CN103773373B

CN103773373B - 叶酸自组装水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法

Info

Publication number: CN103773373B
Application number: CN201410010713.6A
Authority: CN
Inventors: 李妍; 胡悦立; 孙玉绣; 陈晓芳; 张庆鑫
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2034-01-10
Also published as: CN103773373A

Abstract

本发明公开了一种叶酸自组装制备水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，主要是用9 mL二甘醇和6 mL高纯水做溶剂，加入1 mmol Ln（Y/Yb/Er=80/18/2），16 mmol NaF，0.15 g 聚乙烯亚胺（PEI），测pH为9，在氮气保护下200oC搅拌反应0.5 h，转入反应釜中，200oC反应24 h，自然冷却，离心洗涤，得到聚乙烯亚胺修饰的上转换纳米粒子（PEI-UCNPs），将1 g PEI-UCNPs分散在高纯水中，加入0.1g的叶酸，振荡15min，离心洗涤，再分散在高纯水中，得到叶酸自组装的上转换纳米粒子（FA-UCNPs），由于叶酸与叶酸受体可以特异性地结合，因此叶酸自组装的稀土掺杂上转换纳米材料可以识别癌变细胞，用于癌症细胞的靶向成像。

Description

叶酸自组装水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法

本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095，全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023，天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700，天津市高校“中青年骨干创新人才培养计划”ZX110GG015和天津师范大学“渤海学者”引进人才科研项目5RL098的资助。

技术领域

本发明属于荧光纳米材料制备领域，具体涉及一种叶酸自组装水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，并应用于细胞成像。

背景技术

稀土掺杂上转换纳米材料，具有许多有机染料和半导体量子点不具备的优点，包括荧光寿命长而无闪烁、毒性低、荧光量子产率高、自体荧光小、化学稳定性和光稳定性好以及渗透深度大，近些年来引起了科研人员的广泛关注，特别在细胞成像和活体成像上已有很多报道，关于叶酸功能化稀土掺杂上转换纳米材料，大都先用PEI包覆稀土掺杂上转换纳米粒子，然后通过EDC和NHS反应得到，过程复杂，成本高，本片采用叶酸自组装PEI包覆的稀土掺杂上转换纳米材料，利用NH₂-和COOH-的化学键作用将其接上，操作简便，成本低，我们知道，癌症细胞表面比正常细胞多很多叶酸受体，而叶酸与叶酸受体能够特异性识别结合，因此，叶酸受体会与叶酸自组装的上转换纳米粒子特异性的结合，并将粒子转运到细胞内，在980nm激发下，发出荧光，但是正常细胞粒子少，荧光弱，即实现了靶向性识别检测。

之前，我们公开的专利“水溶性红绿光可调谐的稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法”（专利申请号为201310403495.8，公开号为CN103436263A）采用乙二醇-高纯水体系，合成的粒子尺寸均匀，颜色可调，水溶性好，但是在后期的细胞成像中表现出一定的缺陷，例如溶解性差（最高可达10 mg/mL）、荧光较弱、毒性强并且没有靶向性。在此基础上我们对其进行优化，采用二甘醇-高纯水体系,合成的粒子在水中浓度可达30 mg/mL，毒性略小，进一步进行叶酸自组装之后，由于聚乙烯亚胺连接上了叶酸，故其毒性降低，而且可以识别癌变细胞（对比实验如图8所示），在癌症的早期诊断上有很大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、粒径较小、尺寸均匀、成本低、水溶性和生物相容性好、可以靶向成像的叶酸自组装稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种叶酸自组装稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，按如下的步骤进行：

a）稀土硝化物储备液的制备：将氧化钇Y₂O₃4 mmol、氧化镱Yb₂O₃0.9 mmol、氧化铒Er₂O₃0.1 mmol（Y/Yb/Er=80/18/2），称好质量，放入50 mL小烧杯中，加入10 mL浓硝酸，5 mL高纯水，在通风橱中100 oC，硝化，蒸干，加入约20 mL 高纯水，重新溶解析出的硝酸稀土盐，转入50 mL容量瓶中，定容摇匀，每次取5 mL 储备液进行实验。

b）聚乙烯亚胺修饰的上转换纳米粒子的制备：称取16 mmol的NaF,放于50 mL烧杯中，加入8 mL二甘醇和2 mL高纯水，0.15gPEI，20oC加热搅拌，用5 mL移液管移取5 mL储备液，滴加到上述溶液中，转入三颈烧瓶中，通氮气，油浴200 oC反应0.5 h。

转入25 mL的反应釜中，200 oC下反应24 h，自然冷却。测pH为8，转入到5 mL的离心管中，10000 rpm，10 oC下离心5 min，倾去上面液体，加入3 mL 95%（w/w）乙醇，超声15 min，继续离心，如此再用3 mL 95%（w/w）的乙醇，3 mL高纯水，洗涤三次，转移到表面皿上，真空50 oC干燥；

c）叶酸自组装上转换纳米粒子的制备：将上一步离心洗涤完的粒子（PEI-UCNPs）直接分散在高纯水中，称取0.1-1.0 g的叶酸(FA)，加入0.01M氢氧化钠(NaOH)使其溶解，振荡15min，按步骤b)离心洗涤干燥，得到叶酸自组装的上转换纳米粒子（FA-UCNPs）。

本发明进一步公开了制备的叶酸自组装的稀土掺杂的上转换纳米材料在细胞成像上的应用，其方法如下：

1）0.01M磷酸缓冲溶液的配制：用200 mL高纯水溶解2 gNaCl，0.05 gKCl，0.895 gNaHPO₄·12H₂O和0.06 gKH₂PO₄。微加热，用HCl调节pH值至7.4，加水至250 mL的容量瓶中，过0.22 um的水膜，冻于冰箱中。

2）采用人宫颈癌细胞(Hela)在6孔板上贴壁培养24h以后，加入200uL纳米粒子的磷酸缓冲溶液(培养基是2 mL,纳米粒子的浓度为200 ug/mL)，培养6 h，用吸管吸去培养基，慢慢加入2 mL 0.01M的磷酸缓冲(PBS)溶液，用吸管吸去，用PBS溶液洗涤三次，放在荧光共聚焦显微镜下成像，扫描波长为500-600 nm和600-700 nm。

本发明主要是用6 mL二甘醇和9 mL高纯水溶剂体系，加入1 mmol Ln（Y/Yb/Er=80/18/2），16 mmol NaF，聚乙烯亚胺（PEI）0.15 g，pH为9，温度200 oC，反应24 h的条件下，合成了粒径在20-40nm(如图2左)，用叶酸自组装后的粒径为30-50 nm（如图2右），应用于细胞成像。

本发明公开的叶酸自组装的水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法与现有的技术相比，具有以下的有益效果：

（1）本发明所提供的制备方法通过控制钇、镱、铒、氟元素的化学计量比，可以优化纳米粒子的发光强度。

（2）本发明所提供的溶剂热合成水溶性纳米粒子的方法，与传统的油相法相比，其成本低，绿色，工艺简单、安全，合成温度低，表面功能化容易等。

（3）本发明合成的叶酸自组装稀土掺杂上转换纳米材料与其他方法相比过程简单，成本低。

附图说明：

图1为PEI-UCNPs和FA-UCNPs的XRD图；

图2为PEI-UCNPs(A)和FA-UCNPs(B)的TEM图；

图3为PEI-UCNPs(A)、FA-UCNPs(B)和叶酸(FA，C)的紫外吸收图；

图4为PEI-UCNPs和FA-UCNPs的FTIR图；

图5为UCNPs(A)、PEI-UCNPs(B)和FA-UCNPs(C)的Zeta电位图；

图6为FA-UCNPs的荧光图；

图7为FA-UCNPs与叶酸受体作用示意图；

图8为PEI-UCNPs（第一组图加入的为乙二醇高纯水体系合成的PEI-UCNPs，第二组图加入的为二甘醇高纯水体系合成的PEI-UCNPs）和FA-UCNPs（第三组图加入的为叶酸自组装粒子）的细胞成像图（左、500-600nm，右、600-700nm）。

具体实施方式

通过下面结合附图对其示例性实施例进行的描述，本发明上述特征和优点将会变得更加清晰和容易理解。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述的高纯水（18.2 MΩ·cm）购买于天津师范大学水资源与水环境重点实验室（对外有售），所述的氧化钇Y₂O₃（99.99%）购买于上海化学试剂有限公司，氧化镱Yb₂O₃（99.99%）购买于上海化学试剂有限公司，氧化铒Er₂O₃（99.99%）、二甘醇（分析纯）、乙二醇（二甘醇）、叶酸购买于天津市光复精细化工研究所，聚乙烯亚胺PEI(支链，M.W.10000，99%)购买于Alfa Aesar。

实施例1

首先，将氧化钇Y₂O₃4 mmol、氧化镱Yb₂O₃0.9 mmol、氧化铒Er₂O₃0.1 mmol（Y/Yb/Er=80/18/2），称好质量，放入50 mL小烧杯中，加入10 mL浓硝酸，5 mL高纯水，在通风橱中100 oC，硝化，蒸干，加入约20 mL 高纯水，重新溶解析出的硝酸稀土盐，转入50 mL容量瓶中，定容摇匀，每次取5 mL 储备液进行实验。

实施例2

称取16 mmol的NaF,放于50 mL烧杯中，加入8 mL二甘醇和2 mL高纯水，0.15 gPEI，20 oC加热搅拌，用5 mL移液管移取5 mL储备液，滴加到上述溶液中，转入三颈烧瓶中，通氮气，油浴200 oC反应0.5 h。转入25 mL的反应釜中，200 oC下反应24 h，自然冷却，测pH为8，转入到5 mL的离心管中，10000 rpm，10 oC下离心5 min，倾去上面液体，加入3 mL 95%（w/w）乙醇，超声15 min，继续离心，如此再用3 mL 95%（w/w）的乙醇，3 mL高纯水，洗涤三次，转移到表面皿上，真空50 oC干燥。

实施例3

将实施例2离心洗涤完的粒子（PEI-UCNPs）直接分散在高纯水中，称取0.5 g的叶酸(FA)，加入0.01M氢氧化钠(NaOH)使其溶解，振荡15 min，按实施例3离心洗涤干燥，得到叶酸自组装的上转换纳米粒子（FA-UCNPs）。

实施例4

我们采用人宫颈癌细胞(Hela)在6孔板上贴壁培养24 h以后，加入200 uL的叶酸自组装的稀土掺杂上转换纳米粒子(培养基是2 mL,叶酸自组装的纳米粒子的浓度为200 ug/mL)，培养6 h，用吸管吸去培养基，慢慢加入2 mL 0.01M的磷酸缓冲(PBS)溶液，用吸管吸去，用PBS溶液洗涤三次，放在荧光共聚焦显微镜下成像，扫描波长为500-600 nm和600-700 nm，我们分别做了PEI-UCNPs（乙二醇和高纯水体系）、PEI-UCNPs（二甘醇和高纯水体系）、叶酸自组装的上转换纳米粒子（FA-UCNPs），我们可以看出加入第一种粒子的细胞已经破碎，发光的全是纳米粒子，说明细胞毒性太大，第二组图我们可以看出细胞完整，但是靶向性不是很明显，也就是说粒子进入细胞的很少，第三组图说明我们制备的叶酸自组装的上转换纳米粒子靶向性明显，而且荧光强，如图8。

Claims

1.一种叶酸自组装制备水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，按如下的步骤进行：

a）稀土硝化物储备液的制备：将氧化钇Y₂O₃4 mmol、氧化镱Yb₂O₃0.9 mmol、氧化铒Er₂O₃0.1 mmol，称好质量，放入50mL小烧杯中，加入10 mL浓硝酸，5 mL高纯水，在通风橱中100oC，硝化，蒸干，加入约20 mL 高纯水，重新溶解析出的硝酸稀土盐，转入50 mL容量瓶中，定容摇匀，每次取5 mL 储备液进行实验；其中氧化钇、氧化镱、氧化铒中元素Y/Yb/Er的摩尔比=80/18/2；

b）聚乙烯亚胺修饰的上转换纳米粒子的制备：称取16mmol的NaF,放于50 mL烧杯中，加入8 mL二甘醇和2 mL高纯水，0.15gPEI，20oC加热搅拌，用5 mL移液管移取5 mL储备液，滴加到上述溶液中，转入三颈烧瓶中，通氮气，油浴200oC反应0.5 h，转入25 mL的反应釜中，200℃下反应24 h，自然冷却；测pH为8，转入到5 mL的离心管中，10000rpm，10oC下离心5min，倾去上面液体，加入3 mL 95%（w/w）乙醇，超声15min，继续离心，如此再用3mL 95%（w/w）的乙醇，3mL高纯水，洗涤三次，转移到表面皿上，真空50oC干燥；

c）叶酸自组装上转换纳米粒子的制备：将上一步离心洗涤完的粒子PEI-UCNPs直接分散在高纯水中，称取0.1-1.0g的叶酸，加入0.01 M氢氧化钠使其溶解，振荡15 min，按步骤b)离心洗涤干燥，得到叶酸自组装的上转换纳米粒子，FA-UCNPs。

2.采用权利要求1方法制备的叶酸自组装的稀土掺杂的上转换纳米材料在制备作为人宫颈癌细胞（Hela细胞）成像材料中的应用，它是采用Hela细胞在6孔板上贴壁培养24 h以后，加入200 μL的叶酸自组装的纳米粒子的磷酸缓冲溶液，培养基是2 mL,叶酸自组装的纳米粒子的浓度为200 ug/mL，培养6 h，用吸管吸去培养基，慢慢加入2 mL0.01M的磷酸缓冲溶液，用吸管吸去，用PBS溶液洗涤三次，放在荧光共聚焦显微镜下成像，扫描波长为500-600 nm和600-700 nm。