CN103733998B - 一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，包括：1）从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理；2）无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1℃，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5；3）将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1℃，光照时间为12h/天，光照强度为2500lx，25天继代增殖一次，即可；其中，增殖培养基为：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5。本发明以花梗为外植体进行愈伤组织的分化及增殖培养，先经过30天的诱导培养，愈伤组织的分化率较高，达到90%；然后经过25天的继代增殖培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8，具有很好的实用性。

Description

一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法。
背景技术
桂花（Osmanthus fragrans Lour.），亦称山桂、岩桂、九里香、木犀，木犀科木犀属的代表种，常绿灌木至小乔木。它不仅是我国的十大传统名花之一，而且集绿化、美化、香化为一体，属观赏和实用兼具的优良园林、经济树种，深受我国人民的喜爱。
雨城丹桂（Osmanthus fragrans ‘Yucheng Dan’）是丹桂品种群中的一个优良品种，常绿大灌木，树冠卵形，花期9月中旬，着花繁密花冠斜展，花色橙红香味中等，观赏性极佳。此外环境适应性强，耐高温较耐寒，对土壤的要求不太严格，生长速度快，种植范围广，如此之多的优点使之在丹桂家族中成为珍贵的品种。
以往桂花的繁殖多以嫁接为主，扦插、压条为辅，繁殖系数小；播种繁殖存在生理后熟等原因，不能满足生产上的需要；而雨城丹桂花冠雌蕊退化，花后不结实，采用何种途径使之快速繁育成为很有价值的研究方向。组织培养作为新兴的生物繁殖技术，不但繁殖系数大，还能保持品种的优良性状，同时也是高等植物细胞工程、基因工程和改良的重要基础之一，可以短时间获得大量植物材料，从而使雨城丹桂得到快速繁殖与推广。而目前关于雨城丹桂组织培养快繁体系研究的内容较少，还不能满足使用需求。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，为短时间内获得大量雨城丹桂小苗提供了科学的培养基配方，丰富了雨城丹桂这一珍贵的桂花品种的组织培养快繁方法，为以后的相关研究提供一些借鉴和参考意义。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，包括以下步骤：
1）从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理；
2）无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1℃，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5；
3）将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1℃，光照时间为12h/天，光照强度为2500lx，25天继代增殖一次，即可；其中，增殖培养基为：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH 5.5。
步骤1）中，从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡1小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，再用无菌水仔细冲洗5遍。
步骤2）中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5。
采用诱导及分化培养基B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L，这种激素配比的培养基配方，经过30天的培养，愈伤组织的分化率较高，达到90%，而且整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡黄白色颗粒，状态较好。
采用增殖培养基为B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L，这种激素配比的培养基配方，经过25天的培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8。
有益效果：与现有技术相比，本发明的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，以花梗为外植体进行愈伤组织的分化及增殖培养，采用诱导及分化培养基B5+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.05mg/L进行诱导，经过30天的培养，愈伤组织的分化率较高，达到90%，而且整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡黄白色颗粒，状态较好；采用增殖培养基为B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L进行继代增殖，经过25天的培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8，具有很好的实用性，可为后期的丛生芽诱导和基因改良工作提供大量的实验材料。
附图说明
图1是雨城丹桂花梗愈伤组织分化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
本实施例的雨城丹桂，以幼嫩花梗为外植体的愈伤组织分化及增殖，是先从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，后进行消毒处理，然后将其在无菌操作台上接种于事先配好的分化培养基上，1个月后将已分化的愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行增殖。
1）新鲜外植体的选取与消毒灭菌
从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡1小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，再用无菌水仔细冲洗5遍。
2）无菌培养基的制备
诱导及分化培养基：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L，pH调至5.5，蔗糖30g/L，琼脂6.8g/L。
增殖培养基为：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L，pH调至5.5，蔗糖30g/L，琼脂6.8g/L。
培养基分装后尽快将培养瓶口密封，并及时放入高压灭菌锅内进行消毒灭菌。灭菌条件为121℃、0.1MPa下灭菌15分钟，灭好的培养基从高压锅中取出后，放入干净的准备室中让其自然冷却凝固。
3）接种
将灭菌后的花梗在无菌条件下剪掉两端成0.5cm左右的小段，接种于诱导及分化培养基上，每瓶接种5个材料。
4）培养
将接种后的培养瓶放入培养室进行愈伤组织的分化，条件为：温度25±1℃，全黑暗处理，30天后统计诱导率分别为90%（B5+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.05mg/L）和80%（B5+6-BA3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L）。其中，该诱导率为成功诱导出愈伤的花梗与花梗总接种数的比值。
30天后发现，如图1所示，整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡绿色或浅黄绿色的颗粒，状态较好。有些花梗基部和周围都形成淡绿色或浅黄绿色的颗粒或团状物质，经鉴别为分化形成的愈伤组织，这些花梗就是用此分化培养基成功诱导出愈伤的花梗，
一个月后将分化良好的愈伤组织转于继代增殖培养基中，条件为：温度25±1℃，光照时间为12h/天，光照强度为2500lx，30天后统计增殖系数达1.8。其中，增殖系数的计算公式为：
增殖系数=（增殖后愈伤组织重量—增殖前愈伤组织重量）/增殖前愈伤组织重量。
对比实施例1
方法同实施例1，其中，诱导及分化培养基分别为：MS+6-BA2mg/L+2,4-D0.05mg/L、B5+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.00mg/L，30天后统计诱导率仅为20%、50%，同发明中的诱导率达90%差距较大。
对比实施例2
方法同实施例1，其中，增殖培养基为B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.10mg/L，实验步骤同本发明，30天后统计增值系数仅为0.9，同发明中的增值系数达1.8差距较大。
因此，本发明的结果为：以幼嫩花梗为外植体接种于诱导及分化培养基：B5+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.05mg/L中，30天后统计诱导率达90%；将已分化的愈伤组织接于增殖培养基：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L中，30天后统计增值系数达1.8。
以上实施例中，B5和MS均为基本培养基，其配方参照分子生物学实验手册。其中，B5培养基配方为：150mg/L NaH2PO4·H2O、3000mg/L KNO3、150mg/L CaCl2·2H2O、134mg/L (NH4)2SO4、250mg/L MgSO4·7H2O、37.3 mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4·7H2O、10mg/L MnSO4·7H2O、2mg/L ZnSO4·7H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、0.75mg/L KI、0.25mg/L Na2MoO·2H2O、3mg/L H3BO3、0.025mg/L CuSO4·5H2O、10mg/L维生素B1、1.0mg/L维生素B6、2.0mg/L甘氨酸、1.0mg/L烟酸、100.0mg/L肌醇、30g/L蔗糖，pH5.5。

Claims (3)

1.一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理；
2)无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1℃，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0～3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5；
3)将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1℃，光照时间为12h/天，光照强度为2500lx，25天继代增殖一次；其中，增殖培养基为：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH 5.5。
2.根据权利要求1所述的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于：步骤1)中，从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡1小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在75％的酒精中浸泡30秒后，在2％的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，再用无菌水仔细冲洗5遍。
3.根据权利要求1所述的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于：步骤2)中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5。
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