CN103725754A - 高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法 - Google Patents

高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法 Download PDF

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沈强
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Abstract

本发明公开了一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

Description

高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法
技术领域
 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法。
背景技术
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)性肠炎主要通过污染的水源、食品、牛奶、饮料等传播，产毒性大肠杆菌(ETEC)产生的毒素分为不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)，根据其来源不同，耐热肠毒素又可分为猪源性(STp)和人源性(STa)，它们分别由位于质粒上的三种毒力基因编码，产毒性大肠杆菌(ETEC)一般含有三个毒力基因中的一个或几个基因。肠产毒性大肠杆菌（ETEC）检测以LT检测为主，但是约有5~10%肠产毒性大肠杆菌不具有LT基因，容易漏检，本发明提供高特异性检测STa基因的引物序列和方法，以提高肠产毒性大肠杆菌的检测率。
环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对大肠杆菌O157特异性基因序列的一对外引物（ETEC-F3和ETEC-B3）和一对内引物（ETEC-FIP和ETEC-BIP）进行环介导等温扩增。
发明内容
本发明公开了一种高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，提高了肠产毒性大肠杆菌的检测和诊断效率。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                           400μM
内引物
   ETEC-FIP                                  40umol
   ETEC-BIP                                  40umol
外引物
    ETEC-F3                                   5umol
    ETEC-B3                                   5umol
标本核酸                                       20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul；
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
进一步的，所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC。
进一步的，所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。  
进一步的，所述内引物ETEC-FIP的序列为
CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。
进一步的，所述内引物ETEC-BIP的序列为TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。
进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
本发明的有益效果是：
    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
 高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                           400μM
内引物
   ETEC-FIP                                  40umol
   ETEC-BIP                                  40umol
外引物
    ETEC-F3                                   5umol
    ETEC-B3                                   5umol
标本核酸                                       20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
选取肠出血性大肠杆菌特异性基因stx2基因（基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI），设计引物序列，所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC，所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG，所述内引物ETEC-FIP的序列为CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC，所述内引物ETEC-BIP的序列为TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。
进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株3株，核酸STp+菌株2株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示：3株STa菌株核酸均为阳性，其余菌种为阴性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法,其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                           400μM
内引物
   ETEC-FIP                                  40umol
   ETEC-BIP                                  40umol
外引物
    ETEC-F3                                   5umol
    ETEC-B3                                   5umol
标本核酸                                       20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul；
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）使用大肠杆菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及临床分离金黄色葡萄球菌以及若干临床分离头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于：所述外引物ETEC-F3的序列为TTTGTCATGCAGCCCATC。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于：所述外引物ETEC-B3的序列为TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于：所述内引物ETEC-FIP的序列为
CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于：所述内引物ETEC-BIP的序列为TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测肠产毒性大肠杆菌STa基因的方法，其特征在于：所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101082581A (zh) * 2006-05-30 2007-12-05 广州华峰生物科技有限公司 环介导等温扩增技术的大肠杆菌0157基因快速诊断试剂盒
CN101487057A (zh) * 2009-01-23 2009-07-22 浙江省疾病预防控制中心 O157:h7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法
CN102286620A (zh) * 2011-07-27 2011-12-21 广州华峰生物科技有限公司 肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒及其使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101082581A (zh) * 2006-05-30 2007-12-05 广州华峰生物科技有限公司 环介导等温扩增技术的大肠杆菌0157基因快速诊断试剂盒
CN101487057A (zh) * 2009-01-23 2009-07-22 浙江省疾病预防控制中心 O157:h7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法
CN102286620A (zh) * 2011-07-27 2011-12-21 广州华峰生物科技有限公司 肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUMITO MARUYAMA等: "Detection of Bacteria Carrying the stx2 Gene by In Situ Loop-Mediated Isothermal Amplification", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
王丽等: "环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157*", 《食品与发酵工业》 *

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