CN103740728B - 稀有密码子改造的人znf580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稀有密码子改造的人ZNF580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体，稀有密码子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID No.1所示。本发明改造了人ZNF580基因中的稀有密码子，得到稀有密码子改造的人ZNF580基因，经实验证明改造的基因经原核表达，可以产生大量的ZNF580蛋白，因此解决了现有技术ZNF580基因在原核中表达不出来的难题；成功地表达并纯化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580蛋白作为抗原成功制备了多克隆抗体。

Description

稀有密码子改造的人ZNF580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是涉及一种改造的基因及其表达和应用。

背景技术

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是严重危害人类健康的常见病，是缺血性心脑血管疾病的重要病理基础。AS斑块的主要特征是病灶中细胞内及细胞外脂质聚集、单核/巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成、主动脉平滑肌增生以及结缔组织成分聚集。近些年来，随着人们生活方式和饮食结构的变化，AS所致的心脑血管疾病发病率在我国有上升趋势。AS是一种环境因素与遗传因素所诱发的多基因病，目前还缺少十分有效的治疗措施。应用分子生物学技术对心脑血管疾病患者和动物模型的大量研究，已经克隆出100多个AS相关基因，例如apoAI、apoB、apoCI、apoCⅡ、apoCⅢ、LPL、LCAT、CEPT、ABBP-1、Ath-1、Ath-2、Ath-6等等，并利用转基因及基因敲除动物证实它们的生理功能。然而，AS作为一种复杂的多基因病，牵涉到一个庞大的基因调控网络，其发病机制至今尚未完全阐明，随着人类及各种模式生物基因组序列测序的完成，未来一个重要的目标是阐明人体约3.5万个基因的功能。为了有效防治AS，有必要深入研究与AS相关基因的功能。血浆低密度脂蛋白（low densitylipoprotein,LDL）水平持续升高与动脉粥样硬化的发病率呈正相关，血管内皮细胞是AS形成及发展的始动环节。张文成等人以致动脉粥样硬化因素LDL诱导人脐静脉内皮细胞系ECV304，采用差异显示逆转录PCR技术进行分析，以差异表达的新ESTs为探针，筛选人主动脉cDNA文库，得到一个全长为1726bp的新基因cDNA全长（Genbank注册号：AF184939），该基因由人类基因命名委员会定名为ZNF580，ZNF580基因用SEQ ID NO.3所示。ZNF580基因cDNA748-1266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，该cDNA开放阅读框全长为519bp，编码172个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为18.7564kDa。经分子生物学网站进行蛋白质的功能基序分析：其氨基端5-88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三个串联重复的C2H2型锌指蛋白结构域，三个锌指符合C2H2型锌指蛋白基序CX2CX3FX5LX2HX3H（其中X代表保守性差的氨基酸）。多组织Northern杂交证实ZNF580基因在人多种组织中均有表达，其中在心肌、肾脏、胰腺组织中的表达量最高，大脑表达次之，在胎盘、肝脏、骨骼肌、肺组织中表达量较低。LDL诱导内皮细胞使ZNF580基因表达明显下调。ZNF580基因定位于人19号染色体19q13.42。将ZNF580编码区克隆到真核表达载体pEGFP-C1上，转染人胚肾上皮细胞系HEK293、胃癌细胞系MGC803进行瞬时表达，融合有绿色荧光蛋白EGFP的目的蛋白定位于细胞核。前期研究工作表明：ZNF580基因编码一种与AS相关的具有调控作用的C2H2型锌指核蛋白转录因子。检索基因表达数据库中有关ZNF580的相关信息显示，ZNF580受多条信号通路的调控，并通过调节靶基因的开关或转录水平参与细胞增殖、分化与凋亡等过程。为了深入研究ZNF580蛋白在基因表达调控及信号转导中的作用，有必要利用基因工程技术表达并纯化ZNF580蛋白，制备多克隆抗体，从而为研究ZNF580基因的功能奠定基础。

经过研究发现，完全按照人ZNF580基因开放阅读框序列进行基因工程操作，人ZNF580蛋白在原核中表达不出来。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的人ZNF580基因不能进行原核表达的不足，提供一种能在原核中表达的稀有密码子改造的人ZNF580基因。

本发明的第二个目的是提供用稀有密码子改造的人ZNF580基因进行原核表达产生的ZNF580蛋白。

本发明的第三个目的是提供用ZNF580蛋白制备的多克隆抗体。

本发明的技术方案概述如下：

稀有密码子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID No.1所示。

用SEQ ID No.1所示基因进行原核表达产生的ZNF580蛋白，所述ZNF580蛋白氨基酸序列由SEQ ID No.2所示，分子量约为18.7564kDa，等电点为10.13。

用ZNF580蛋白制备的多克隆抗体。

本发明的优点：

本发明改造了人ZNF580基因中的稀有密码子，得到稀有密码子改造的人ZNF580基因，经实验证明改造的基因经原核表达，可以产生大量的ZNF580蛋白，因此解决了现有技术ZNF580基因在原核中表达不出来的难题；成功地表达并纯化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580蛋白作为抗原成功制备了多克隆抗体。

附图说明

图1为ZNF580融合蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳（1：阴性对照：非IPTG诱导表达；2：阳性结果：IPTG诱导表达；3：MARKER：蛋白质标准）。

图2为不同诱导时间ZNF580融合蛋白表达SDS-PAGE电泳。（1：1.5h诱导表达结果；2：2.5h诱导表达结果；3：3.5h诱导表达结果；4：MARKER：蛋白质标准）

图3为亲和层析纯化ZNF580融合蛋白SDS-PAGE电泳。（1：MARKER：蛋白质标准；2：对沉淀进行亲和层析纯化；3：对上清进行亲和层析纯化；4：凝胶扩散法纯化ZNF580融合蛋白）

图4为肠激酶作用后纯化的ZNF580蛋白SDS-PAGE电泳。1：MARKER：蛋白质标准；2：纯化的ZNF580融合蛋白；3：肠激酶作用后凝胶扩散法纯化的ZNF580目的蛋白）

图5为多克隆抗体Western blot分析。（ZNF580为目的蛋白；GAPDH为内参照蛋白）

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

以人ZNF580cDNA为依据，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，并在确保表达蛋白质的氨基酸序列不变的情况下，进行了密码子改造，获得了稀有密码子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID No.1所示。

实施例2

一、材料与方法

1.1材料

PCR试剂盒，琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，大肠杆菌BL21（DE3），T4DNA连接酶及限制性内切酶等均购自大连宝生物工程有限公司。高纯度质粒小提试剂盒及肠激酶购自TIANGEN BIOTECH，His·band蛋白纯化试剂盒购自德国Novagen公司。

1.2方法

1.2.1构建表达质粒

根据所应用表达质粒pET30a的特性，设计相应的肠激酶序列及限制性内切酶位点，由上海生工生物技术服务有限公司进行全序列合成并连接到质粒pET30a中，命名为pET30a-ZNF580。成功地构建了原核表达载体pET30a-ZNF580。

1.2.2表达目的蛋白

1.2.2.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备

取5ml大肠杆菌BL21于5ml离心管中，冰浴10min。在4℃于4000g离心10min，弃尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl₂水溶液0.5ml重悬菌体。冰浴20min，在4℃以4000g离心10min，弃尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl₂水溶液0.2ml重悬菌体。于4℃放置16h备用。

1.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌BL21

取10μl重组质粒pET30a-ZNF580加入200μl大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴90s，加入37℃预热的不含卡那霉素的LB液体培养基800μl，37℃200rpm振荡培养1h，取200μl培养液均匀涂在含卡那霉素的LB固体培养基上，凉干后37℃倒置培养16h，结果出现抗性菌落。

1.2.2.3重组质粒的酶切鉴定

将长出的菌落分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中。在37℃140rpm振荡过夜。在作好标记的每个试管中取5ml菌液提质粒（按照高纯度质粒小提试剂盒操作进行）。

用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切鉴定，酶切反应如下：在灭菌的0.5ml Eppendorf管中加重组质粒DNA2μg，10×酶切缓冲液2μl，限制性内切酶Nco I和Xho I各1μl，最后加水至总体积为20μl，在37℃保温6h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果发现酶切片段与预期的片段长度大小一致，表明重组质粒转化到大肠杆菌BL21中。

1.2.2.4IPTG诱导表达

1.2.2.4.1从含有pET30a空质粒的阴性单菌落的平板上和步骤1.2.2.2获得的固体培养基上分别挑取含有pET30a空质粒的阴性单菌落和含重组质粒pET30a-ZNF580的阳性单菌落,，分别接种于6ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养过夜。

1.2.2.4.2分别将400μl含有重组质粒pET30a-ZNF580的菌液和含有pET30a空质粒的菌液接种于4ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600为0.96，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1mM，继续于30℃200rpm振荡3h，每隔30min收集含有pET30a-ZNF580的菌液0.5ml，观察随时间变化的表达情况，离心收集沉淀。

1.2.2.5SDS-PAGE电泳鉴定表达产物

取2.5ml的步骤1.2.2.4.1获得的含重组质粒pET30a-ZNF580的菌液，接种于250ml的含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600为0.96，加入IPTG至终浓度为1mM，继续于30℃200rpm振荡3h，10000g离心10min收集菌体，加入5ml结合缓冲液,超声破碎菌体（300W，每次10s，间歇20s，共20次），14000g离心20min。取上清和沉淀做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现预期表达产物存在于上清中。预期表达的蛋白分子量约为24.3kDa,经电泳可见24.3kDa处有明显的新生区带，表明成功表达了ZNF580融合蛋白（如图1）。于30℃200rpm振荡3.5h，分别在1.5h、2.5h和3.5h收集含有pET30a-ZNF580的菌液0.5ml，观察随时间变化的表达情况，结果表明诱导表达2.5h到3.5h，表达产物的量达到高峰（如图2）

1.2.3分离纯化重组蛋白

1.2.3.1采用His·band蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白

首先将上清用0.45μm的滤膜过滤，随后按下述方法制备层析柱，并进行纯化：

①树脂的准备与平衡

进行柱层析纯化之前需要准备：5倍体积1×离子化缓冲液，13倍体积1×结合缓冲液，6倍体积的1×漂洗缓冲液以及6倍体积的1×洗脱缓冲液。应用Novagen聚丙烯空色谱柱（货号69673-3），空柱首先加几毫升灭菌的去离子水，用一只手指（戴手套）轻推柱的上部，浸湿滤芯部分，使液体能正常流动。

②将HiS-Bind树脂轻柔颠倒彻底重悬树脂。用一个阔口吸头将2.5ml树脂悬液加入一个准备好的空色谱柱中，待树脂在重力作用下自然沉降。

③当树脂沉降、保存液的液面降至树脂表面时，按以下顺序清洗、离子化和平衡色谱柱；

A:3倍体积灭菌去离子水

B:5倍体积1×离子化缓冲液

C:3倍体积1×结合缓冲液

④待结合缓冲液下降至层析介质表面，小心加入步骤1.2.2.5获得的上清。

⑤10倍床体积1×结合缓冲液洗

⑥6倍体积1×漂洗缓冲液洗

⑦1倍体积1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白。

洗脱液分段收集，1ml收集一管。首先采用PAGE和SDS-PAGE进行电泳，观察蛋白分离情况，结果表明蛋白被纯化，然后对每管蛋白液进行定量测定，得出每管的蛋白（融合蛋白）浓度值,进行SDS-PAGE电泳，从凝胶中切下所需目的条带，可见ZNF580融合蛋白被纯化（如图3）。

1.2.3.2制备纯化的ZNF580蛋白

取融合蛋白1.5mg/ml加入10×缓冲液10μl，加入重组肠激酶3U，于23℃作用10h，进行SDS-PAGE电泳，电泳后,将凝胶条带冷冻后研碎，放入制备好的磷酸盐缓冲液100ml中，密封静置48h，4000rpm离心后，取上清冷冻，经真空干燥重新溶于缓冲液中，利用BCA法进行蛋白测定，结果蛋白浓度为1.2046mg/ml。蛋白纯化后做SDS-PAGE，可见ZNF580蛋白被纯化（如图4），纯化的蛋白分子量与预期的18.7564kDa相一致。

实施例3

一、制备多克隆抗体方法

1.1抗原准备

将实施例2获得的纯化的ZNF580蛋白，用pH=7.4的0.01M PBS将其稀释到0.5mg/ml。抗原乳化采用双注射器互推法。

1.2免疫程序

取4只新西兰兔，其中2只作为对照组，对照组用灭菌的三蒸水（使用量与实验组的体积相同），按下述实验组相同的免疫程序进行免疫。

1)取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

2)经一个月第二次免疫,取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

3)第二次免疫后的第10天进行第三次免疫，取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

4)第三次免疫后的第10天进行第四次免疫，取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

5)第四次免疫后1个月进行冲击免疫，取2ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），新西兰兔腹腔注射；

6)冲击免疫后的第3天，兔耳静脉采血液2ml，室温凝固后，分离血清，用琼脂扩散法测定多抗滴度。

7)冲击免疫后的第4天，新西兰兔颈动脉放血，收集血液，4℃放置过夜，待血块收缩后分离血清，分装保存。

1.3抗ZNF580多抗效价测定

多抗用ELSIA法测定效价

l)包被酶标板:用包被液稀释纯化的ZNF580蛋白至0.025μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。

2)封闭:次日用PBST洗涤液洗涤2次，每次2min,之后用10%小牛血清封闭液封闭酶标板，37℃水浴l h，PBST洗涤液洗涤。

3)加样:加入稀释过的多抗100μl/孔（稀释倍数见表1，多抗为本实施例步骤1.2中的7）获得的血清），37℃水浴2h，PBST洗涤液洗涤。

4)加二抗:加入1:4000的山羊抗兔IgG-HRP，37℃水浴45min，PBST洗涤液洗涤。

5)底物:分别加入显色液A和显色液B各50μl，37℃水浴15min。

6)终止:加入终止液100μl，酶标仪450nm读数。

二、结果

多克隆抗体效价的测定

纯化后的抗ZNF580蛋白的多抗用0.025μg/ml ZNF580蛋白包被的酶标板测定多克隆抗体的效价，用不同稀释倍数的抗ZNF580蛋白的多抗作为一抗，山羊抗兔HRP/IgG为二抗得结果如下，抗体效价在1/16000。

表1多克隆抗体效价的测定

多克隆抗体特异性的测定

经Western blot分析，结果发现，对照组家兔血清中不存在抗ZNF580蛋白的抗体，实验组家兔血清进行Western blot分析，在18kDa附近出现条带如图5，说明多克隆抗体具有很好的特异性，本实验成功制备了兔抗ZNF580蛋白的多克隆抗体。

Claims (1)

1.根据大肠杆菌对密码子的偏好性获得的稀有密码子改造的人ZNF580基因，其特征是SEQ ID No.1所示。