CN103733993A

CN103733993A - 一种野牛草愈伤组织的诱导方法

Info

Publication number: CN103733993A
Application number: CN201310698035.2A
Authority: CN
Inventors: 王显国; 宁亚明; 张蕴薇; 孙彦; 吴菲菲
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN103733993B

Abstract

本发明提供一种野牛草愈伤组织诱导方法，其以野牛草种子为外植体，消毒后置于无菌滤纸上进行萌发，挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基，在25±1℃条件下黑暗培养20-25天；所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0的固体培养基。本发明既排除了在消毒过程中消毒不彻底的种子在愈伤组织诱导过程中造成的污染现象，也排除了无生命力种子对愈伤诱导的干扰，同时也降低了操作的难度，免去了对成熟胚进行垂直切割的步骤，在简单易操作的基础上同时提高了愈伤诱导率，使其达到了90%以上。

Description

一种野牛草愈伤组织的诱导方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种野牛草愈伤组织的诱导方法。

背景技术

野牛草（学名：Buchloe dactyloides）是一种具有发达匍匐茎的暖季型草坪草。野牛草具有极强的耐旱、耐热和耐水淹性，抗病和再生能力强，适应范围广的特点，是目前应用较多的一种暖季型草坪草。但野牛草也存在一些缺点，如种子建坪的速度较慢，形成的草坪质量较差，色泽灰绿，在北方的绿期短、耐荫性和耐践踏性差、近距离观赏性和景观效果较差，冬相枯黄等等,这些缺点都限制了野牛草在我国的应用。为解决野牛草应用方面的难题，草坪科学工作者加强了野牛草的应用与基础研究，所涉及的研究领域也越来越广。但直至目前仍未培育中绿期明显延长的野牛草新品种，这也说明传统育种方法对这一性状改良存在一定的局限性。

现代生物技术的发展特别是转基因技术的发展使得我们对生物品种的选育和改良工作有了一个更为得心应手的工具。利用现代生物技术进行品种改良不但更经济、有效，且可大大缩短育种时间。水稻、玉米、小麦等禾本科植物已成功通过突变体筛选及转基因技术获得优良新品种，这诸多成功的案例为野牛草新品种的培育提供了重要的技术支撑。而大多数转基因技术能够顺利进行的基础和所必需的阶段是要建立高效的植株再生体系。目前以成熟胚为外植体的愈伤组织诱导在多种植物的再生体系建立方面上都有了广泛的应用，而以野牛草成熟胚为外植体的再生体系建立尚处于起步阶段。

在用于野牛草再生体系建立的各种外植体中，以成熟胚种子为外植体具有比其他外植体易采集、乃储藏、不受季节限制等优点，能保证不同个体间生理状态一致性和提供大量愈伤组织等优点，是开展遗传转化最为方便实用的受体，且成熟胚细胞具有潜在旺盛的分裂能力，是用于组织培养的良好材料。

2005年，钱永强以野牛草成熟胚为外植体材料，对外植体的灭菌、愈伤组织的诱导、继代及植株再生等各个培养阶段的影响因素进行了探讨；并从不同角度对愈伤组织的褐化诱因进行了研究。其是通过体胚发生途径建立野牛草再生体系的方法，将消过毒的种子培养3天后，无菌操作取出萌芽的成熟胚，垂直于胚轴切割数段后继续置于原培养基中培养，在培养20天后，愈伤组织诱导率达到86.67%。但此方法在操作过程中易发生外植体污染或死亡的现象，由于野牛草的种子较小，对其成熟胚进行切割很容易使得成熟胚失去活性，从而无法诱导出愈伤组织（钱永强,孙振元,李云,等.野牛草成熟胚植株再生及其影响因素研究[J].草业科学,2005(2):101-106.）。

李瑞芬以野牛草幼穗为外植体，建立了愈伤组织诱导、继代培养和植株再生体系。但这些工作都是处于起步阶段，还没有形成比较系统的研究结果，而且还都存在诱导出的愈伤组织褐化严重及再生率低的问题（李瑞芬,孙振元,魏建华,等.野牛草幼穗愈伤组织的诱导及植株再生[J].武汉植物学研究,2004(5):449-454.）。

现有的野牛草成熟胚愈伤组织诱导过程中存在着诱导率低，易污染的现象，通过本发明的方法可以避免愈伤组织因成熟胚材料消毒不彻底而引起的污染，使污染率降低到零，同时本发明的方法也提高了以野牛草成熟胚为外植体的愈伤诱导率，使得愈伤诱导率达到了90%以上。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种野牛草愈伤组织的诱导方法。该方法可以避免因外植体消毒不彻底而造成的污染；操作简便，能够获得大量的愈伤组织，愈伤诱导率在90%以上。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种一种野牛草愈伤组织的诱导方法，其特征在于，其以野牛草种子为外植体，消毒后进行萌发，挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基，在25±1℃条件下黑暗培养20-25天；所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0的固体培养基。

更为具体地，所述方法包括如下步骤：

1）种子的预处理：将种子从颖苞中取出；

2）外植体的消毒：将步骤1）中得到的种子用自来水洗净后，置于无菌操作台中用70%的酒精和有效氯浓度为7%-10%的次氯酸钠溶液进行消毒，再用无菌水清洗4-5遍；

3）种子的萌发：将步骤2）消毒过的种子置于铺有湿润无菌滤纸的培养皿中，置于25℃的光照培养箱中，暗培养1～2天，期间要保证无菌培养皿中有足够的无菌水以便种子萌发；

4）成熟胚愈伤组织的诱导：从培养皿中挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导，所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0，培养条件为25±1℃条件下黑暗培养，按照常规方法进行高压灭菌。

进一步地，所述步骤2）外植体的消毒过程包括：先将洗净的种子放入无菌容器中，在无菌工作台中先用70%的酒精消毒60s，接着用有效氯浓度为7%-10%的的次氯酸钠溶液消毒30min，后再用无菌水清洗4-5遍。

进一步地，所述步骤3）种子的萌发过程包括：先在培养皿中铺上双层滤纸，高压灭菌20min后置于无菌操作台中，用无菌水润湿，将经过步骤2）消毒过的种子置于无菌滤纸上，并向培养皿中加入无菌水，之后将培养皿封口后置于光照培养箱中黑暗培养。

作为优选，步骤4）中所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0。

进一步地，前述方法诱导出愈伤组织后再进行继代培养，继代培养基为：MS培养基+10mg/L脯氨酸+1g/L水解络蛋白+2，4-D3mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L；培养条件为25±1℃条件下黑暗培养。

本发明的有益效果在于：

本发明优选了2，4-D浓度为3.0-3.5mg/L的愈伤组织诱导培养基进行野牛草遇上组织的诱导。并采用先对种子进行消毒，然后置于无菌滤纸上使其萌发，再取已萌发的种子进行愈伤组织的诱导方法。此步骤既排除了在消毒过程中消毒不彻底的种子在愈伤组织诱导过程中造成的污染现象，也排除了无生命力种子对愈伤诱导的干扰，同时该方法也降低了操作的难度，免去了对成熟胚进行垂直切割的步骤，在简单易操作的基础上同时提高了愈伤诱导率，高达94.67%。本发明所述方法为简化遗传分析、作为转基因材料以及基因组学研究材料打下基础。

附图说明

图1为本发明接种于诱导培养基中黑暗培养6天后的种子；

图2为本发明接种于诱导培养基中黑暗培养19天后的种子；

图3为本发明接种于诱导培养基中黑暗培养20天后的种子；

图4为本发明继代中的愈伤组织。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 愈伤组织诱导培养基中2，4-D浓度的优化

1、种子的预处理：将种子从颖苞中取出；

2、外植体的消毒：先将洗净的种子放入无菌容器中，在无菌工作台中先用70%的酒精消毒60s，接着用7-10%的次氯酸钠溶液消毒30min，用无菌水冲洗4-5次后备用。

3、种子的萌发：先配置不加激素的MS培养基，灭菌后倒入大培养皿中冷却待用，将经过消毒过的种子置于加有无激素MS培养基的大培养皿中。之后将培养皿封口后置于光照培养箱中黑暗培养2-3天。

4、成熟胚愈伤组织的诱导：从培养皿中挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导（见图1、图2）。所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+2，4-D3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0；2，4-D浓度分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mg/L；培养条件为：25±1℃条件下黑暗培养，按照常规方法进行高压灭菌。诱导20-25天后统计愈伤诱导率，结果如表1所示。

表1 不同2，4-D浓度下成熟胚愈伤组织的愈伤诱导率

实施例2 种子的萌发的优化

1、种子的预处理：将种子从颖苞中取出；

3、种子的萌发：先在培养皿中铺上双层滤纸，高压灭菌20min后置于无菌操作台中，用无菌水润湿，将经过消毒过的种子置于无菌滤纸上，并向培养皿中加入一些无菌水，以保证种子萌发所需的水分。之后将培养皿封口后置于光照培养箱中黑暗培养。

4、成熟胚愈伤组织的诱导：从培养皿中挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导（见图3）。所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+2，4-D3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0，培养条件为：25±1℃条件下黑暗培养，按照常规方法进行高压灭菌。诱导30天后可以获得愈伤组织，诱导率达到94.67%，当其他条件不变，而诱导培养基中2，4-D3.0-3.5mg/L范围内变化时，愈伤组织均生长良好，诱导率均能达到90%以上。试验结果如表2所示。

表2 2，4-D浓度对愈伤组织诱导的影响

5、愈伤组织的继代培养：将诱导出的愈伤组织切去芽茎和种皮后，接种到继代培养基上25±1℃条件下黑暗培养（见图4），继代培养基为：MS培养基+10mg/L脯氨酸+1g/L水解络蛋白+2，4-D3mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L；其中2，4-D在2-4mg/L的范围内变化时，野牛草的愈伤组织均能正常生长。

通过对比实施例1和实施例2的试验结果进行比较可知，实施例2中的愈伤诱导率要高于实施例1中的愈伤诱导率，而两个实施例子之间的差异只在于第三步种子萌发的介质不同：实施例1为无激素的MS培养基；实施例2为无菌滤纸。除此之外，其他步骤均无不同。通过实施例1可知以野牛草为外植体的愈伤组织诱导培养基的最佳2，4-D浓度为3.0-3.5mg/L。在此基础上进一步进行实施例2，把2，4-D的浓度范围控制在3.0-3.5mg/L之间，而用无菌滤纸来代替培养基对种子进行萌发，可以看出在实施例2中愈伤诱导率得到了明显的提高，说明以无菌滤纸为介质对野牛草种子萌发，不仅可以简便操作步骤，也可以提高愈伤组织的诱导率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种野牛草愈伤组织的诱导方法，其特征在于，其以野牛草种子为外植体，消毒后进行萌发，挑选已萌发长出胚根的种子，转入愈伤组织诱导培养基，在25±1℃条件下黑暗培养20-25天；所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0-3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0的固体培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）种子的预处理：将种子从颖苞中取出；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）外植体的消毒过程包括：先将洗净的种子放入无菌容器中，在无菌工作台中先用70%的酒精消毒60s，接着用有效氯浓度为7%-10%的的次氯酸钠溶液消毒30min，后再用无菌水清洗4-5遍。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）种子的萌发过程包括：先在培养皿中铺上双层滤纸，高压灭菌20min后置于无菌操作台中，用无菌水润湿，将经过步骤2）消毒过的种子置于无菌滤纸上，并向培养皿中加入无菌水，之后将培养皿封口后置于光照培养箱中黑暗培养。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）中愈伤组织诱导培养基为MS培养基+2，4-D3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH值5.8-6.0。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导出愈伤组织后进行继代培养，继代培养基为：MS培养基+10mg/L脯氨酸+1g/L水解络蛋白+2，4-D3mg/L+NAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L；培养条件为25±1℃条件下黑暗培养。