CN103740724A

CN103740724A - 一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1及其应用

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Publication number: CN103740724A
Application number: CN201410019304.2A
Authority: CN
Inventors: 李海燕; 王法微; 于洋; 杨晶; 董园园; 王南; 陈欢; 刘秀明; 姚娜; 管丽莉; 王艳芳; 杜琳娜
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: CN103740724B

Abstract

本发明公开了一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1，它是以塔城红花基因组DNA为模板，利用引物Oleosin-F：CTGCAGACCTTGCTCTTCGA，Oleosin-R：TCTAGACGAGAGAGATGAA，通过PCR方法获得。经实验证明是种子特异性的基因启动子，而红花油体蛋白启动子OleosinCT1驱动的目的基因只在植物种子中有较高的活性，进行高表达；而在根、茎、叶、花不表达，可适用于单子叶和双子叶植物。对改良作物种子性状以及植物种子生物反应器的发展具有重要作用。

Description

一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一个红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1及其在转基因植物中的应用。

背景技术

基因工程是在分子水平上对基因惊醒操作的复杂技术，它可以将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建重组DNA分子，然后导入活细胞以改变生物原有的遗传性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术已经成为现在农业领域改良作物形状、提高粮食品质的主要手段。植物的种子，尤其是油料和谷类作物的种子与人类的生产生活关系非常密切，因此，也成为植物基因工程中进行改良的重要目标材料。转化的外源基因在植物受体组织中能否正确、高效并按照人们的意愿特异地表达是人们非常关注的问题。外源基因在细胞中表达是基因工程的关键，而外源基因的表达首先取决于其转录的启动。所以，明确植物种子特异性启动子的调控机制及获得更多植物种子特异性启动子对作物改良研究及应用具有巨大的推动作用。

高等植物的基因表达调控是多级调控系统，包括转录前调控、转运调控、转录水平调控、转录后加工调控、转运调控、翻译水平调控和翻译后调控。在这些调控系统中，转录水平调控是重要环节。转化的外源基因能否在植物中表达，取决于转录能否被启动，在转录启动中启动子必不可少。启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可以将其分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导性启动子，其中种子特异性启动子具有显著地组织和发育时期的特异性，可以调控外源基因在植物种子种高效表达。利用种子特异性启动子，可以按照人们的意愿提高种子中部分营养物质的含量，改善粮食品质。

目前人们已经克隆并鉴定了大量种子特异性启动子，其中研究较多的是胚乳特异性谷蛋白基因启动子。谷蛋白占水稻种子储藏蛋白总量的70%~80%，早在1986年Takaiwa等就克隆了第一个水稻谷蛋白基因的cDNA。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会再食品加工过程中丢失。Datta等利用水稻谷蛋白特异启动子驱动八氢番茄红素合酶基因PSY，在水稻胚乳中成功合成维他命原A。

油体蛋白是镶嵌在油体上的结构蛋白，红花种子中油体的重量约占红花种子重量的50%以上，其中油体蛋白的含量可以占种子总重量的2-10%。

发明内容

本发明的目的是提供一种种子特异性的基因启动子，一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1。

一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1的制备方法：它是以塔城红花基因组DNA为模板，利用引物Oleosin-F：CTGCAGACCTTGCTCTTCGA，Oleosin-R：TCTAGACGAGAGAGATGAA，通过PCR方法获得。

一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的基因；

所述的一种植物表达载体，它是种子特异性表达载体；

一种表达载体pBI121-OleosinCT1，它是用如序列表SEQ ID No.1所示的基因替换了pBI121中的CaMV 35S。

所述的一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1在转基因植物方面的应用；

所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物；

所述的转基因植物，所转的基因在该转基植物的种子中特异性表达。

本发明提供了一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1，它是以塔城红花基因组DNA为模板，利用引物Oleosin-F：CTGCAGACCTTGCTCTTCGA，Oleosin-R：TCTAGACGAGAGAGATGAA，通过PCR方法获得。经实验证明是种子特异性的基因启动子，而红花油体蛋白启动子OleosinCT1驱动的目的基因只在植物种子中有较高的活性，进行高表达；而在根、茎、叶、花不表达，可适用于单子叶和双子叶植物。对改良作物种子性状以及植物种子生物反应器的发展具有重要作用。

附图说明

图1为红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1的PCR检测，M：DNA Marker DL2000；1、2、3为启动子PCR产物。

图2为红花油体蛋白基因定量PCR分析，5DAF、10DAF、15DAF、20DAF、25DAF与30DAF分别代表开花5、10、15、20、25与30天后的种子。

图3为油体蛋白基因启动子与GUS融合表达载体图。

图4为GUS活性检测结果。

具体实施方式

实施例1 提取塔城红花基因组DNA

将红花“塔城红花”（购买于新疆塔城）种子播在装好砂的营养钵中，放在智能人工气候室中适当的条件下培养。取生长2周的红花幼苗嫩叶，按照植物基因组DNA小量提取试剂盒进行提取红花油体蛋白基因组DNA。提取步骤如下：

（1）在 65℃水浴中预热buffer S1，同时预热洗脱缓冲液（EB）。

（2）取适量鲜嫩的红花叶片，在液氮中充分碾磨。

（3）转移研磨成功的细粉（约100mg）到一个新的的1.5ml EP管中，加入550μL 65℃预热buffer S1和7μL RNA酶，涡旋震荡至完全混合，室温条件下静止放置10分钟。

（4）在离心管中加入130 μL的buffer S2，需要涡旋震荡至完全混合，放入离心机内12000 rpm离心5 分钟。

（5）吸取上清置于蓝色分离柱A中，12000 rpm 离心1分钟，收集下液。

（6）加入1.5倍体积buffer S3后立即缓慢的上下颠倒数次至充分混合。

（7）将已得混合物（包括可能出现的白色絮状沉淀）加入至白色吸附柱AC中，12000 rpm离心1分钟，弃废液。

（8）加入700 μL 漂洗液WB，12000 rpm 离心1分钟，弃废液。

（9）重复步骤（8）一次。

（10）将吸附柱AC放回收集管中，12000 rpm 离心30秒。

（11）将吸附柱AC置于无核酸酶的EP管中，用事先预热的洗脱缓冲液EB洗脱，室温放置1-2分钟，12000 rpm 离心30秒，收集红花基因组DNA。

实施例2 红花油体蛋白基因启动子的克隆

以红花基因组DNA为模板，利用引物Oleosin-F（CTGCAGACCTTGCTCTTCGA）与Oleosin-R（TCTAGACGAGAGAGATGAA）对OleosinCT1启动子进行克隆，PCR体系见表1，PCR程序为94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，延伸2分钟，共进行35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，连接克隆载体pEASY-T1（购自全式金生物技术有限公司）生成pEASY-OleosinCT1后进行测序，测序结果见SEQ ID No.1。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例3 红花油体蛋白基因的表达分析

（1）提取红花根、茎、叶、花及不同发育时期种子的总RNA

将收集的红花根、茎、叶、花与不同时期的种子在液氮作用下研磨成白色粉末状，称量约100mg置于1.5 ml Eppendorf管中，加入1ml的裂解液RL后匀浆。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE003

将匀浆后的样品涡旋混匀以使核蛋白分解，在室温条件下放置5分钟，以使分解完全。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE004

在4℃条件下将样品12000 rpm离心10分钟，之后转移到一个新的RNase free的离心管中。加入0.2 ml的氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE005

在4℃条件将样品12000 rpm离心10分钟，将分三层的样品中间和上层的水相层转移到新的离心管中。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE006

加入相同量约600 uL70%乙醇，上下翻转混匀。将混合均匀的溶液及可能出现的沉淀一起转入装有吸附柱RA的收集管中。将收集管中样品室温下10000 rpm离心45秒，弃掉废液。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE007

将500 μL的去蛋白液RE加入管中，室温下12000 rpm离心45秒，弃掉废液。

将700μL漂洗液RW加入管中，室温下12000 rpm离心60秒，弃掉废液。

将500μL漂洗液RW加入管中，室温下12000 rpm离心60秒，弃掉废液。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE010

别避免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应，将吸附柱RA重新放回空收集管中，在室温下12000 rpm离心2分钟，尽量排除漂洗液的影响。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE011

准备一个新的RAase free 离心管，将吸附柱RA放入其中，根据RNA产量，在吸附膜的中间部位加入50-80μL 先预热（65-70℃）好的RNase free water，室温下放置2分钟，然后用离心机12000 rpm离心60秒。

（2）将RNA反转录为cDNA

按照表2所列体系进行反转录反应：

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE012

将反应混合物置于65℃温浴5分钟，之后置于冰上骤冷。

在上述反应后的PCR管中按照表3的体系加入以下反转录反应液。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE013

将反应液置于45℃水浴中50分钟，然后再移至70℃的水浴中反应10分钟。最后冰上冷却后保存于-20℃中备用。

（3）红花油体蛋白基因的荧光定量PCR分析

荧光定量PCR反应体系见表4，其中RT-F序列为5'-TTCATCCTCTTCAGCCCCATC-3'，RT-R序列为5'-GCAGTTGACCAGGAACGACAA-3'。

Figure 2014100193042100002DEST_PATH_IMAGE014

荧光定量PCR反应程序为94℃预变性30秒，94℃变性30秒，60℃退火及延伸15秒，阅读每孔荧光值。反应共进行40个循环，最后计算每个样品的溶解曲线。荧光定量PCR结果显示油体蛋白基因在根、茎、叶、花中均没有表达，只有在发育中的种子种有表达，并且在花后20天的种子中表达量最高（见图2）。

实施例4 红花油体蛋白基因启动子表达载体的构建及转化拟南芥

（1）表达载体的构建

将含有OleosinCT1的克隆载体（pEASY-OleosinCT1）与表达载体pBI121同时使用Pst I与Xba I进行酶切，分别回收目的基因与载体大片段，在DNA连接酶的作用下进行连接，得到表达载体pBI121-OleosinCT1。将空载体即pBI121-CaMV 35S与pBI121-OleosinCT1分别转化至农杆菌EHA105中，用于浸染拟南芥。

（2）转化拟南芥

种植拟南芥，待出苗2周后移栽至准备浸染的营养钵中。

当拟南芥抽薹大约2英寸的时候，同时剪掉在同一营养钵里的所有主茎，从而能够发出更多的茎。

培养含有目的基因的农杆菌菌液，待菌液生长至OD值为1左右的时候收集菌体，并使用无菌水溶解至OD值为0.8，用于浸染拟南芥。

将待浸染的拟南芥中已经开的花剪掉，将剩余的为开花的拟南芥倒置与含有农杆菌菌液的烧杯上，使拟南芥花部完全浸没在农杆菌菌液中，浸染5-8分钟。

将浸染后的拟南芥平放至托盘中，并且密封保湿，置于黑暗处放置两天。

将拟南芥放于正常培养条件下生长，直至收取种子。

使用Kam霉素筛选阳性转基因植株后，用于GUS活性分析。

实施例5 GUS活性的荧光测定

分别将两种转基因拟南芥种植于营养钵中，分别取根（25天）、叶（25天）、茎（50天）、花和成熟种子约0.1g并在液氮中研磨，将其在300 μL裂解缓冲液中悬浮；4℃下12000 rpm离心10分钟，上清液即为含有GUS的植物可溶性总蛋白。参照Bradford（1976）的方法，将20 μL总蛋白与620 μL考马斯亮蓝G250溶液混合，用紫外分光光度计测定595 nmg光吸收值，从而来计算总蛋白的浓度。

GUS活性测定参照Jefferson等（1987）的方法，分别取3 μL各组织的总蛋白与30 μL 1mM MUG混合，37℃中反应30分钟，向反应液中加入270 μL 0.2 M Na₂CO₃终止反应。荧光检测使用的激发光波长为365 nm，发射波长为455 nm。GUS活性用GUS检测时获得的荧光值除以蛋白浓度，从而得到的相对活性来表示。结果显示CaMV35S启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶、花与种子种均有较高的活性，而红花油体蛋白启动子OleosinCT1驱动的GUS基因只在种子种有较高的活性，并且该活性略高与CaMV35S启动子驱动的GUS活性（33.5vs28.9）。这些均证明了红花油体蛋白启动子OleosinCT1为种子特异性启动子，并且它可以驱动目的基因在种子中进行高表达。

<110> 吉林农业大学

<120>一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 塔城红花

<400> 1

caguguuugg cagaggugua uggagugaga gaagggaaag gguauuuucc gauucugucg 60

accttgctct tcgaggcttg tgggtaaggg acgaggaggg ccttctcgcc ggtggggacg 120

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tttttcaatt ttaaaattta tacttacaat ttacaaatat ccgacttttt atttgttacc 600

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gctcgacggg ctcagcgggt ttcgctatgc cttcagcgga ctggacggtt ccaaaggatg 900

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ttacctataa gtacacttgt agccctaaac ttatatttct cacactaatt tcatctctct 1080

cg 1082

Claims

1.一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1的制备方法：它是以塔城红花基因组DNA为模板，利用引物Oleosin-F：CTGCAGACCTTGCTCTTCGA，Oleosin-R：TCTAGACGAGAGAGATGAA，通过PCR方法获得。

3.一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如序列表SEQ ID No.1所示的基因。

4.根据权利要求3所述的一种植物表达载体，其特征在于：它是种子特异性表达载体。

5.一种表达载体pBI121-OleosinCT1，它是用如序列表SEQ ID No.1所示的基因替换了pBI121中的CaMV 35S。

6.权利要求1所述的一种红花油体蛋白基因启动子OleosinCT1在转基因植物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述的转基因植物，所转的基因在该转基植物的种子中特异性表达。