CN103720729B - 一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法，包括以下步骤：将石榴皮用无水乙醇超声提取；提取液浓缩成浸膏，用80-90体积？%的乙醇溶解滤去不溶物；乙醇溶液上活性炭柱，用80-90体积%的乙醇洗脱；洗脱液酸沉碱洗，滤液浓缩成浸膏；浸膏用70-95体积%的乙醇溶液溶解，调节pH至中性后用大孔吸附树脂纯化，然后用70-95体积%的乙醇溶液洗脱，减压回收乙醇和水，得总三萜酸。本发明采用石榴加工副产品——石榴皮为原材料，变废为宝,提取工艺条件温和、工艺简单、所需溶剂廉价且无毒无害、成本低，可很好的除去产品中的酸性杂质，所得总三萜酸纯度高，可用于糖尿病的辅助治疗，为糖尿病药物的研究提供了新的原料。

Description

一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法

技术领域

本发明涉及一种石榴皮中具有降糖活性的总三萜酸的提取方法，属于天然产物提取技术领域。

背景技术

石榴是一种具有较高营养价值和保健功能的药食两用资源，有“全身是宝”的美称。目前我国已成为是世界上第一大石榴种植国，但我国石榴加工产业仍停留在较为粗放的阶段，深加工技术水平与产品转化效率均较低。石榴皮是石榴加工过程中最主要副产品(占石榴果实20～30%)，一般作为废弃物处理，造成资源的严重浪费。目前从石榴皮中鉴定出来的化合物主要有黄酮类、生物碱类、鞣质类、有机酸类等，石榴皮中三萜酸成分的报道较少，只有关于齐墩果酸与熊果酸的报道。三萜酸是五环三萜类化合物，一般分为羽扁豆烷型、齐墩果烷型、熊果烷型等结构类型，在植物界广泛存在。

近年来国内外研究发现三萜酸类成分大多都具有很好的降糖生物活性。三萜酸类化合物由于结构复杂，人工合成困难，目前均从天然植物中提取获得，寻找富含三萜酸的植物来源也日益受到关注。如果能从石榴皮中提取出总三萜酸成分，不仅能很好的利用石榴皮副产品，防止资源的浪费，还大大降低了成本，对石榴资源的有效利用及深层次产品加工与开发具有重要意义。目前还没有关于石榴皮中三萜酸的提取方法公开，虽然有其他植物中总三萜酸的提取方法报道，但这些提取总三萜酸的工艺成本高，流程长，操作复杂，三萜酸提取杂质多、纯度低，并且采用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂,这些提取溶剂有毒且成本高不适于工业化生产；此外，不同样品材料所含三萜酸种类及样品中杂质也有很大差异性，因此在样品前处理及除杂过程中要有针对性的选择合适的处理方法对样品进行处理，所以不同的原料前处理方法不能通用，因此要从石榴皮中提取出总三萜酸需要创造性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法，该方法以石榴皮为原料，变废为宝，成本低，整个过程简单、不使用有毒溶剂，符合环保要求。

本发明通过大量的试验研究，得到了石榴皮中总三萜酸的提取方法，该方法以石榴加工副产品-石榴皮为原料，采用乙醇提取、活性碳脱色、酸沉碱洗及大孔吸附树脂纯化的工艺路线，工艺简单、成本低、所得产品纯度高。

本发明具体技术方案如下：

一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将石榴皮用无水乙醇超声提取，得提取液；

（2）将提取液浓缩成浸膏，用80-90体积%的乙醇溶液溶解滤去不溶物；

（3）滤去不溶物的乙醇溶液上活性炭柱，用80-90体积%的乙醇溶液进行洗脱；

（4）将洗脱液用酸沉淀，所得沉淀用碱洗后取滤液，滤液浓缩成浸膏；

（5）将浸膏用70-95体积%的乙醇溶液溶解，调节pH至中性后用大孔吸附树脂纯化，然后用70-95体积%的乙醇溶液洗脱，减压回收乙醇和水，得总三萜酸。

上述提取方法中，为了有效成分的充分提取，将原料石榴皮干燥、粉碎。

上述提取方法中，超声提取石榴皮时，无水乙醇的用量为石榴皮质量的20-50倍，优选为35倍。

上述提取方法中，提取温度为60-70℃，超声时间为20-40min。

上述提取方法中，超声功率为300W，频率为25KHz。

上述提取方法中，步骤（2）中，80-90体积%的乙醇溶液的质量为浸膏质量的10-30倍，优选为15倍。

上述提取方法中，步骤(3)中，活性炭与石榴皮的质量比为1-10:1，优选为3-5：1。

上述提取方法中，步骤(3)中，80-90体积%的乙醇溶液的质量为活性炭质量的10-20倍，优选为15倍。

上述提取方法中，步骤（4）中，所述酸为浓盐酸，所述碱为1-2wt%的氢氧化钠溶液。

上述提取方法中，步骤(4)中，按照每升洗脱液中加入25-35mL酸的量向乙醇洗脱液中加入酸，加入后静置2-3h进行酸沉，优选每升洗脱液中加入30mL酸。

上述提取方法中，步骤(4)中，向沉淀中加入其质量4-6倍的碱，煮沸后过滤。

上述提取方法中，步骤（5）中，用浓盐酸调节pH至中性。

上述提取方法中，步骤（5）中，所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂或者D101大孔吸附树脂。

上述提取方法中，步骤（5）中，所述大孔吸附树脂与石榴皮的质量比为0.5-1.5:3，优选1:3。

上述提取方法中，步骤（5）中，70-95体积%的乙醇溶液的用量为大孔吸附树脂质量的10-25倍，优选使用大孔树脂质量20倍的90体积%的乙醇进行洗脱。

本发明从石榴加工副产品石榴皮中提取总三萜酸,采用了醇提取--活性炭脱色—酸沉低浓度碱洗除杂--大孔吸附树脂纯化的步骤，可很好的除去产品中的酸性杂质，如粘液质等,提高了产品的纯度，所得总三萜酸纯度高，含量在70-86%范围内。

本发明提取工艺条件温和、工艺简单、所需溶剂廉价且无毒无害、成本低，为实际生产和应用提供了有利条件。采用石榴加工副产品——石榴皮为原材料，变废为宝,对于石榴资源的有效利用及深层次产品加工与开发具有重要的意义。

本发明所得提取物可以有效改善糖尿病大鼠血脂水平、显著降低糖尿病大鼠空腹血糖、明显改善糖尿病大鼠葡萄糖耐受量，对2型糖尿病大鼠有很好的治疗作用，因此石榴皮总三萜酸提取物可用于糖尿病的辅助治疗，为糖尿病药物的研究提供了新的原料。

附图说明

图1为三萜酸标准品的HPLC色谱图；图中峰标：1)山楂酸，2)熊果酸，3)齐墩果酸，4)白桦脂酸，5)桦木酮酸。

图2为本发明提取所得产品的HPLC色谱图，图中峰标：1)山楂酸，2)熊果酸，3)齐墩果酸，4)白桦脂酸。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，下述乙醇的浓度均为体积浓度。

实施例1

本发明石榴皮提取方法如下：

1、将石榴加工后的石榴皮干燥，粉碎成细粉，过120目筛。

2、取石榴皮粉末1200g，加入50kg无水乙醇，在60℃条件下，超声提取30min，超声功率为300W，频率为25KHz，减压抽滤,得到提取清液，将提取清液减压浓缩,回收乙醇后得浸膏；

3、用20质量倍80-90%的乙醇溶解浸膏，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；

4、取活性碳颗粒4kg装柱，将步骤3的醇溶液上样，用50kg90%乙醇进行洗脱，收集90%乙醇洗脱液；

5、向乙醇洗脱液中按照30mL/L洗脱液的用量加入浓盐酸，静置2h，抽滤，母液浓缩，过滤，合并滤出物；滤出物用6质量倍量1.5wt%氢氧化钠水溶液搅拌煮沸5min，趁热抽滤，滤液浓缩得浸膏2.53g；

6、向浸膏中加入50mL的80%乙醇加热溶解,调节溶液的pH值为7,采用100gHPD100型大孔吸附树脂吸附,以15倍大孔树脂质量的80%乙醇洗脱，减压除去洗脱液中的溶剂，得到1.12g提取物产品。

通过HPLC方法鉴定提取物中成分，方法如下：

标准对照品配制：分别精确称取20mg三萜酸标品（山楂酸，熊果酸，齐墩果酸，白桦脂酸，桦木酮酸），转移到10mL容量瓶中，用乙腈/DMF(9:1,v/v)配制成浓度为2mg/mL的标液；精确称取石榴皮提取物产品30mg,用乙腈/DMF(9:1,v/v)稀释到10mL备用。低浓度标准品溶液及样品溶液用乙腈/DMF(9:1,v/v)稀释而成。将试剂配置好后放于冰箱中于4℃下保存。

仪器条件：Agilent1100液相色谱-质谱联用仪（Agilent公司，美国），配备四元梯度泵(G1311A)、在线真空脱气机(G1322A)、紫外检测器(G1321A)和自动进样器(G1316A)；高效液相系统软件：HPChemstationsoftware；质谱系统：Esquire-LCNTsoftware；HypersilBDSC8column(4.6×200mm,5μm,AgilentCo.)。

流动相A:乙腈/水(40:60,v/v);流动相B:100%乙腈，流动相经过0.2mm的尼龙膜过滤流速为1.0mL/min，进样量20μL，柱温35℃，洗脱梯度如下：0min=50%B,40min=92%B,45min=100%B；紫外检测波长230nm。

所得三萜酸标准品HPLC色谱图如图1所示，本发明提取物HPLC色谱图如图2所示。通过与标准品色谱图对比，对本发明石榴皮提取物中三萜酸成分进行定性研究，可以看出本发明提取物中含有4种三萜酸，分别是山楂酸，熊果酸，齐墩果酸，白桦脂酸。经过计算，提取物中总三萜酸的含量为77.4%。

实施例2

本发明石榴皮提取方法如下：

1、将石榴加工后的石榴皮干燥粉碎，过120目筛。

2、取石榴皮粉末1200g，加入60kg无水乙醇，在70℃条件下，超声提取20min，超声功率为300W，频率为25KHz，减压抽滤,得到提取清液，将提取清液减压浓缩,回收乙醇后得浸膏；

3、用10质量倍90%的乙醇溶解浸膏，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；

4、取活性碳5kg装柱，将步骤3的醇溶液上样，用50kg90%乙醇进行梯度洗脱，收集90%乙醇洗脱液；

5、向乙醇洗脱液中按照30mL/L洗脱液的用量加入浓盐酸，静置2h，抽滤，母液浓缩，过滤，合并滤出物；滤出物用5质量倍量2wt%的氢氧化钠水溶液搅拌煮沸5min，趁热抽滤，得浸膏3.10g；

6、向浸膏中加入50mL的90%乙醇加热溶解,调节溶液的pH值为7，采用200gD101型大孔吸附树脂吸附,以10倍大孔树脂质量的95%乙醇为洗脱剂洗脱得到1.50g产品，经HPLC法测得产品中总三萜酸含量达74.3%。

实施例3

本发明石榴皮提取方法如下：

1、将石榴加工后的石榴皮干燥，粉碎成细粉，过120目筛。

2、取石榴皮粉末1200g，加入42kg无水乙醇，在65℃条件下，超声提取30min，超声功率为300W，频率为25KHz，减压抽滤,得到提取清液，将提取清液减压浓缩,回收乙醇后得浸膏；

3、用15质量倍85%的乙醇溶解浸膏，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；

4、取活性碳颗粒6kg装柱，将步骤3的醇溶液上样，用90kg的85%乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液；

5、向乙醇洗脱液中按照30mL/L洗脱液的用量加入浓盐酸，静置2h，抽滤，母液浓缩，过滤，合并滤出物；将滤出物用5质量倍量1.5wt%氢氧化钠水溶液搅拌煮沸5min，趁热抽滤，滤液浓缩得浸膏4.45g；

6、向浸膏中加入50mL的90%乙醇加热溶解,用浓盐酸调节溶液的pH值为7,采用400gHPD100型大孔吸附树脂吸附,以20倍大孔树脂质量的90%乙醇为洗脱剂洗脱，减压除去洗脱液中的乙醇和水，得到2.67g提取物产品。经HPLC法测定产品中总三帖酸的含量达85.4%。

实施例4

本发明石榴皮提取方法如下：

1、将石榴加工后的石榴皮干燥，粉碎成细粉，过120目筛。

2、取石榴皮粉末1200g，加入24kg无水乙醇，在60℃条件下，超声提取40min，超声功率为300W，频率为25KHz，减压抽滤,得到提取清液，将提取清液减压浓缩,回收乙醇后得浸膏；

3、用30质量倍80-90%的乙醇溶解浸膏，过滤或离心除去不溶物，得到醇溶液；

4、取活性碳颗粒1.5kg装柱，将步骤3的醇溶液上样，用30kg的80%乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液；

5、向乙醇洗脱液中按照25mL/L洗脱液的用量加入浓盐酸，静置3h，抽滤，母液浓缩，过滤，合并滤出物；将滤出物用4质量倍量2wt%氢氧化钠水溶液搅拌煮沸5min，趁热抽滤，滤液浓缩得浸膏2.23g；

6、向浸膏中加入50mL的70%乙醇加热溶解,用浓盐酸调节溶液的pH值为7,采用600gD101大孔吸附树脂吸附,以25倍大孔树脂质量的70%乙醇为洗脱剂洗脱，减压除去洗脱液中的乙醇和水，得到1.05g提取物产品。经HPLC法测定产品中总三帖酸的含量达72.5%。

本发明提取物具有很好的降血糖活性，下面以实施例1的提取物为例，通过对糖尿病SD大鼠糖脂代谢作用研究石榴皮中总三萜酸的降血糖活性。

石榴皮中总三萜酸(TTA)对糖尿病SD大鼠糖脂代谢作用研究

1、实验动物的选取：

健康SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，4周龄,体重约70-80g，由广州中医药大学实验动物中心提供，并饲养于该中心SPF级实验室。采用标准化饲养房笼子喂养,每日12h光照，昼夜循环,自由摄食、摄水，室温23-25℃，湿度40-70%。基础饲料配方为（wt%）:12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白质；高糖高脂饲料配方为（wt%）:基础饲料60%，猪油20%，蛋黄10%，蔗糖10%。

、模型建立与实验方法：

雄性SD大鼠56只,适应性饲养1周后,按体重随机分为正常组和造模组,其中正常组12只，造模组44只。正常组喂饲基础词料，造模组喂饲高脂词料，持续8周。8周后，大鼠禁食(不禁水)16h，造模组按40mg/kg剂量一次性腹腔注射(ip.)STZ溶液(临用前以0.1mol/L,pH4.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成浓度为0.5%的溶液)，正常对照组腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠继续以高脂饲料喂养2周后禁食(不禁水)8h，以罗氏活力型罗康全精密血糖仪检测空腹血糖(FBG),选取FBG在12.0-28.0mM之间的30只大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。

造模成功的糖尿病大鼠按血糖值平均分为模型组、石榴皮三萜酸治疗组和文迪雅治疗组，每组10只，每天给药1次，连续给药4周。大鼠每3天称重1次，根据重量调整给药量。基础饲料组大鼠作正常对照(10只)随行观察。给药期间所有糖尿病大鼠仍给予高脂饲料喂养。具体给药方式如下：

(1)模型组:等体积的吐温80与二甲基亚砜混合液以注射用水10倍稀释，按每100g体重1mL腹腔注射给药(ip.);

(2)石榴皮三萜酸治疗组:15mg/mL的储备液以注射用水10倍稀释，按每100g体重1mL腹腔给药(ip.)，剂量为15mg/kg/d;

(3)文迪雅治疗组:药片以蒸馏水崩解配成0.4mg/mL的混悬液，按每100g体重1mL口服给药(ig.)，剂量为0.4mg/kg/d;

(4)正常对照组:按每100g体重1mL口服蒸馏水(ig.)

3、检测指标及方法

一般状况观察：包括大鼠进食、饮水和尿量、毛色、体重、精神状态、活动情况等；

空腹血糖：给药期间每隔7天大鼠尾静脉取血，测定空腹8h(8:00a.m.-16:00p.m.)血糖值，同时记录体重；

葡萄糖耐受量实验：末次给药后的次日大鼠禁食4h(9:00a.m.-13:00p.m.)，测定空腹4h血糖值后，立即按2g/kg灌服葡萄糖溶液，并测定灌服葡萄糖后30min、60min、120min血糖值，即大鼠葡萄糖耐受量；

血样采集：末次给药的后日大鼠禁食16h后，用6%水合氯醛以(30mg/kg，ip.)麻醉大鼠，腹主动脉采血，静置待血清与血浆分离，3500rpm/min，4℃条件下离心10min得血清，并将血清分装于冻存管中，于-70℃冻存备用；

血清生化分析：采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高/低密度脂蛋白(H/LDL-C)等相关指标；

数据处理：采用SPSS17.0统计软件包，单因素方差分析方法进行数据分析，数据用Mean±SD表示，计量资料组间比较，如方差齐性时用最小显著性(LSD)法进行检验，如方差不齐时可用Dunnett'sT3法进行检验；显著性水平设为P<0.05。

、实验结果：

4.1TTA对各组SD大鼠体重的影响见表1。正常对照组大鼠体重保持上升趋势，而模型组大鼠体重则缓慢下降，与正常对照组相比，具有统计学差异。TTA组和罗格列酮(ROS)组大鼠体重都呈缓慢上升趋势，但Ros组体重增长率大于TTA组。

4.2TTA对各组SD大鼠空腹血糖(FBG)的影响情况见表2，随着给药时间延长，正常对照组血糖保持稳定，而模型组SD大鼠FBG持续升高。药物干预一周后，两个治疗组大鼠FBG开始下降，第二周已显著低于模型组。在以后两周Ros组与TTA组FBG均略有上升。治疗结束时TTA组和Ros组FBG均显著低于模型组。本实验表明TTA具有很好改善糖尿病大鼠血糖的作用。

4.3TTA对各组大鼠葡萄糖耐受量的影响见表3。在口服葡萄糖溶液30min时，各组大鼠血糖均达最高值，模型组血糖值最高，随后各组血糖逐渐下降。在60min、120min两个时间点，TTA组、Ros组血糖下降明显，与模型组相比具有显著性差异，而TTA组和Ros组无显著性差异。本实验结果表明TTA和Ros具有相近的改善糖耐量作用。

4.4TTA对各组SD大鼠脂代谢影响见表4。模型组血清中TC、TG、LDL-C含量均显著高于正常组；Ros组对大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量无明显影响，说明Ros在改善血脂方面无明显作用；经TTA治疗后SD大鼠与模型组相比其血淸TC、TG、LDL-C含量都显著下降(P<0.05)，提示TTA可以有效改善糖尿病SD大鼠血脂水平。

5、结论

通过以上实验结果可以看出本发明石榴皮总三萜酸提取物可以有效改善糖尿病大鼠血脂水平、显著降低糖尿病大鼠空腹血糖、明显改善糖尿病大鼠葡萄糖耐受量(作用效果与罗格列酮组相近)；通过观察动物状态，发现与糖尿病模型组相比，给予三萜酸提取物后，糖尿病大鼠多饮、多尿、多食现象明显减少，体重增加水平低于罗格列酮对照组，这显示本发明总三萜酸提取物对2型糖尿病大鼠有很好的治疗作用，本发明总三萜酸提取物可用于糖尿病的辅助治疗。

Claims (15)

1.一种石榴皮中降糖活性总三萜酸的提取方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将石榴皮用无水乙醇超声提取，得提取液；

（2）将提取液浓缩成浸膏，用80-90体积%的乙醇溶液溶解滤去不溶物；

（3）滤去不溶物的乙醇溶液上活性炭柱，用80-90体积%的乙醇溶液进行洗脱；

（4）将洗脱液用酸沉淀，所得沉淀用碱洗后取滤液，滤液浓缩成浸膏；

（5）将浸膏用70-95体积%的乙醇溶液溶解，调节pH至中性后用大孔吸附树脂纯化，然后用70-95体积%的乙醇溶液洗脱，减压回收乙醇和水，得总三萜酸。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：将原料石榴皮干燥、粉碎。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：超声提取石榴皮时，乙醇的用量为石榴皮质量的20-50倍。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征是：超声提取石榴皮时，乙醇的用量为石榴皮质量的35倍。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（1）中，提取温度为60-70℃，超声时间为20-40min；超声功率为300W，频率为25KHz。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（2）中，80-90体积%乙醇溶液的质量为浸膏质量的10-30倍。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征是：步骤（2）中，80-90体积%乙醇溶液的质量为浸膏质量的15倍。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤(3)中，活性炭与石榴皮的质量比为1-10:1；80-90体积%的乙醇溶液的质量为活性炭质量的10-20倍。

9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征是：步骤(3)中，活性炭与石榴皮的质量比为3-5：1。

10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（4）中，所述酸为浓盐酸，所述碱为1-2wt%的氢氧化钠溶液；步骤（5）中，用浓盐酸调节pH至中性。

11.根据权利要求1或10所述的提取方法，其特征是：步骤(4)中，按照每升洗脱液中加入25-35ml酸的量向乙醇洗脱液中加入酸，加入后静置2-3h进行酸沉；向沉淀中加入其质量4-6倍的碱，煮沸后过滤。

12.根据权利要求11所述的提取方法，其特征是：步骤(4)中，按照每升洗脱液中加入30ml酸的量向乙醇洗脱液中加入酸，加入后静置2-3h进行酸沉。

13.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（5）中，所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂或者D101大孔吸附树脂。

14.根据权利要求1所述的提取方法，其特征是：步骤（5）中，所用大孔吸附树脂与石榴皮的质量比为0.5-1.5:3；70-95体积%的乙醇溶液的用量为大孔吸附树脂质量的10-25倍。

15.根据权利要求14所述的提取方法，其特征是：步骤（5）中，所用大孔吸附树脂与石榴皮的质量比为1:3；70-95体积%的乙醇溶液的用量为大孔吸附树脂质量的20质量倍。