CN103789253A - 一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物细胞悬浮培养方法,特别是一种鹿蹄草细胞悬浮方法,属生物技术领域。本发明鹿蹄草细胞悬浮培养方法包括外植体的选择与灭菌,愈伤组织诱导,细胞悬浮培养,培养细胞的扩大繁殖四个步骤。本发明可在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞,解决鹿蹄草资源需求问题,具有生产周期短,增殖速度快的优点,可用于药用植物成分的提取和制药工业。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物细胞悬浮培养方法,特别是一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,属生物技术领域。
背景技术
鹿蹄草(Pyrola rotundifolia L)为鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草属(Pyrola)植物,具有较高的药用价值。有文献报道其具有增强机体免疫力、改善心脑血管系统功能等药效,并应用于肠道感染、肺炎、高血压等疾病的治疗,疗效显著。目前该植物资源基本来源于野生采挖,难以大规模应用,且对采集地生态环境及野生鹿蹄草资源造成极大损害。虽然已有研究人员对鹿蹄草的引种驯化进行了研究与探讨,但依然存在引种驯化率低,栽培条件难于控制等问题。本发明提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养的方法,能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞,通过生物技术手段解决鹿蹄草资源需求的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,该方法能够在较短时间内获得大量鹿蹄草悬浮细胞,可为提取鹿蹄草有效成分提供充足原料。
本发明采用如下技术方案:
(1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片,无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡1~3min,随后放入0.1%~0.15%的HgCl2溶液中浸泡20~40s,随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
(2)愈伤组织诱导:在超净工作台中,将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3~8mm的小叶片,接种到愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基配方为:MS+6-BA0.3~0.7mg/L+2,4-D0.3~0.7mg/L+蔗糖20~40g/L+琼脂5~8g/L,PH值为5.6~6.0;培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x。
(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中,将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散,接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。悬浮细胞液体培养基配方为:MS+6-BA0.5~1.0mg/L+2,4-D0.2~0.5mg/L+蔗糖20~40g/L,PH值为5.6~6.0;接种量为每100mL培养基中加入10~50g愈伤组织,培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x,振荡速度30~100rpm。培养10~15d,得到鹿蹄草悬浮细胞。
(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下,将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10~1∶15的比例接种至增殖培养基中,振荡培养。增殖培养基配方为:MS+6-BA0.2~0.6mg/L+2,4-D0.3~0.5mg/L+蔗糖20~40g/L,PH值为5.6~6.0;培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x,振荡速度30~100rpm,得到大量鹿蹄草悬浮细胞。
采用本发明制备鹿蹄草悬浮细胞,生产周期短、增殖速度快、产量大、能耗少,操作便捷,利于大规模生产操作。
具体实施方式
实施例一:
(1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片,无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡2min,随后放入0.1%的HgCl2溶液中浸泡25s,随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
(2)愈伤组织诱导:在超净工作台中,将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长5mm的小叶片,接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.4mg/L+2,4-D0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,PH值为5.8;培养温度为25℃,每天光照Oh,即黑暗培养。
(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中,将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散,接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.7mg/L+2,4-D0.3mg/L+蔗糖30g/L,PH值为5.8;接种量为每100mL培养基中加入20g愈伤组织,培养温度为25℃,每天光照0h,即黑暗培养,振荡速度80rpm。培养10d,得到鹿蹄草悬浮细胞。
(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下,将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10的比例接种至增殖培养基中,震荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.3mg/L+2,4-D0.4mg/L+蔗糖30g/L,PH值为5.8;培养温度为25℃,每天光照0h,即黑暗培养,振荡速度80rpm。培养15d,3000rpm离心得鹿蹄草细胞,称鲜重,与步骤(2)中所得愈伤组织相比,增重12倍。
实施例二:
(1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片,无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡1min,随后放入0.15%的HgCl2溶液中浸泡40s,随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
(2)愈伤组织诱导:在超净工作台中,将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3mm的小叶片,接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.3mg/L+2,4-D0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,PH值为5.6;培养温度为20℃,每天光照16h,光照强度10001x。(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中,将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散,接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+蔗糖20妙L,PH值为5.6;接种量为每100mL培养基中加入10g愈伤组织,培养温度为20℃,每天光照16h,光照强度10001x,振荡速度30rpm。培养15d,得到鹿蹄草悬浮细胞。
(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下,将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶15的比例接种至增殖培养基中,振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D0.3mg/L+蔗糖20g/L,PH值为5.6;培养温度为20℃,每天光照16h,光照强度10001x,振荡速度30rpm。培养15d,3000rpm离心得鹿蹄草细胞,称鲜重,与步骤(2)中所得愈伤组织相比,增重8倍。
实施例三:
(1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片,无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡3min,随后放入0.1%的HgCl2溶液中浸泡20s,随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
(2)愈伤组织诱导:在超净工作台中,将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长8mm的小叶片,接种到愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为:MS+6-BA0.7mg/L+2,4-D0.7mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8g/L,PH值为6.0;培养温度为30℃,每天光照16h,光照强度10001x。
(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中,将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散,接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+蔗糖40g/L,PH值为6.0;接种量为每100mL培养基中加入50g愈伤组织,培养温度为30℃,每天光照16h,光照强度10001x,振荡速度100rpm。培养10d,得到鹿蹄草悬浮细胞。
(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下,将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶12的比例接种至增殖培养基中,振荡培养。培养基配方为:MS+6-BA0.6mg/L+2,4-D0.5mg/L+蔗糖40g/L,PH值为6.0;培养温度为30℃,每天光照16h,光照强度10001x,振荡速度100rpm。培养15d,3000rpm离心得鹿蹄草细胞,称鲜重,与步骤(2)中所得愈伤组织相比,增重10倍。
Claims (5)
1.一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,其特征在于按照如下步骤进行:
(1)外植体的选择与灭菌:以鹿蹄草叶片作为外植体。采集健康无病害的鹿蹄草叶片,无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡1~3min,随后放入0.1%~0.15%的HgCl2溶液中浸泡20~40s,随后用无菌水清洗5遍。所有操作在超净工作台中进行。
(2)愈伤组织诱导:在超净工作台中,将灭菌后的鹿蹄草叶片用无菌手术刀切成边长3~8mm的小叶片,接种到愈伤组织诱导培养基上,培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x。
(3)细胞悬浮培养:在超净工作台中,将生长良好的愈伤组织用无菌研钵碾碎分散,接种到悬浮细胞液体培养基中振荡培养,接种量为每100mL培养基中加入10~50g愈伤组织,培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x,振荡速度30~100rpm。培养10~15d。(4)培养细胞的扩大繁殖:在无菌条件下,将步骤(3)中所得鹿蹄草悬浮细胞按照体积比1∶10~1∶15的比例接种至增殖培养基中,振荡培养,培养温度为20~30℃,每天光照0~16h,光照强度1000~30001x,振荡速度30~100rpm。
2.如权力要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,其特征在于步骤(1)中外植体为健康无病害的鹿蹄草叶片,外植体清洗过程为无菌水清洗2遍,在75%乙醇中浸泡1~3min,随后放入0.1%~0.15%的HgCl2溶液中浸泡20~40s,随后用无菌水清洗5遍。
3.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,其特征在于步骤(2)中愈伤组织培养基配方为:MS+6-BA0.3~0.7mg/L+2,4-D0.3~0.7mg/L+蔗糖20~40g/L+琼脂5~8g/L,PH值为5.6~6.0。
4.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,其特征在于步骤(3)中悬浮细胞液体培养基配方为:MS+6-BA0.5~1.0mg/L+2,4-D0.2~0.5mg/L+蔗糖20~40g/L,PH值为5.6~6.0。
5.如权利要求1所述的一种鹿蹄草细胞悬浮培养方法,其特征在于步骤(4)中增殖培养基配方为:MS+6-BA0.2~0.6mg/L+2,4-D0.3~0.5mg/L+蔗糖20~40g/L,PH值为5.6~6.0。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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