受体酪氨酸激酶，导致不正确的有丝分裂信号，在包括癌症和其它许多疾病的治疗研究中，酪氨酸激酶都是研究的目标和对象[1‐4]。因此，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶成为药物发现的靶点。在为数众多、结构各异的酪氨酸激酶抑制剂中，激酶的ATP作用位点是药物设计中引人注目的研究对象。数以百计的结构各异的化合物被证实为高效的、有选择性的ATP竞争性的酪氨酸激酶抑制剂。Traxler等系统地报道了嘧啶类衍生物的合成方法及其对EGFR酪氨酸激酶的抑制作用[5‐12]。
嘧啶类化合物因其广泛的生物活性在医药、农药等领域备受关注，由于嘧啶环上取代位点和取代基的多样性，在2，4‐位有氨基取代的嘧啶化合物通常具有较好的抑制酪氨酸激酶的活性；嘧啶环的2‐位或4‐位中引入苯环、吡啶环、咪唑环、噻唑环、吲哚环等也往往具有较强的生物活性；而以嘧啶为核心骨架的嘌呤类、吡啶并嘧啶类化合物也表现出了较好的酪氨酸激酶抑制活性。
展望未来，随着人们对癌症发病机理以及药物作用机制的进一步阐明和构效关系更深入的研究，嘧啶衍生物在抗肿瘤方面一定会取得巨大突破，具有该结构的成本低、药效好的抗癌新药物将会应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物及其制备方法与用途。本发明EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，所用原料便宜，简单易得，反应步骤少，产率高，适合工业化生产。
本发明的技术方案如下：
本发明所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物，分子通式如下：
Figure BDA0000476619820000021
式中R为：
Figure BDA0000476619820000022
EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，步骤如下：
（1）将2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶，溴乙酰溴，二氯甲烷置于圆底烧瓶中，常温搅拌过夜得产物a；
（2）将产物a过滤，将液体蒸干，用丙酮重结晶，析出固体；
（3）将步骤（2）中得到的固体溶于乙腈中，然后加入苯基哌嗪或取代的苯基哌嗪，油浴加热，在58-82下反应6-24个小时，冷却至室温产物b；
（4）将产物b过滤，将液体减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物。
2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶与溴乙酰溴的摩尔比为1:1-2。
2‐氨基‐4,6‐二甲氧基嘧啶和二氯甲烷的比例为1mmol：20‐100ml。
取代的苯基哌嗪为间甲氧基苯基哌嗪、间氯苯基哌嗪、邻氟苯基哌嗪、邻甲氧基苯基哌嗪、邻氯苯基哌嗪、对硝基苯基哌嗪、对甲氧基苯基哌嗪、对氟苯基哌嗪、2，4‐二甲基苯基哌嗪、2，3‐二氯苯基哌嗪、3，4‐二氯苯基哌嗪、吡啶基哌嗪、苄基哌嗪、对三氟甲基苯基哌嗪、二苯基甲基哌嗪、4‐氯二苯基甲基哌嗪或双对氟二苯基甲基哌嗪中的一种。
步骤（2）得到的固体与取代的苯基哌嗪的摩尔比为1:1-1.5。
本发明EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，因此本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物可以应用于制备抗癌药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，所用原料便宜，简单易得，反应步骤少，产率高，适合工业化生产，是一类很好的潜在的药品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例一：
2‐(4‐(3‐氯苯基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备，产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000031
制备步骤为：（1）将1mmol2‐氨基‐4，6‐二甲氧基嘧啶，1.5mmol溴乙酰溴置于圆底烧瓶中，加入25ml二氯甲烷，常温搅拌过夜得产物a，
（2）将产物a过滤，将液体蒸干，用丙酮重结晶，析出固体；
（3）将步骤（2）中得到的固体溶于乙腈中，然后加入间氯苯基哌嗪，油浴加热，在82℃下反应8个小时，冷却至室温产物b；
（4）将产物b过滤，将液体减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物。
步骤（2）得到的固体与取代的苯基哌嗪的摩尔比为1:1。
产品为浅黄色粉末，产率70%。m.p.101.5‐102.4℃;1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.734(s，4H)，2.901(s，2H)，3.017(s，4H)，3.883(s，6H)，5.942(s，1H)，7.032‐7.069(m，1H)，7.183‐7.203(d，J=8.0Hz，1H)，7.291‐7.327(m，1H)，7.405‐7.424(m，1H)，10.080(s，1H).MS(ESI)；392(C18H23ClN5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H22ClN5O3；C，55.17;H，5.66;N，17.87%;Found；C，55.19;H，5.60;N，17.91%。
实施例二：
N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)‐2‐(4‐(3‐甲氧基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备，产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000041
制备步骤为：（1）将1mmol2‐氨基‐4，6‐二甲氧基嘧啶，2mmol溴乙酰溴置于圆底烧瓶中，加入80ml二氯甲烷，常温搅拌过夜得产物a，
（2）将产物a过滤，将液体蒸干，用丙酮重结晶，析出固体；
（3）将步骤（2）中得到的固体溶于乙腈中，然后加入间甲氧基苯基哌嗪，油浴加热，在60℃下反应24个小时，冷却至室温产物b；
（4）将产物b过滤，将液体减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物。
步骤（2）得到的固体与取代的苯基哌嗪的摩尔比为1:1.5。
淡黄色粉末，产率65%。m.p.107.7‐108.7℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.511(s，2H)，2.681(s，4H)，3.165(s，4H)，3.719(s，3H)，3.875(s，6H)，5.938(s，1H)，6.362‐6.548(m，3H)，7.092‐7.133(m，1H)，10.081(s，1H).MS(ESI)；388(C19H26N5O4，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H25N5O4；C，58.90;H，6.50;N，18.08%;Found；C，58.95;H，6.59;N，18.16%。
实施例三：
N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)‐2‐(4‐(2‐氟苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备，产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000042
制备步骤为：（1）将1mmol2‐氨基‐4，6‐二甲氧基嘧啶，1mmol溴乙酰溴置于圆底烧瓶中，加入60ml二氯甲烷，常温搅拌过夜得产物a，
（2）将产物a过滤，将液体蒸干，用丙酮重结晶，析出固体；
（3）将步骤（2）中得到的固体溶于乙腈中，然后加入间甲氧基苯基哌嗪，油浴加热，在70℃下反应16个小时，冷却至室温产物b；
（4）将产物b过滤，将液体减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物。
步骤（2）得到的固体与取代的苯基哌嗪的摩尔比为1:1.1。
制备方法同实施例一，不同点在于以邻氟苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。
产品为白色晶体，产率60%。m.p.138.5‐139.7℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.860‐2.881(m，4H)，3.231‐3.253(m，4H)，3.351(s，2H)，3.882(s，6H)，5.836(s，1H)，7.048‐7.052(m，1H)，7.068‐7.083(m，1H)，7.095‐7.099(m，1H)，7.308(s，1H)，10.087(s，1H).MS(ESI)；376(C18H23FN5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H22FN5O3；C，57.59;H，5.91;N，18.66%;Found；C，57.64;H，5.88;N，18.69%。
实施例四：
N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)‐2‐(4‐苯基哌啶‐1‐基)乙酰胺的制备产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000051
制备方法同实施例一，不同点在于，以苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。
产品为白色晶体，产率65%。m.p.135.2‐137.4℃;1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.774(s，4H)，3.005(s，2H)，3.228‐3.251(m，4H)，3.876(s，6H);5.727(s，1H)，6.807‐6.894(m，3H)，7.199‐7.237(m，3H).MS(ESI)；358(C18H24N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H23N5O3；C，60.49;H，6.49;N，19.59%;Found；C，60.56;H，6.41;N，19.66%。
实施例五：
N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)‐2‐(4‐(2‐甲氧基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备，产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000052
制备方法同实施例一，不同点在于，以邻甲氧基苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率62%。m.p.139.5‐140.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.927(s，4H)，3.241(s，4H)，3.576(s，2H)，3.915(s，9H)，5.837(s，1H)，6.914‐6.934(d，J=8.0Hz，1H)，6.978‐7.023(m，2H)，7.051‐7.071(m，1H)，10.307(s，1H).MS(ESI)；388(C19H26N5O4，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H25N5O4；C，58.90;H，6.50;N，18.08%;Found；C，58.98;H，6.45;N，18.11%。
实施例六：
2‐(4‐(2‐氯苯基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备，产品分子式为：
Figure BDA0000476619820000061
制备方法同实施例二，不同点在于，以邻氯苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率61%。m.p.100.5‐100.9℃;1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.728‐2.732(m，4H)，2.913(s，2H)，3.019(s，4H)，3.872(s，6H)，5.949(s，1H)，7.032‐7.069(m，1H)，7.180‐7.202(d，J=8.0Hz，1H)，7.291‐7.327(m，2H)，10.083(s，1H).MS(ESI)；392(C18H23ClN5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H22ClN5O3；C，55.17;H，5.66;N，17.87%;Found；C，55.10;H，5.71;N，17.82%。
实施例七：N‐(4，6‐二甲氧基‐2‐基)‐2‐(4‐(4‐硝基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000062
制备方法同实施例二，不同点在于，以对硝基苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率64%。m.p.184.8‐186.7℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.819‐2.844(m，2H)，2.914(s，2H)，2.991(s，2H)，3.379(s，4H)，3.542‐3.567(m，6H)，5.837(s，1H)，6.877‐6.901(m，1H)，7.308(s，1H)，8.041(s，1H)，8.157‐8.180(m，1H)，10.503(s，1H).MS(ESI)；403(C18H23N6O5，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H22N6O5；C，53.73;H，5.51;N，20.88%;Found；C，53.77;H，5.58;N，20.79%。
实施例八：N‐(4，6‐二甲氧基‐2‐基)‐2‐(4‐(4‐甲氧基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000071
制备方法同实施例一，不同点在于，以对甲氧基苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率60%。m.p.20.4‐124.7℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.948(s，2H)，3.274(s，4H)，3.671(s，4H)，3.987(s，9H)，5.837(s，1H)，6.890‐6.912(m，2H)，6.990‐7.011(m，1H)，7.308(s，1H)，10.080(s，1H).MS(ESI)；388(C19H26N5O4，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H25N5O4；C，58.9;H，6.5;N，18.08%;Found；C，58.81;H，6.57;N，18.15%。
实施例九：
N‐(4，6‐二甲氧基‐2‐基)‐2‐(4‐(4‐氟苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
制备方法同实施例三，不同点在于，以对氟苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率68%。m.p.136.0‐136.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.680‐2.703(m，4H)，3.101‐3.124(m，4H)，3.385(s，2H)，3.875(s，6H)，5.939(s，1H)，6.945‐6.979(m，2H)，7.032‐7.077(m，2H)，10.076(s，1H).MS(ESI)；376(C18H23FN5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H22FN5O3；C，57.59;H，5.91;N，18.66;Found；C，57.63;H，5.80;N，18.52%。
实施例十：
N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)‐2‐(4‐(2，4‐二甲基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000081
制备方法同实施例三，不同点在于，以2，4‐二甲基苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率63%。m.p.153.1‐154.3℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.819‐2.830(m，4H)，3.290(s，2H)，3.314(s，4H)，3.876(s，6H)，3.984(s，6H)，6.031(s，1H)，7.012‐7.019(m，1H)，7.312‐7.336(m，2H)，9.552(s，1H).MS(ESI)；386(C20H28N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC20H27N5O3；C，62.32;H，7.06;N，18.17%;Found；C，62.39;H，7.13;N，18.11%。
实施例十一：
2‐(4‐(2，3‐二氯苯基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000082
制备方法同实施例一，不同点在于，以2，3‐二氯苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率60%。m.p.142.9‐150.3℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.736(s，4H)，3.019(s，4H)，3.412(s，2H)，3.884(s，6H)，5.943(s，1H)，7.033‐7.017(m，1H)，7.185‐7.202(d，J=6.8Hz，1H)，7.292‐7.331(m，1H)，10.083(s，1H).MS(ESI)；426(C18H22Cl2N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H21Cl2N5O3；C，50.71;H，4.97;N，16.43%;Found；C，50.79;H，5.08;N，16.50%。
实施例十二：
2‐(4‐(3，4‐二氯苯基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备。
制备方法同实施例一，不同点在于，以3，4‐二氯苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率66%。m.p.153.4‐154.0℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.808‐2.833(m，4H)，3.290(s，2H)，3.314(s，4H)，3.984(s，6H)，6.785‐6.814(m，1H)，7.012‐7.019(m，1H)，7.308‐7.340(m，2H)，9.386(s，1H).MS(ESI)；426(C18H22Cl2N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC18H21Cl2N5O3；C，50.71;H，4.97;N，16.43%;Found；C，50.66;H，5.07;N，16.49%.
实施例十三：
N‐(4，6‐二甲氧基吡啶‐2‐基)‐2‐(4‐(吡啶‐2‐基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000092
制备方法同实施例一，不同点在于，以吡啶基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率64%。m.p.131.1‐131.3℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.773‐2.798(m，2H)，3.667‐3.691(m，4H)，3.870‐3.880(m，4H)，3.974‐3.983(m，6H)，5.836(s，1H)，6.681‐6.724(m，1H)，7.308(s，1H)，7.518‐7.562(m，1H)，8.231‐8.246(m，1H)，10.025(s，1H).MS(ESI)；359(C17H23N6O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC17H22N6O3；C，56.97;H，6.19;N，23.45%;Found；C，56.90;H，6.25;N，23.39%。
实施例十四：2‐(4‐苄基‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备。
制备方法同实施例一，不同点在于，以苄基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率58%。m.p.92.6‐93.6℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.288(s，4H)，2.511(s，2H)，2.689(s，4H)，3.431‐3.472(d，J=16.4Hz，2H)，3.956(s，6H);7.229‐7.342(m，5H)，10.056(s，1H).MS(ESI)；372(C19H26N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H25N5O3；C，61.44;H，6.78;N，18.85%;Found；C，61.50;H，6.82;N，18.79%。
实施例十五：
N‐(4，6‐二甲氧基‐2‐基)‐2‐(4‐(4‐(三氟甲基)苯基)哌嗪‐1‐基)乙酰胺的制备。
Figure BDA0000476619820000102
制备方法同实施例一，不同点在于，以对三氟甲基苯基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率64%。m.p.136.0‐136.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.871(s，4H)，2.922(s，2H)，2.996(s，4H)，3.373‐3.396(m，6H)，5.839(s，1H)，7.118‐7.164(m，2H)，7.308(s，1H)，7.388‐7.428(m，1H)，9.413(s，1H).MS(ESI)；426(C19H23F3N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H22F3N5O3；C，53.64;H，5.21;N，16.46%;Found；C，53.70;H，5.17;N，16.51%。
实施例十六：
2‐(4‐苄基‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备，产品的分子式为：
Figure BDA0000476619820000111
制备方法同实施例一，不同点在于，以二苯基甲基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率60%。m.p.92.6‐93.6℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.288(s，4H)，2.511(s，2H)，2.689(s，4H)，3.431‐3.472(d，J=16.4Hz，2H)，3.956(s，6H);7.229‐7.342(m，5H)，10.056(s，1H).MS(ESI)；372(C19H26N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC19H25N5O3；C，61.44;H，6.78;N，18.85%;Found；C，61.50;H，6.82;N，18.79%.
实施例十七：
2‐(4‐((4‐氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备，产品的分子式为：
Figure BDA0000476619820000112
制备方法同实施例一，不同点在于，以4‐氯二苯基甲基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率60%。m.p.180.6‐181.2℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.569(s，4H)，3.321(s，2H)，3.345(s，4H)，3.861(s，6H)，4.390(s，1H)，5.927(s，1H)，7.113‐7.157(m，2H)，7.166‐7.168(m，2H)，7.321‐7.323(m，1H)，7.425‐7.431(m，1H)，7.455‐7.460(m，3H)，9.968(s，1H).MS(ESI)；482(C25H29ClN5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC25H28ClN5O3；C，62.30;H，5.86;N，14.53%;Found；C，62.25;H，5.89;N，14.60%。
实施例十八：
2‐(4‐(双(4‐氟苯基)甲基)哌嗪‐1‐基)‐N‐(4，6‐二甲氧基嘧啶‐2‐基)乙酰胺的制备，产品的分子式为：
Figure BDA0000476619820000121
制备方法同实施例一，不同点在于，以双对氟二苯基甲基哌嗪代替间氯苯基哌嗪，得产品。白色粉末，产率63%。m.p.182.6‐183.3℃；1HNMR(400MHz，CDCl3)；2.575(s，4H)，3.289‐3.321(d，J=12.8Hz，2H)，3.345(s，4H)，3.861(s，6H)，4.392(s，1H)，5.925(s，1H)，7.113‐7.157(m，4H)，7.425‐7.460(m，4H)，9.966(s，1H).MS(ESI)；484(C25H28F2N5O3，[M+H]+).Anal.CalcdforC25H27F2N5O3；C，62.10;H，5.63;N，14.48%;Found；C，62.03;H，5.69;N，14.55%。
下面是实施例1‐18的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物抗癌活性的检测研究。
1、实验材料
1.1细胞株
人乳腺癌细胞株MCF-7；
人宫颈癌细胞株Hela。
1.2试剂
RPMI1640培养基（GIBCO），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料），胰蛋白酶（Sigma），MTT（Sigma），注射用链霉素（山东瑞阳制药，1g100万单位/支），注射用青霉素钠（山东鲁抗医药，80万单位/支）。其它常用化学试剂均为国产分析纯。
2、实验方法
2.1培养基的配制
RPMI1640培养基（Gibcio USA）一袋加水一升，补加2g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22mm除菌滤膜过滤除菌。90mL培养基加灭活新生牛血清10mL即为完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液配成0.25%溶液，过滤除菌后4℃保存备用。
2.2药液的配制
准确称取被测样品1.0mg，加到灭菌的1.5mL离心管中，加入DMSO1mL，配成1mg/mL原液，-40℃冷冻保存。临用前融化后用适量D-hanks稀释成相应浓度应用。
2.3细胞培养及传代
细胞均贴壁培养于含10mL完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0.25%胰蛋白酶消化细胞2min，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30mL后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。
2.4抗癌活性测试
取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液锥虫蓝（Trypan Blue）染色，于显微镜下计数活细胞数目（死细胞数目不得超过5%），用完全培养液调整细胞数目至1×104个细胞/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于CO2培养箱中培养24h，取出培养板后于每孔中加11μL含不同浓度被测样品的溶液，使得药物终浓度分别为60，20，6.67，2.22，0.74，0.25和0.082μg/mL，每个浓度设3个平行孔，另设6孔细胞作正常对照孔和阳性对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中继续培养24h。取出培养板，每孔加入25μL5mg/mL的MTT液，振荡混匀，继续培养4h。加入每孔100μL DMSO后培养10min。酶标仪测定各孔光吸收（OD值），测定波长490nm。根据各孔OD值通过CalcuSyn软件计算药物对两种细胞增殖的抑制率，即IC50值。
实施例1‐18的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物抗癌活性研究的实验结果如表1。
表1实施例1‐18的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物对EGFR、MCF‐7和HeLa抑制IC50值
Figure BDA0000476619820000131
Figure BDA0000476619820000141

Claims (7)

1.一种EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物，其特征是，分子通式如下：
式中R为：
Figure FDA0000476619810000012
2.一种权利要求1所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，其特征是，步骤如下：
（1）将2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶，溴乙酰溴，二氯甲烷置于圆底烧瓶中，常温搅拌过夜得产物a；
（2）将产物a过滤，将液体蒸干，用丙酮重结晶，析出固体；
（3）将步骤2中得到的固体溶于乙腈中，然后加入苯基哌嗪或取代的苯基哌嗪，油浴加热，在58-82℃下反应6-24个小时，冷却至室温产物b；
（4）将产物b过滤，将液体减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到本发明的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物。
3.根据权利要求2所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，其特征是，2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶与溴乙酰溴的摩尔比为1:1-2。
4.根据权利要求2所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，其特征是，2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶和二氯甲烷的比例为1mmol：20-100ml。
5.根据权利要求2所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，其特征是，取代的苯基哌嗪为间甲氧基苯基哌嗪、间氯苯基哌嗪、邻氟苯基哌嗪、邻甲氧基苯基哌嗪、邻氯苯基哌嗪、对硝基苯基哌嗪、对甲氧基苯基哌嗪、对氟苯基哌嗪、2，4-二甲基苯基哌嗪、2，3-二氯苯基哌嗪、3，4-二氯苯基哌嗪、吡啶基哌嗪、苄基哌嗪、对三氟甲基苯基哌嗪、二苯基甲基哌嗪、4-氯二苯基甲基哌嗪或双对氟二苯基甲基哌嗪中的一种。
6.根据权利要求2所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的制备方法，其特征是，步骤（2）得到的固体与取代的苯基哌嗪的摩尔比为1:1-1.5。
7.一种权利要求1所述的EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物的用途，其特征是，EGFR小分子抑制剂嘧啶衍生物应用于制备抗癌药物。
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