CN103735550A

CN103735550A - 一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物及其应用

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Publication number: CN103735550A
Application number: CN201310724773.XA
Authority: CN
Inventors: 唐琦; 张黎明; 邬碧波; 梅长林; 芦怡舟; 郝晓萍; 俞勇; 贺云岚; 俞华; 叶晟
Original assignee: SHANGHAI CITY ZHABEI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL
Current assignee: SHANGHAI CITY ZHABEI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-12-25
Also published as: CN103735550B

Abstract

本发明涉及一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物及其应用。所述的药物组合物含有左卡尼汀和曲美他嗪，左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为（77-81）:1，优选80:1，其还含有常规药用载体。本发明通过研究特定用药剂量下不同比例左卡尼汀和曲美他嗪联用对于CKD大鼠心、肾功能和组织病理学改变，以及其对心肌能量代谢的影响，发现左卡尼汀、曲美他嗪重量比在（77-81）:1的范围内对CKD大鼠左心室后壁肥厚、心肌间质纤维化改善效果最为明显，CKD大鼠心肌能量代谢明显提高，炎症、氧化应激也得到显著改善，心脏病理评分及肾脏病理GSI、TIS评分显著下降，从而显著减轻了慢性肾脏病心肌损伤。

Description

一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物及其应用

【技术领域】

本发明涉及医药组合物技术领域，具体地说，是一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物及其应用。

【背景技术】

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）常伴发心血管疾病（cadiovascular disease，CVD），CVD已成为CKD患者死亡的主要原因之一。轻度肾功能减退患者即使无传统的CVD风险因素，其CVD的发生率和病死率也明显增加。实际上很多慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）患者在进入透析前已死于心血管并发症。CKD患者的CVD主要表现为两大类：心肌病、动脉血管疾病。CKD心肌病的主要病理表现之一：心肌间质纤维化。CKD时多种因素会促进心肌尤其是左心室血管周围区域的纤维化。CKD心肌病的另一个主要病理表现：心室重塑（ventricular remodeling）。心室重塑是指心室结构的改变，导致心室肌重量、心室容量的增加和心室形态的变化，包括心肌细胞肥大、坏死并纤维化、细胞外基质量和成分变化以及心肌间血管的变化，而左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）是心室重塑最重要的病理改变。

曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）为3-酮脂酰CoA硫解酶抑制剂，使用后可抑制心肌细胞内脂肪酸氧化产能，葡萄糖氧化代谢成为其主要供能方式，由此氧更经济地被利用。另外，曲美他嗪使游离脂肪酸代谢产生的乙酰辅酶A减少，从而激活丙酮酸脱氢酶复合体，间接使葡萄糖氧化代谢得到加强。但是，曲美他嗪在增强葡萄糖氧化的同时抑制脂肪酸的氧化分解，致使游离脂肪酸在体内堆积，在缺氧条件下进入肝脏生成大量酮体等物质，其对心肌细胞可产生毒性作用。因此，在心肌氧供减少时，尽可能地减少由于游离脂肪酸堆积产生的酮体等物质对心肌细胞的毒性作用，对保护心肌细胞也具有非常重要的意义。左卡尼汀（L-carnitine，LCRA）的主要功能是促进脂类代谢，作为长链脂肪酰基的载体，将长链脂肪酸从线粒体膜外运到膜内，完成β-氧化，从而减少了因游离脂肪酸堆积致在体内产生过多的酮体等物质对心肌细胞的毒性作用，并且加速ATP的生成。

2011年5月，第二军医大学硕士学位论文《改善心肌能量代谢对慢性肾衰竭大鼠左心室重塑的影响》，观察了左卡尼汀、曲美他嗪单药以及其联合应用治疗CKD大鼠后CKD大鼠心、肾功能和组织病理学改变，以及其对心肌能量代谢的影响。实验发现曲美他嗪、左卡尼汀均可通过改善CKD大鼠的心肌能量代谢、微炎症状态及氧化应激，以达到延缓CKD大鼠左心室肥厚、心肌间质纤维化的作用；两药联合治疗效果在各方面均优于单药应用，提示左卡尼汀及曲美他嗪在改善CKD大鼠左心室肥厚方面具有协同作用，这为临床合理用药提供了重要的实验依据。

为进一步指导曲美他嗪、左卡尼汀联合用药在临床上的应用，在控制用药剂量的前提下发挥最大的协同作用，则需要对曲美他嗪、左卡尼汀的合适用药比例进行研究。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物。

本发明的再一的目的是，提供上述药物组合物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物，含有左卡尼汀和曲美他嗪，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为（77-81）:1。

优选地，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为（78-81）:1。

更优选地，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为80:1。

所述的药物组合物还含有常规药用载体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的药物组合物在制备治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物中的用途。

本发明优点在于：

本发明通过研究特定用药剂量下不同比例曲美他嗪和左卡尼汀联用对于CKD大鼠心、肾功能和组织病理学改变，以及其对心肌能量代谢的影响，发现左卡尼汀、曲美他嗪重量比在（77-81）:1的范围内对CKD大鼠左心室后壁肥厚、心肌间质纤维化改善效果最为明显，心肌能量代谢明显提高，炎症、氧化应激也得到显著改善，心脏病理评分及肾脏病理GSI、TIS评分显著下降，从而显著地减轻了慢性肾脏病心肌损伤。

【具体实施方式】

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 本发明药物组合物治疗慢性肾脏病心肌损伤的动物实验

一、CKD大鼠模型的建立

1造模前处理

购买清洁级雄性SD大鼠，饲养温度为23℃±2℃，湿度60%，每12h交替照明，予标准饲料喂养，自由饮水饮食。适应性饲养1周后，随机分为手术组和sham组，进行造模。

2造模

2.1左肾2/3切除术

麻醉采用7.5％水合氯醛（5ml/kg）腹腔麻醉，将大鼠用橡皮筋固定于鼠板，剪去背毛，消毒，手术在严格无菌条件下，于左侧背部下极肋骨向下一横指处沿肋骨方向切口，钝性分离背部肌肉，暴露左侧肾脏，分离肾脏周围脂肪组织，剥离肾包膜，动脉夹夹闭左侧肾动脉，切除左肾上下极各1/3的组织，明胶海绵（或止血纱布）压迫止血后松开动脉夹，观察无活动性出血，皮下及皮肤逐层缝合后皮肤消毒，待动物麻醉清醒后放入笼内继续饲养。

2.2右肾全切术

1周后再次手术，麻醉固定同前。在严格无菌条件下，于右侧背部下极肋骨向下一横指处沿肋骨方向切口，钝性分离肌肉，暴露右侧肾脏，分离肾脏周围脂肪组织，剥离肾包膜，用缝合线结扎右侧肾蒂，摘除右肾，观察无活动性出血，逐层缝合后皮肤消毒，待动物麻醉清醒后放入笼内继续饲养。sham组大鼠同样进行两期手术，仅剥离肾包膜，不做肾切除。

3造模判定

造模前、造模后1周收集大鼠24h尿液，并外眦静脉采血，测定血肌酐（creatinine，Scr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）。若造模后测定值高于sham组（P<0.05），且24h尿蛋白≥10mg/24h，则认为CKD大鼠模型建立成功。

二、动物分组及给药方式

CKD大鼠模型随机分为联合治疗组一、联合治疗组二和联合治疗组三，各组20只。

表1 实验动物分组及干预药物剂量表

造模成功后1周，各治疗组大鼠每日定时按剂量等容灌胃给药，持续17周。在给药1周和17周时，分别收集大鼠24h尿液，并外眦静脉采血。所有大鼠在实验结束时即给药第17周，先行心脏超声检查及血流动力学监测，再解剖取心脏、肾脏标本。

三、指标测定

1、生存率

计算各组生存率：生存率（%）＝（实验结束时仍存活的各组入组大鼠/每组大鼠总数）×100%。

2、尿蛋白检测

（1）将大鼠按编号放入代谢笼中，禁食24h，不禁水，放入200μl甲苯防腐，24小时后分别测量各大鼠的尿量（ml），并收集1ml尿液；

（2）用双蒸水溶解BSA，分别配置成10mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml纯双蒸水的5个标本品各1ml；

（3）将标准品分别取20μl加入装有1ml考马斯亮蓝的专用量杯中，放入分光光度计中调零并测定相应的蛋白浓度，并制成标准曲线；

（4）将大鼠新鲜尿液标本以3000rpm/min×10min离心，取上清20μl，分别加入1ml考马斯亮蓝的专用量杯中，放入分光光度计中测定相应的蛋白浓度；

（5）计算各样本的24h蛋白总量（mg/24h）。

3、尿素氮检测

配制10mmol/L BUN标准应用液。按照以下步骤检测尿素氮：

。

4、肌酐检测

（1）样本前处理：取血清0.2ml加入钨酸蛋白沉淀剂2ml中，充分混匀，3000rpm/min×10min，取上清；

（2）操作表：

。

混匀，37℃水浴10min，取出后流水冷却，1cm光径，510nm波长，空白管调零；

（3）计算

血清肌酐（μmol/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）×标准管浓度（10μmol/L）×11。

5、心肌能量代谢指标检测

新鲜心肌组织块约100mg，迅速置于液氮中，然后放入预冷的HClO₄中剪碎、匀浆。冰上放置5min破细胞膜。12,000rpm、4℃离心20分钟。取上清200μl加入适量1mol/L K₂CO₃充分混和，调整体系pH值在6.5~ 7.0之间，于冰上放置5min。112,000rpm、4℃离心10min。取上清液20μl于高压液相色谱仪分离并测定，根据洗脱峰面积和标准品浓度（绝对浓度在5~8ng之间）来计算ATP、ADP含量，结果以μmol/g·wt表示。色谱条件：色谱柱hypersil 18，5u，4.6×250mm。流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0），流速0.9ml/min，恒速洗脱。紫外检测波长254nm，灵敏度0.01 AUSF。

6、炎症因子和氧化应激指标检测

采用ELISA法测定大鼠血液中IL-6含量、SOD活性、MDA含量。

7、血流动力学测定

以7.5％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台，剪去左侧腹股沟处毛，消毒，经左侧股动脉插入充满肝素化生理盐水的PE10导管至低位腹主动脉，用于血压监测，血流动力学信号经放大转换后由计算机实时记录每一搏的SBP、DBP、HR，计算出MBP。

8、心脏超声测定

以7.5％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台，胸部备皮，应用超声心动仪进行超声检测，测定左室长轴切面左室舒张末期内径(end-diastolic left ventricular internal diameter, LVID;d)，左室收缩末内径(end-systolic left ventricular internal diameter, LVID;s)，左室舒张末期前壁厚度(end-diastolic left ventricular anterior wall , LVAW;d)，左室收缩末期前壁厚度(end-systolic left ventricular anterior wall , LVAW;s)，左室舒张末期后壁厚度(end-diastolic left ventricular posterior wall , LVPW:d)，左室收缩末期后壁厚度(end-systolic left ventricular posterior wall , LVPW:s)，左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和缩短分数(fractional shortening,FS)。

9、心脏病理

沿垂直于心脏长轴的方向剪开左心室，上半部分左心室放入中性甲醛，制成石蜡切片并染色，由病理科专家在200倍光镜下单盲评分：(1)心肌纤维有无肥大、变性、坏死；(2)间质有无充血、水肿、炎细胞浸润、结缔组织增生；(3)心内膜、心外膜有无充血、水肿、炎细胞浸润。各种病变按由轻到重的程度分别评分为1、2、3、4分，无病变为0分，累加每组每只动物所有分数，进行统计学处理。

10、肾脏病理和评分

将大鼠肾脏制成组织标本并Masson染色，由病理专家进行单盲评分。

肾小球硬化程度评分(GSI)是在200倍光镜下，每张切片至少观察30个完整肾小球，根据硬化灶所占肾小球比例分0～4级：0级：正常；1级：病变面积< 25%；2级：病变面积25%～50%；3级：病变面积51%～75%；4级：病变范围>75%。计算GSI=〔(1×n1 + 2×n2 + 3×n3＋4×n4) /每片肾小球总数〕×100%（n1为评分1级的肾小球个数，n2为评分2级的肾小球个数，n3为3级的肾小球个数，n4为4级的肾小球个数）。

肾小管-间质损伤评分(TIS)包括肾小管萎缩、间质炎细胞浸润及间质纤维化。200倍光镜下，每张切片随机选择20个皮质区视野，病变程度分为6级：0级：正常；1级：病变范围<10%；2级：病变范围 11%～25%；3级：病变范围 26%～50%；4级：病变范围 51%～75%；5级：病变范围>75%。肾小管-间质病变范围指上述种病变范围的总和。

四、数据处理

实验结果以均数±标准差表示，应用SPSS version 11.5统计分析软件进行资料分析，多组间两两比较采用单因素方差分析对实验结果进行统计学处理。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01为统计学意义显著。

五、实验结果

1、生存率

联合治疗组一生存率为80%，联合治疗组二生存率为80%，联合治疗组三生存率为70%。将死亡的大鼠进行尸体解剖，联合治疗组一2只大鼠系由肠梗阻导致死亡，其余大鼠均死于尿毒症。

2、24小时尿蛋白定量

各治疗组给药17周尿蛋白排泄水平较给药1周均有统计学差异（P<0.01）；给药1周、给药17周，同期治疗组间比较尿蛋白排泄水平无统计学差异（P>0.05）。

3、肾功能

各治疗组给药17周Scr水平较给药1周均无统计学差异（P>0.05）；给药1周、给药17周，同期治疗组间比较BUN、Scr水平无统计学差异（P>0.05）。

4、心肌能量代谢指标

给药17周，各组大鼠心肌组织中的ATP、ADP水平如表2所示。表中数据表明，联合治疗组二ATP以及ADP水平较联合治疗组一和联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05）。而联合治疗组一的ATP、ADP水平与联合治疗组三比较无统计学差异（P>0.05）。

表2 各组大鼠ATP、ADP

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

5、炎症因子和氧化应激指标

5.1 IL-6

给药17周，联合治疗组二IL-6水平较同期联合治疗组一及联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05），而联合治疗组一和联合治疗组三间比较无统计学差异（P>0.05）。

表3 各组大鼠IL-6

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

5.2 SOD

给药17周，联合治疗组二SOD水平较同期联合治疗组一及联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05），而联合治疗组一和联合治疗组三间比较无统计学差异（P>0.05）。

表4 各组大鼠SOD

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

5.3 MDA

给药17周，联合治疗组二MDA水平较同期联合治疗组一及联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05），而联合治疗组一和联合治疗组三间比较无统计学差异（P>0.05）。

表5 各组大鼠MDA

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

6、血流动力学

给药17周，各组大鼠心率无统计学差异（P>0.05），说明各组大鼠在同样的麻醉状态下进行收缩压、舒张压和中心动脉压的测定。各治疗组收缩压、舒张压及平均动脉压比较无统计学差异（P>0.05）。

表6 各组大鼠血压、心率

7、心脏超声

治疗17周，联合治疗组二LVPW;d、LVPW;s水平较同期联合治疗组一及联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05），而联合治疗组一和联合治疗组三间比较无统计学差异（P>0.05）。除LVPW;d和LVPW;s外，其余各项心脏超声指标三组之间比较，均无统计学差异（P>0.05）。

表7 各组大鼠心脏超声指标

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

8、心脏病理和肾脏病理

Massson染色显示，联合治疗组二可见心肌细胞形态排列基本正常，胶原组织增生不明显，心肌间质无明显纤维化，心肌病理评分最低，相比于联合治疗组一及联合治疗组三均有统计学差异（P<0.05）。联合治疗组二的肾脏病理GSI、TIS评分均为最低，与联合治疗组一及联合治疗组三相比均有统计学差异（P<0.05）。

表8 各组大鼠心肌、肾脏病理评分

*表示与联合治疗组二比较，P<0.05。

实施例2 本发明药物组合物片剂制备

1、按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分：左卡尼汀302.22mg，曲美他嗪3.78mg，乳糖70mg，硬脂酸镁3mg，聚乙烯吡咯烷酮7mg。

2、按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分：左卡尼汀302.27mg，曲美他嗪3.73mg，乳糖70mg，硬脂酸镁3mg，聚乙烯吡咯烷酮7mg。

3、按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分：左卡尼汀302.08mg，曲美他嗪3.92mg，乳糖70mg，硬脂酸镁3mg，聚乙烯吡咯烷酮7mg。

实施例3 本发明药物组合物胶囊剂制备

1、按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：左卡尼汀302.22mg，曲美他嗪3.78mg，乳糖70mg，玉米淀粉25mg，硬脂酸镁1mg，聚乙烯吡咯烷酮4mg。

2、按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：左卡尼汀302.27mg，曲美他嗪3.73mg，乳糖70mg，玉米淀粉25mg，硬脂酸镁1mg，聚乙烯吡咯烷酮4mg。

3、按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：左卡尼汀302.08mg，曲美他嗪3.92mg，乳糖70mg，玉米淀粉25mg，硬脂酸镁1mg，聚乙烯吡咯烷酮4mg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物组合物，含有左卡尼汀和曲美他嗪，其特征在于，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为（77-81）:1。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为（78-81）:1。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的左卡尼汀和曲美他嗪的重量比为80:1。

4.根据权利要求1-3任一所述的药物组合物，其特征在于，它还含有常规药用载体。

5.权利要求1-3任一所述的药物组合物在制备治疗慢性肾脏病心肌损伤的药物中的用途。