CN103796663A

CN103796663A - 用于抑制由于血管生成引起的视力减退的、包含源自棕榈油植物液的提取物或材料的组合物，及其制备方法

Info

Publication number: CN103796663A
Application number: CN201280029562.8A
Authority: CN
Inventors: 阿里·哈弗兹·莫格哈登; 拉维葛德伟·撒班森姆尔什; 谭椰艾; 卡尔亚娜·孙达拉姆·P-马尼克康; 肯尼斯·C.·海斯; 赞迪·搜斯卡
Original assignee: Palm Oil Research and Development Board
Current assignee: Palm Oil Research and Development Board
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2014-05-14
Also published as: WO2012158018A2; CO6940409A2; WO2012158018A3; EP2709643B1; BR112013029577A2; EP2709643A4; BR112013029577B1; EP2709643A2

Abstract

本发明一般地涉及包括棕榈果汁的组合物，该组合物用于预防和抑制由于血管生成相关疾病引起的视力减退。除了减少利用荧光染料测得的巨噬细胞浸润之外，本发明的组合物有助于减小利用共聚显微镜测得的CNV尺寸；减少利用建立的角膜囊袋测定法测定的VEGF-A-诱导的血管生成，抑制激光处理的脉络膜组织中IKB-D的磷酸化，以及减少巨噬细胞招募CNV病变。

Description

用于抑制由于血管生成引起的视力减退的、包含源自棕榈油植物液的提取物或材料的组合物,及其制备方法

技术领域

本发明通常涉及基于油棕榈植物的组合物，具体涉及用于治疗和预防如年龄相关的黄斑变性（AMD）等眼部炎症和血管疾病的、包含从棕榈油植物液中得到的材料的组合物。

背景技术

说明书中参考的任何现有技术，不是承认或暗示这些现有技术在马拉西亚或其他国家成为公知常识的一部分。

血管生成涉及从先前存在的血管产生的新的血管的形成或出芽。在一般情况下，在伤口愈合和胚胎发育过程，但不限于上述过程时的血管形成时可以观察到血管生成。在过去几年，研究者已经做出了大量的努力来了解血管生成的调控，识别血管生成途径，很多写了机理及其病理和生理条件。血管形成涉及三个主要的过程或步骤。其中第一阶段为内皮细胞的血管生成活化，和基底膜的降解，第二阶段为内皮细胞增殖和迁移，第三阶段为心血管形成。

新形成的血管的成熟和稳定阶段通过招募周细胞产生，周细胞可涉及血管生成因子，例如血管内皮生长因子（VEGF）。因此，血管内皮生长因子（VEGF）对所有这三个主要阶段其主要作用。它便于诱导血管的内皮细胞的血管生成活化状态，从先前存在的血管刺激的增殖和迁移，以及在新的血管形成中整合素的表达。

人类失明或成人视力减退的一个主要原因是年龄相关性黄斑病变，特别是工业化国家。通常，这种原因与前面所述的血管生成的正常生理过程的干扰相关，特别是由于血管的局部扩张，或者失控的血管生成。

成人视力减退的主导原因的例子是年龄相关性黄斑变性（AMD）。近年的研究已经证明AMD由导致视力障碍和失明的临床眼部发现分类（assortment of clinically ocular findings）。通常，AMD发生两种形式，干性和湿性。在湿性AMD中，脉络膜血管病态的生长穿过视网膜色素上皮（RPE）细胞层至视网膜下腔，该过程称为脉络膜新生血管（CNV）。根据科学报告，CNV和随之而来对RPE和视网膜细胞的泄露损害将导致永久的视力减退。

因为VEGF是很多情况下的血管生成中是重要的生物标记物（Zahir K Otrock, 2010），所以VEGF已经被确定为CNV生长的泄露的关键分子，以及血管疾病的新生血管的主要调控因子。可以得出结论，VEGF是一种重要的显著因子，影响内皮细胞（EC）在其它细胞内的增殖，即其动力和血管浸润性。

巨噬细胞为VEGF和肿瘤坏死因子（TNF）-□的主要来源，因此它被牵涉在AMD的发病机理中，由于它们在CNV病变的附近的失控分布，特别是是实验模型和人体内。

在US 2007203211 A1，公开了一种药物，用于治疗和预防血管生成眼部疾病，其中该方法涉及对有需要的不如动物给药药学上有效量的血管紧缩素II受体拮抗剂。还公开了该血管紧缩素II受体拮抗剂对于预防和治疗眼内血管疾病，例如增殖性视网膜病变或视网膜经脉阻塞非常有效。该文献没有明确的公开使用植物基材料作为VEGF抑制剂。

绝大部分的治疗和制剂是可能对于老年患者可能不利的基于化学或手术的治疗。进一步的，已经证明AMD的治疗仅仅对少部分患者有效，特别是具有明确定义的脉络膜新生血管膜（CNVM）(Bressler et al, 2004)。

因此，需要通过源自高丰富的来源，例如植物基材料，找出一个解决方案，有效的治疗眼部心声血管，从而抑制人类失明。

本发明的主要目的在于提供一种组合物和方法，用于预防和治疗由于血管生成相关的视力减退。通过以下详细的描述，本领域技术人员将容易地明白本发明的其它目的。

发明内容

本发明涉及通过包括棕榈果汁的组合物治疗和预防由于眼部血管生成引起的视力减退。

根据本发明，提供一种组合物，该组合物包括从棕榈油植物液中获得的材料，用于预防和抑制由于眼部血管生成疾病引起的视力减退。

根据本发明，所述组合物可用于抑制由于血管生成介导的或相关疾病引起的视力减退，例如，但不限于，眼部新生血管，黄斑变性或需要抑制血管生成的疾病的方法。

另一方面，本发明的所述组合物可用于预防由于血管生成和VEGF受体磷酸化引起的视力减退的方法。

附图说明

一些附图中包含颜色标示或实体，用于说明本发明的目的的实验的结果。

图1（a）和（b）展示了本发明的棕榈果汁(PFJ)对CNV形成的作用；

图2（a）和（b）展示了根据本发明的优选方法的浸润在CNV中的巨噬细胞；

图3（a）和（b）展示了在实验AMD中白细胞的活化；

图4（a）和（b）展示了角膜中血管生成的组织区域；

图5展示了用棕榈果汁治疗的实验AMD中ρΙΚβ-D, IKB-D, pNFKB 和NFKB的蛋白质印迹。

具体实施方式

通过说明书，除非文中要求，否则，单词“包括”，或各种同义词“包含”，将理解为暗示包括指出的元件或整体或元件或整体的组，但是不排除其他元件或整体或元件或整体的组。

通过举例说明的方式描述本发明的实施例。可以理解，本发明可以具有其他或不同实施例，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以对几个细节进行修改。

根据本发明，所述组合物包括从棕榈油植物液中获得的材料或提取物，其中所述植物液可以直接从植物获得，或者作为在植物材料处理中的废物流或水性流。所述植物流可以从在棕榈油碾碎中的油棕的任何处理阶段得到的废物中获得。

根据本发明，从棕榈油植物液或棕榈油碾碎处理中得到的材料或提取物为水溶性的。

本发明的、从棕榈油植物液中获得的材料或提取物包括酚类物质（phenolics）。

本发明提供一种组合物及方法，该方法用于治疗眼部血管生成，特别是年龄相关性黄斑变性（AMD），其中所述组合物基于油棕品种的油棕榈植物。

从而本发明引入一种新型组合物和新颖的治疗方法。

本发明的具体方面涉及基于包含从植物液，例如棕榈果汁中获得的材料的组合物，制备用于治疗眼部血管生成的药剂的方法。

本发明的另一方面在于提供一种组合物，该组合物包括提取物，特别是从植物液液中获得的棕榈果汁，该组合物用于治疗眼部血管生成，更具体地，黄斑变性相关疾病，例如，但不限于年龄相关性黄斑变性（AMD）。

在说明书中，使用的术语“油棕品种”包括非洲油棕榈（Elaeis guineensis）和美洲油棕榈（Elaeis oleifera）。

作为一个初步例子，下面描述了源自油棕榈植物液的提取物对与CNV的作用；更具体地，所述提取物为棕榈果汁。

材料和方法

为了检查PFJ对视力减退的作用，进行多个实验将作为例子来进行，下文将对得到的结果进行说明。

该棕榈果汁（PFJ）可以通过传统方法从纯的棕榈坚果中获得。上述用于本发明发明目的的果汁可以包括其他成分，但是不能破坏果汁的营养成分。

根据本发明，该棕榈果汁（PFJ）明显地降低了VEGF-A-诱导的血管生成。可通过以下实施例1提供的角膜微囊分析的标准方法检查上述作用。

实施例1

角膜微囊分析

对Balb/C小鼠腹腔注射氯胺酮（100mg/kg）和赛拉嗪（10mg/kg）进行麻醉。制备含有25, 100, 200, 400 或1600ng人VEGF-A (293-VE; R&D Systems)，200 ng小鼠VEGF-A (493-MV; R&D systems)的海昌丸(0.3μl)，并将其注入角膜。将丸剂放在离角膜缘约1.0±0.2mm处。植入后，对每只眼睛施加杆菌肽眼膏(E. Fougera & Co)，以防止感染。在植入后的指定日子，获取角膜血管的数字图像，并利用OpenLab软件2.2.5版本（Improvision Inc）与标准化的照明和对比度记录。

实施例2

全片血管生成的定量

用罗丹明-刀豆灌注小鼠，并将其眼睛取出，然后再角膜周边部做径向切口，以使用封片剂(TA-030-F , Mountant Permaflour; Lab Vision Corporation)使其平面安装在载玻片上。利用荧光显微镜检查该平面安装的组织，并利用OpenLab软件版本2.2.5(Improvision Inc)和标准标准化的照明和对比度记录。并揭露得到的结果。

实施例3

激光诱导的CNV

为了诱导CNV，麻醉C57BL/6小鼠，并用5%去氧肾上腺素和0.8%托吡卡胺放大瞳孔。使用532-nm激光(Oculight GLx, Iridex, Mountain View, CA)，裂缝灯输送系统，和作为接触透镜的盖玻片，四个斑点（100mW, 50 μm, 100ms）放置在每个眼睛处。该病变位于3, 6, 9 和12点钟的中心在视神经头的经络处，并距离视神经头约2-3圆盘直径。在激光下Bruch膜的破裂证明了在激光下泡沫的发展。实验排出了眼睛中的出血。记录该步骤中得到的结果。

根据本发明的另一个优选实施例，PFJ降低了CNV尺寸，其中评估这种作用的分析展示在以下实施例4中。

实施例4

CNV的评估

激光损伤后的7天，测量脉络膜铺片中的CNV病变的尺寸。简单的，麻醉小鼠，并用PBS灌注左心室，随后用1%的明胶中的5ml荧光素标记的葡聚糖（5 mg/ml, 异硫氰酸荧光素 - 葡聚糖;西格玛奥德里奇）灌注。眼前节和视网膜从眼杯中取出。利用封片剂(TA-030-FM, Mountant Permafluor; Lab Vision Corporation)和盖玻片松弛径向切口后，将剩余的RPE-脉络膜-巩膜复合物制成铺片。利用共聚焦显微镜(Leica, Wetzlar, Germay)对脉络膜复合体进行纤维照相。利用Openlab软件( Improvision, Boston, MA)测量超荧光区，来测定CNV病变的大小。

根据本发明的另一个优选实施例，PFJ降低了巨噬细胞的浸润，其中可以利用标准方法检查这种作用，如以下实施例5所述。

实施例5

免疫组织化学

在激光损伤3天后，制备10μm的后端冻冰切片。用小鼠抗- F4/80 mAb(10μg/ml)孵化该切片，随后用第二抗体孵化。获取CNV病变的显微照片，并对F4/80阳性巨噬细胞进行计数。

实施例6

蛋白质印记

为了获得组织，用PBS灌注动物，在灌注之后立即摘除眼睛。显微分离脉络膜，并将其置于带有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma）的100μl的裂解缓冲液内（mammalian cell lysis kit MCL 1, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO），并超声。离心该裂解物（12000 rpm, 15 min, 4°C），并收集上清液。含有等量总蛋白的、由蛋白检测 (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA) 定量的每个样本由SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分离，并转印至PVDF（聚偏氟乙烯）膜(Invitrogen, Carlsbad, CA)上。为了阻断非特异性结合，用5%脱脂牛奶洗涤该膜并随后用兔多克隆抗体(1μg/ml, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)或抗β-微管蛋白的单克隆抗体（mAb）（1.5 μg/ml; Abeam, Cambridge, MA）在4℃下过夜孵育，随后用辣根过氧化物酶标记的驴或羊抗兔或鼠IgG的抗体(1:2000; GE Healthcare UK limited Buckinghamshire, UK)孵育。根据制作商的协议书，利用化学发光分析(ECL kit; GE Healthcare UK limited, Buckinghamshire, UK)将信号可视化。

统计

所有数值均表示为平均值+SEM。利用t-检验分析数据，当概率值p<0.05或<0.01时，相应的认为实验组之间的差异是统计学上显著的，或统计学上非常显著的。

结果

每个实施例得到的结果均被适当地记录并通过传统方式进行分析。

I . 在AMD实验中使用PFJ降低CNV的尺寸

为了检查PFJ在降低CNV方面的潜力，在激光伤害前，给小鼠喂食两周的PFJ。CNV诱发后每次7次，使用共聚焦显微镜测定CNV的体积。

图 1 (a) 和 (b)是用赋形剂处理或口服PFJ的动物脉络膜铺片中CNV病变的代表性显微图片。红色虚线是充满FITC-葡聚糖的CNV病变的量。图1(b)是CNV体积的定量分析。图1很明显可以观察到，与喂食赋形剂的对照样相比，CNV的体积明显降低。

II . 在AMD实验中使用PFJ降低巨噬细胞的浸润

为了研究AMD中PFJ对巨噬细胞浸润的效果，进行了巨噬细胞-特异性标记物，F4/80的免疫染色，并对CNV病变中F4/80阳性细胞进行定量。发现，如图 2 (a)和(b)所示，激光伤害一周后巨噬细胞招募至CNV病变。通过对比，这个时间点上累积的巨噬细胞的数量会明显减少。

图2 (a)是用赋形剂和PFJ处理的，用F4/80免疫染色的，被激光诱导的CNV病变的荧光显微图像。绿色阴影是侵润CNV病变的巨噬细胞的数量。图- 2 (b)是巨噬细胞侵润的定量分析。柱状图展示了巨噬细胞数的平均值，n=3，P=0.05。

为了研究CNV病变中巨噬细胞的活化，对白细胞活化标志物CD11b进行了免疫染色，对CNV病变中CD11b阳性细胞的数量进行了定量。激光伤害一周后，可以观察到赋形剂喂食的动物CNV病变中累积活化免疫细胞的显著数量。相反，可以观察到PFJ喂食动物活化白细胞的数量明显减少。本次实验获得的数据见表并绘制图3 (a)和(b)。

图4(a)是基于本发明一个优选实施例角膜血管生成的组织区。VEGF-A植入的第三天和第六天角膜血管的数字图像。图4 (b)展示了图像是铺片角膜组织的荧光显微图像，其中第六天小鼠被灌注罗丹明-刀豆。

图 4 (c)是基于血管生成区域的定量分析的绘图。基于这个实验，展示了平均面积 (n=3) , P=0.05。

III.使用PFJ抑制AMD实验的促炎信号

基于在喂养赋形剂（vehicle）或PFJ的小鼠的植入hVEGF-A (200ng)的角膜，在分子水平上研究PFJ对血管生成的作用。为了检查PFJ是否降低了血管生成，在植入后的第3天和第六天，获取角膜血管的数字图像，并进行定量。实验结果见图5，其中在激光损伤三天后，对经过与未经过PFJ处理的实验AMD中plKB-D、1KB-D、pNFKB和NFKB进行蛋白质印迹，对照组为未受激光损伤的眼睛。

通过以上，因为众所周知，免疫细胞和更特别是巨噬细胞在AMD病理中起到了重要的作用，中断单核细胞的招募并浸润至眼组织可有助于预防疾病的发生与发展。

根据本发明，实验结果表明给对象喂食或用棕榈果汁（PFJ）处理，显示：

a) 除了免疫染色测得的巨噬细胞侵润的减少外，使用共聚焦显微镜测得的CNV尺寸的降低；

b)使用建立的角膜囊袋测定法测得VEGF-A诱导血管生成的明显降低；

c)使用PFJ抑制了激光处理的脉络膜组织中的IKB-D的磷酸化；

d)减少巨噬细胞招募CNV病变。

如前面的章节所述，根据本发明，所述组合物可以用于一种方法，该方法用于抑制由于血管生成调节或相关疾病引起的视力减退，例如，但不限于，眼部新生血管，黄斑变性或需要抑制血管生成的疾病的方法。

本发明的另一个方面，所述组合物可以用于对糖尿病性视网膜病变或对眼睛视网膜的损害，可导致失明或眼睛疾病的各种类型的青光眼，和角膜移植提供保护作用。

此外，本发明的组合物可以用于预防由于血管生成相关疾病和VEGF受体磷酸化导致的视力减退。

通常，含有棕榈果汁（PFJ）的组合物可以按照各种合适的形式进行制备，并基于预防成人视力减退的目的直接或口服给药。

根据本发明，本发明的PFJ可用于制备补充剂，或包含在饮剂、可食产品、滋补品、保健品和化妆品中。很显然，PFJ可以制备成浓缩物形式或提取物。

适用于口服给药的组合物可存在于离散单元中，例如胶囊、药囊、锭剂或片剂，每个均含有预先确定的量的提取物：作为粉剂或颗粒剂；在水性或非水性液体中作为溶液或悬浮液。这些组合物可通过任何合适的药物方法进行制备，包括加入与本发明提取物相关，以及一种或多种适合的载体（可能包括一种或多种如下所述的辅助成分）。通常，本发明组合物可通过均匀地或紧密地混合提取物或任何其它形式含有液体和/或细碎固体载体的棕榈果汁（PFJ），如有需要，可对生成的混合物塑形。例如，片剂可通过压制或模压含有提取物或任何形式棕榈果汁（PFJ）进行制备，可任选一种或多种辅助成分。

压制片剂可通过在合适的机器中压制粉状或颗粒形式的提取物，并可选择地与粘合剂、润滑剂、和/或表面活性剂/分散剂混合来制备。模压片剂可通过在合适的机器中模压沾有惰性液体粘合剂粉末化合物来制备。

可以通过方便实施的方法，形式/量来制备组合物。

如上所述，也可以将本发明的组合物以膳食补充剂的形式给药至人。含有该活性组合物的膳食补充剂可以通过在制备食物的过程中，将该组合物添加至食物中制备。可以使用任何食物，包括，但不限于，肉类，如肉馅、肉糜和腌制肉；饮料，如营养饮料、运动饮料、蛋白质强化饮料、果汁、牛奶、牛奶替代品及减肥饮料；奶酪，如硬或软奶酪，奶油奶酪和干酪；冷冻甜点，如冰激凌、冰牛奶、低脂冷冻甜点和非奶制品冷冻甜点；酸奶；皂（soaps）；布丁；烘焙产品；沙拉酱；以及酱类，如蛋黄酱，黄油，奶油替代品，和其它脂肪。将该组合物按照所需剂量添加到消费者的食品中

进一步地，将有效量的本发明组合物给药至人患者。实际的给药水平将根据多种因素决定，例如给药的具体模式，治疗的病情，患者的情况和医生的诊断。

含有本发明任何形式的组合物可以制备为药学有效或营养学有效量，仅仅其自身或与本领域技术人员认为适当的其他试剂或化合物结合使用。

注意到术语“药学有效”和“营养学有效”量包括用于改善或预防由于黄斑变性相关疾病引起的视力减退可以接受的量。

本领域技术人员将理解文中描述的本发明可以进行变形和改进，而不受到这些具体描述的限制。可以理解，本发明包括所有这样的变形和改进。本发明还包括说明书中提及或指示的单独的或共同的步骤、特征、组合物和化合物，和任意两种或多种所述步骤或特征的组合。

Claims

1. 一种组合物，包括提取自棕榈油植物液的提取物，所述组合物在预防和抑制由于血管生成相关疾病引起的视力减退的方法中使用。

2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述提取物为提取自棕榈油植物液的水溶性成分。

3. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述提取物包括酚类物质。

4. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述提取物为棕榈果汁。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述血管生成相关疾病包括眼部血管生成相关疾病。

6. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述血管生成相关疾病包括黄斑变性。

7. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述眼部血管生成相关疾病为年龄相关性黄斑变性（AMD）。

8. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物在减少AMD中的脉络膜新生血管（CNV）病变的尺寸的方法中使用。

9. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物在减少AMD中噬菌体浸润的方法中使用。

10.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物在抑制VEGF-A-诱导的血管生成的方法中使用。

11. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物在抑制AMD中的促炎症信号的方法中使用。

12. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物在抑制脉络膜组织中的IKB-D磷酸化的方法中使用。

13. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物在减少AMD中的巨噬细胞招募的CNV病变的方法中使用。

14.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物在抑制由于VEGF受体磷酸化相关的疾病引起的视力减退的方法中使用。

15. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物在抑制由于眼部新生血管引起的视力减退的方法中使用。

16.用于预防由于血管生成相关疾病引起的视力减退的方法，该方法包括使用含有棕榈果汁的组合物的步骤。

17. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述血管生成相关疾病与黄斑变性有关。

18. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述疾病为年龄相关性黄斑变性（AMD）。

19. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物对青光眼或相关疾病和角膜移植提供保护作用。

20. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物用于对糖尿病性视网膜病变及其相关疾病提供保护作用。

21.含有棕榈果汁的组合物在制备药剂中的用途，该药剂用于预防有需求的患者由于血管生成相关疾病引起的视力减退。

22.一种能够抑制由于血管生成相关疾病引起的视力减退的组合物，所述组合物基本由棕榈果汁组成。

23.一种用于抑制由于血管生成相关疾病引起的视力减退的组合物，所述组合物包括从棕榈油植物液获得的材料。

24. 根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述材料为提取自棕榈油植物液的提取物。

25. 根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述材料为棕榈果汁。