CN103743850A

CN103743850A - 一种腈吡螨酯残留量的测定方法

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Publication number: CN103743850A
Application number: CN201410026918.3A
Authority: CN
Inventors: 崔淑华; 刘靖靖; 王兴华; 卜春玲; 王静; 秦良勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-21
Also published as: CN103743850B

Abstract

本发明公开了一种腈吡螨酯残留量的测定方法，用乙腈或1%乙酸乙腈均质提取样品中残留的腈吡螨酯，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）和石墨化碳（Carb）基质分散净化后，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用空白基质溶液稀释标准建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为87.6%～94.5%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～6.4%，检出限低于0.42μg/kg，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足韩国、日本、欧盟等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种腈吡螨酯残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种腈吡螨酯残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量测定蔬菜、水果和茶叶中残留的腈吡螨酯含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

腈吡螨酯（Cyenopyrafen）是2009年由日产化学公司研制的新型吡唑类杀螨剂，主要用于防治果树、蔬菜和茶叶的红蜘蛛等害螨，化学名称为(E)-2-(4-叔-丁基苯基)-2-氰基-1-(1,3,4-三甲基吡唑-5-基)烯基2,2-二甲基丙酸酯，英文化学名称为(E)-2-(4-tert-butylphenyl)-2-cyano-1-(1,3,4-trimethylPyrazol-5-yl)vinyl2,2-imethylpropionate，CAS登录号为560121-52-0，分子量为393.52，结构式为：

腈吡螨酯于2009年在日本和韩国获得登记，以商品名Starmite和Valuestar(与哒螨灵的混剂)销售，2010年销售额约1000万美元。主要用于防治茄子、青辣椒、黄瓜、梨、草莓、柑橘类等水果、蔬菜、茶叶上的各种害螨，具有较好的速效性和持效性。该药剂为触杀型杀螨剂，作用机理为：药剂通过代谢成羟基形式而活化产生活性，这种羟基形式在呼吸电子传递链上通过扰乱复合物II（琥珀酸脱氢酶）达到抑制线粒体的效能，从而阻碍电子传递，破坏氧化磷酸化过程。与现有杀虫剂无交互抗性。

随着腈吡螨酯的登记、推广和使用，作为我国蔬菜、水果及其他农产品主要出口市场的韩国和日本对其制定了残留限量标准。韩国规定腈吡螨酯在茄子中最大允许残留量为2.0mg/kg；日本规定腈吡螨酯最大允许残留限量（MRL）分别为青辣椒（1.0mg/L）、茄子（0.7mg/L）、黄瓜（1.0mg/L）、桔子（0.02mg/L）、西瓜（0.05mg/L）、桃（0.1mg/L）、李子（0.2mg/L）、橙子和柠檬（2.0mg/L）、柑橘类（2.0mg/L）、梨（2.0mg/L）、草莓（3.0mg/L）、葡萄（5.0mg/L）、杏（5.0mg/L）、茶（60mg/L），在其余蔬菜和水果中均实行0.01mg/L的“一律标准”；欧盟对腈吡螨酯也实行0.01mg/L的“一律标准”。

迄今为止，未见国内外有关于食品中腈吡螨酯残留量检测方法的报道，因此建立简便、快速、能准确定性和定量分析蔬菜、水果和茶叶中腈吡螨酯残留量检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔬菜、水果和茶叶中腈吡螨酯残留量的测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种腈吡螨酯残留量的测定方法，包括如下步骤：

（1）提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠，振荡后离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在0.5～200μg/L范围内，配制至少5个浓度的腈吡螨酯系列浓度标准工作液。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中腈吡螨酯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中腈吡螨酯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中腈吡螨酯残留量。若上机溶液中腈吡螨酯残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液稀释至线性范围之内。

步骤（1）中样品若为脱水果蔬或茶叶，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb加入量分别为150mg、50mg、25mg和7.5mg。

步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。

步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	20-50	50-80
2	1.0	0-5	95-100
				3	5.0	0-5	95-100
4	5.1	20-50	50-80
				5	10.0	20-50	50-80

A和B的%是体积比例。

步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱（ESI）检测，电喷雾电压为+3500至+4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为9.0L/min。

步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，腈吡螨酯的母离子为394.0～394.4，子离子分别为310.0～310.4和253.9～254.3。

步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜、水果和茶叶中腈吡菌酯定性确证和定量检测，平均回收率为87.6%～94.5%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～6.4%，检出限低于0.42μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足韩国、日本、欧盟等国家对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为浓度为5.0ng/mL的腈吡螨酯多反应监测色谱图。

图2为桔子空白样品的多反应监测色谱图。

图3为以桔子为基质配制的腈吡螨酯标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器（IKA，Germany）；5810R离心机（Eppendorf，Germany）；MS3基本型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附剂（40～60μm）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）净化剂（40～60μm）、石墨化碳吸附剂（120～400μm）均购于美国安捷伦科技有限公司。

试剂：乙腈（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：100mg/L，乙腈配制，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

实施例1：桔子中腈吡螨酯残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的桔子10.0g于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mg C₁₈、50mg PSA和15mgCarb的的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心5min。取上清液过0.22μm滤膜后，待测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取10g桔子空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将100ng/mL标准溶液用乙腈稀释成10ng/mL标准中间液，标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行腈吡螨酯含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中腈吡螨酯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中腈吡螨酯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中腈吡螨酯残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，Eclipse plus C₁₈，2.1mm×100mm，粒径3.5μm；

流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵）；（B）乙腈；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	40	60
2	1.0	1	98
				3	5.0	1	98
4	5.1	40	60
				5	10.0	40	60

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；

电喷雾电压：+4000V；

雾化气压力：275.9kPa；

干燥气：氮气，350℃，流速为9.0L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：

对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3桔子空白基质中腈吡螨酯的标准曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				腈吡螨酯Cyenopyrafen	4.87	Y=15345.10X-7921.92	0.9999

加标回收率和重复性：

在不含腈吡螨酯的桔子中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的腈吡螨酯标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，腈吡螨酯的平均回收率为90.8%～94.5%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～5.2%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4腈吡螨酯的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的腈吡螨酯基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（桔子的浓缩倍数为0.5倍）计算检出限，腈吡螨酯的检出限为0.038μg/kg。

实施例2：茶叶中腈吡螨酯残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的茶叶1.0g于50mL离心管中，加入3mL水复苏30min后，准确加入20mL1%乙酸乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁、2g乙酸钠和2mL水，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mg C₁₈、50mg PSA和15mgCarb的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心5min，过0.22_μm滤膜于棕色进样小瓶，待LC-MS/MS测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取2g茶叶空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，过膜后用其稀释配制0.5、1、2、5、10、20、50ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

操作步骤、色谱和质谱条件与上述桔子样品中腈吡螨酯的测定一致。

定性鉴定：

同上述桔子样品中腈吡螨酯的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为Y=16946X-7401.2，相关系数为0.9997。

加标回收率和重复性：

在不含腈吡螨酯的茶叶中加入10、20、100和5000μg/kg4个浓度水平的腈吡螨酯标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，5000μg/kg添加浓度的样品待测液用1%乙酸乙腈稀释10倍后再用LC-MS/MS测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在4个加标水平上，腈吡螨酯的平均回收率为87.6%～93.5%，平均相对标准偏差（RSD）为4.3%～6.4%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表5腈吡螨酯的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的腈吡螨酯基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（茶叶的浓缩倍数为0.05倍）计算检出限，腈吡螨酯的检出限为0.42μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠，剧烈涡旋1min后离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22_μm有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中腈吡螨酯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中腈吡螨酯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中腈吡螨酯残留量；若上机溶液中腈吡螨酯残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

2.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中果蔬样品若为脱水果蔬或茶叶，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

4.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb加入量分别为150mg、50mg、25mg和7.5mg。

5.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈。

6.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

序号时间（min） A（%） B（%） 1 0 20-50 50-80

2 1.0 0-5 95-100 3 5.0 0-5 95-100 4 5.1 20-50 50-80 5 10.0 20-50 50-80

7.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈。

8.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500至+4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为9.0L/min。

9.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，腈吡螨酯的母离子为394.0～394.4，子离子分别为310.0～310.4和253.9～254.3。

10.根据权利要求1所述的一种腈吡螨酯残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中检测样液和基质标准工作溶液时，若样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。