CN103733986A

CN103733986A - 诱导五倍体草莓染色体加倍的方法

Info

Publication number: CN103733986A
Application number: CN201310719862.5A
Authority: CN
Inventors: 乔玉山; 陈丙义; 陈孟龙; 蔡斌华; 章镇; 高志红
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: CN103733986B

Abstract

本发明公开了一种诱导草莓染色体加倍的方法，属于植物生物技术领域。该方法五倍体草莓离体茎尖并用秋水仙素溶液将离体茎尖浸泡；然后将获得的所有五倍体材料进行批量加倍，并结合流式细胞仪技术和染色数目计数法将加倍后获得的材料进行了鉴定，获得了大量的十倍体材料。本发明操作简单，诱变时间较短，诱变率高，能够在短时间内获得大量的十倍体材料，是一种实用、可行、高效的诱导加倍技术。

Description

诱导五倍体草莓染色体加倍的方法

技术领域

本发明属于果树生物技术领域，具体涉及一种使用秋水仙素诱导草莓染色体加倍的方法。

背景技术

目前，国内外学者广泛应用野生草莓来改良现有栽培草莓的品种，将野生草莓与栽培草莓品种结合，以期使栽培草莓获得野生草莓在抗性、硬度和品质等方面的优良性状，该研究方向已是一种趋势和方向。野生草莓资源在抗性、芳香味和果实硬度等方面具有优良的育种价值，野生草莓资源具有非常巨大的潜在价值。

野生五倍体和通过种间杂交获得的五倍体在生物遗传上表现出育性差或不育，要解决该问题需要通过染色体加倍的方法，使其成为十倍体，并具有育性良好、容易结实，抗寒、抗病等优良抗性性状，同时能够具有在植株形态、花期、花粉活力较五倍体的大、长、高等优点。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题提供一种诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，该方法通过秋水仙素水溶液加倍五倍体草莓以获得十倍体草莓。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，该方法包括以下步骤：

1）将五倍体草莓丛生芽的离体茎尖经无菌水冲洗后放入秋水仙素溶液中浸泡，所述的秋水仙素溶液为无菌溶液；

2）将经步骤1）浸泡后的离体茎尖和秋水仙素溶液密封避光，并放入温度为25℃±1℃的振荡器中振荡；

3）取出经步骤2）处理后的离体茎尖，经无菌水冲洗后接种于MS+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中，在温度为25℃±1℃，LED灯照射条件下培养25～30d得到成活的茎尖；

4）将步骤3）成活的茎尖接种于MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中25～30d。

所述步骤1）的五倍体草莓为二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓杂交得到五倍体草莓丛生芽或野生五倍体草莓丛生芽。所述步骤1）的五倍体草莓丛生芽的离体茎尖长度为0.5～0.8cm。

所述步骤1）的秋水仙素溶液浓度为1.0～7.0mg/mL，优选浓度为1.0mg/mL；步骤1）的浸泡时间为24～72h，优选为48h。

所述步骤2）的振荡器的转速为100～120rpm，振荡器的振荡时间为24～72h，优选为48h。

所述步骤3）LED灯的光照强度为1500～2000lux，优选步骤3）离体茎每天在LED灯下光照16h。

所述步骤2）和步骤4）的操作步骤均在无菌的条件下完成，所述的无菌条件下完成是在开着紫外灯的超净工作台上完成，此外，紫外灯需提前连续开24h。

二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓杂交得到五倍体草莓丛生芽或野生五倍体草莓丛生芽是将长势好，整齐，粗壮的组培苗在配方为MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖或MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上进行增殖培养以获得大量的丛生芽。

步骤2）采用的秋水仙素溶液为经0.22μm水系微孔滤膜两次过滤后的无菌溶液。

本发明的有益效果

1.采用本发明方法诱导五倍体草莓染色体加倍的操作步骤简单，不需要将秋水仙素加入到培养基中进行诱变，减轻了秋水仙素持续毒害作用，提高了诱变效率，同时，工作量较小；

2.采用本发明方法诱变时间短，诱变率高，能够在短时间内获得大量的十倍体植株，

诱变率能达42.22%。

附图说明

图1A为流式细胞仪检测五倍体草莓叶片相对DNA含量分布图，图1B为流式细胞仪检测十倍体草莓叶片相对DNA含量分布图。

图2A为五倍体草莓染色体数目计数法检测草莓有丝分裂中期染色体数目图，图2B为十倍体草莓染色体数目计数法检测草莓有丝分裂中期染色体数目图。

图3A为五倍体草莓形态图，图3B为十倍体草莓形态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

第一步：选取长势好，整齐，粗壮的野生五倍体草莓组培苗在配方为MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上进行增殖培养以获得大量的丛生芽以供选取离体茎尖用；

第二步：获得丛生芽后，在超净工作台上（需提前连续开24h紫外）选取0.5cm离体茎尖，先将其放入无菌水中，冲洗掉培养基残留物和杂质；接着，将其放入经0.22μm水系微孔滤膜两次过滤后获得的无菌秋水仙素溶液中浸泡48h，该无菌秋水仙素溶液浓度为1.0mg/mL；

第三步：将第二步中将装有离体茎尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋进行封口，保证其与外界隔离。将其在温度为25℃条件下避光，并在恒温振荡器中处理48h，恒温振荡器的转速100rpm；

第四步：在超净工作台上（需提前连续开24h紫外）将经第三步处理完全后离体茎尖经无菌水冲洗5次后，用经灭菌后的滤纸上将残留的水分吸干，接种于配方为MS+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上，在温度25℃、每天在1500lx组培专用LED灯下光照16h，培养25d，获得成活的茎尖；

第五步：将成活的茎尖接种于配方为MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中，经培养25d。取草莓嫩叶制样在流式细胞仪上初步检测所获得株系的倍性，此时的诱变率能达42.22%。

为了更为准确的检测经上述方法培养获得株系的倍性，将上述第五步的草莓大量增殖、生根后获得幼苗并将其接种于灭菌后的基质中（草木炭：蛭石：珍珠岩=9：3：1）炼苗，移栽，等植株抽生匍匐茎后取根尖进行根尖常规压片，通过染色体数目计数法进一步鉴定十倍体株系植株，此时的诱变率能达98.81%。

图1是实施例1培育的十倍体株系植株的检测结果，使用仪器为FACScan流式细胞仪（美国BECKMAN公司），激发光源为15mW氩离子，激发波长为488nm，检测样品的PI荧光激发强度，图1A中100处为五倍体DNA含量峰值，图1B为相应加倍后十倍体在100处的峰值。

图3是实施例1培育的十倍体株系植株比较图，图3A中为五倍体植株形态图，图3B为相应加倍后十倍体植株形态图。

实施例2

第一步：选取长势好，整齐，粗壮的二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓杂交得到五倍体草莓组培苗，在配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上进行增殖培养以获得大量的丛生芽以供选取离体茎尖用；

第二步：获得丛生芽后，在超净工作台上（需提前连续开24h紫外）选取0.6cm离体茎尖，先将其放入适量无菌水中，冲洗掉培养基残留物和杂质；接着，将其放入经0.22μm水系微孔滤膜两次过滤后获得的无菌秋水仙素溶液中浸泡24h，该无菌秋水仙素溶液浓度为3mg/mL。

第三步：将第二步中将装有离体茎尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋进行封口，保证其与外界隔离。将其在温度为25℃条件下避光，并在恒温振荡器中处理72h，恒温振荡器的转速110rpm；

第四步：在超净工作台上（需提前连续开24h紫外）将经第三步处理完全后离体茎尖经无菌水冲洗5次后，用经灭菌后的滤纸上将残留的水分吸干，接种于配方为MS+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上，在温度25℃、每天在1800lx组培专用LED灯下光照16h，培养27d，获得成活的茎尖；

第五步：将成活的茎尖接种于配方为MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中，经培养27d。取草莓嫩叶制样在流式细胞仪上初步检测所获得株系的倍性，此时的诱变率能达32.14%。

为了更为准确的检测经上述方法培养获得株系的倍性，将上述第五步的草莓大量增殖、生根后获得幼苗并将其接种于灭菌后的基质中（草木炭：蛭石：珍珠岩=9：3：1）炼苗，移栽，等该十倍体植株抽生匍匐茎后取根尖进行根尖常规压片，通过染色体数目计数法进一步鉴定十倍体株系植株。此时的诱变率能达98.03%。

图2是实例2培育的十倍体株系植株的检测结果，方法为根尖常规压片法进行染色体计数分析；在正置荧光显微镜（Zeiss Axio Imager A1）下对染色体进行观察分析。图2A为五倍体有丝分裂中期染色体数目图，图2B为相应加倍后十倍体有丝分裂中期染色体数目图。

实施例3

第二步：获得丛生芽后，在超净工作台上（需提前连续开24h紫外）选取0.8m离体茎尖，先将其放入适量无菌水中，冲洗掉培养基残留物和杂质；接着，将其放入经0.22μm水系微孔滤膜两次过滤后获得的无菌秋水仙素溶液中浸泡72h，该无菌秋水仙素溶液浓度为7mg/mL；

第三步：将第二步中将装有离体茎尖和秋水仙素水溶液用封口膜和橡皮筋进行封口，保证其与外界隔离。将其在温度为25℃条件下避光，并在恒温振荡器中处理30h，恒温振荡器的转速120rpm；

第四步：在超净工作台上（需提前连续开24h紫外），将经第三步处理完全后离体茎尖经无菌水冲洗5次后，用经灭菌后的滤纸上将残留的水分吸干，接种于配方为MS+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基上，在温度25℃、每天在2000lx组培专用LED灯下光照16h，培养30d，获得成活的茎尖；

第五步：将成活的茎尖接种于配方为MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中，经培养30d。取草莓嫩叶制样在流式细胞仪上初步检测所获得株系的倍性，此时的诱变率能达40.79%。

为了更为准确的检测经上述方法培养获得株系的倍性，将上述第五步的草莓大量增殖、生根后获得幼苗并将其接种于灭菌后的基质中（草木炭：蛭石：珍珠岩=9：3：1）炼苗，移栽，等该十倍体植株抽生匍匐茎后取根尖进行根尖常规压片，通过染色体计数法进一步鉴定十倍体株系植株。此时的诱变率能达97.89%。

Claims

1.一种诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)将五倍体草莓丛生芽的离体茎尖经无菌水冲洗后放入秋水仙素溶液中浸泡，所述的秋水仙素溶液为无菌溶液；

2)将经步骤1）浸泡后的离体茎尖和秋水仙素溶液密封避光，并放入温度为25±1℃的振荡器中振荡；

3)取出经步骤2）处理后的离体茎尖，经无菌水冲洗后接种于MS+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中，在温度为25℃±1℃，LED灯照射条件下培养25～30d得到成活的茎尖；

4)将步骤3）成活的茎尖接种于MS+1.0mg/L6-BA+6.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖的培养基中25～30d。

2.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤1）的五倍体草莓为二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓杂交得到五倍体草莓丛生芽或野生五倍体草莓丛生芽。

3.根据权利要求1或2所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤1）的五倍体草莓丛生芽的离体茎尖长度为0.5～0.8cm。

4.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤1）的秋水仙素溶液浓度为1.0～7.0mg/mL，优选浓度为1.0mg/mL。

5.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤1）的浸泡时间为24～72h，优选为48h。

6.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤2）的振荡器的转速为100～120rpm。

7.根据权利要求1或6所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤2）的振荡器的振荡时间为24～72h，优选为48h。

8.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤3）LED灯的光照强度为1500～2000lux。

9.根据权利要求1或8所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤3）离体茎每天在LED灯下光照16h。

10.根据权利要求1所述的诱导五倍体草莓染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤2）和步骤4）的操作步骤在无菌的条件下完成。