CN103710360A - 提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法 - Google Patents

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高毅
姜锡男
李阳
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Abstract

本发明公开一种提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法，包括步骤：将HepGL肝癌细胞中提取的CPS1基因组DNA进行重亚硫酸盐处理；对根据处理后DNA扩增的CPS1启动子区域进行甲基化特异性基因扩增；将扩增出的甲基化序列进行测序；根据甲基化位点周围的碱基序列构建TALENs表达质粒及与甲基化位点同源的非甲基化同源质粒，其中，同源质粒中同源非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列；将TALENs表达质粒和同源质粒转染至HepGL肝癌细胞中；筛选发生转染的HepGL肝癌细胞，并对其进行Q-PCR和蛋白质印迹法处理，以检测细胞中CPS1的mRNA及蛋白的表达量。本发明方法能够增强HepGL肝癌细胞代谢氨的能力。

Description

提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法。 
背景技术
目前肝性脑病的治疗，主要在于降低患者的血氨含量，以减少或避免有毒物质未经肝脏处理而进入血液循环。原因为血氨含量高会引起中枢神经系统功能紊乱，导致以中枢神经系统代谢紊乱为特点并出现意识行为改变或昏迷的临床综合征。 
现有肝性脑病的治疗方式主要有药物控制、肝移植和生物人工肝。但此三种治疗方式都有其局限性，如：药物控制需考虑患者自身机体是否能承受药物治疗所导致的其他机体器官功能的衰竭，当出现多器官功能衰竭时，是否还能进行药物治疗；目前供体肝脏数量有限，且每年供肝量无明显增长的情况下，肝移植的治疗范围相对有限；生物人工肝虽无限制，但由于人工肝种子细胞相较于原代肝细胞在清除氨和合成尿素方面有明显的功能差距，故目前该治疗方法主要集中在如何提高种子细胞功能。 
氨基甲酰磷酸合成酶1（carbamyl phosphate synthetaseI，CPS1）是尿素循环的第一个限速酶，其功能是结合ATP、碳酸氢盐及氨基甲酰磷酸参与到鸟氨酸循环，使得氨最终代谢为尿素，经肾脏排泄出，以降低血氨。CPS1主要位于肝细胞和小肠上皮细胞的线粒体嵴，其中，乙酰谷氨酸为其变构辅助因子。CPS1的编码基因位于2号染色体长臂第35号染色区间，其cDNA长度为4503bp。 
以肝细胞为例，研究发现肝癌细胞中有很多功能蛋白的编码基因及抑癌基因出现异常的甲基化，尤其在这些基因的启动子区域，异常甲基 化的情况更为明显。同时，研究发现肝癌细胞在CPS1的编码基因完整的情况下，出现CPS1表达缺失。 
如何提高HepGL肝癌细胞CPS1的表达，进而提高生物人工肝中种子细胞的除氨能力，是目前亟待解决的问题之一。 
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法，能够增强HepGL肝癌细胞代谢氨的能力。 
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶（carbamyl phosphate synthetase，CPS）表达的方法，包括步骤：提取HepGL肝癌细胞的CPS1基因组DNA，并将DNA进行重亚硫酸盐处理；以处理后的DNA为模板，扩增CPS1的启动子区域序列；以启动子区域序列为模板，进行甲基化特异性基因扩增；将扩增出的甲基化序列进行测序，并与正常肝细胞的CPS1的启动子区域序列进行比对；根据甲基化序列中甲基化位点周围的碱基序列构建TALENs表达质粒及与所述甲基化位点同源的非甲基化同源质粒，其中，同源质粒中同源非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列；将TALENs表达质粒与同源质粒分别导入感受态大肠杆菌，并进行单克隆培养以获取较多的TALENs表达质粒和同源质粒；将TALENs表达质粒和同源质粒转染至HepGL肝癌细胞中；筛选发生转染的HepGL肝癌细胞；设等量的2组HepGL肝癌细胞进行Q-PCR和蛋白质印迹法处理，以比较各组细胞中CPS1的mRNA及蛋白的表达差异，具体为设置实验组和阴性对照组2组处理，其中，实验组为转染后的HepGL肝癌细胞，阴性对照组为加入PBS的HepGL肝癌细胞。 
其中，CPS1的启动子区域的引物序列为5’-GGAAATTTAAAG-3’，5’-ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3’。 
其中，以启动子区域序列为模板，进行甲基化特异性基因扩增的引物包括针对甲基化DNA的引物和针对非甲基化DNA的引物。 
针对甲基化DNA的引物序列为5’-ATGGAAATTTAAAGATCGTTG TGTA-3’，5’-TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3’。 
针对非甲基化DNA的引物序列为5’-GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’-AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。 
其中，提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法在生物人工肝种子细胞中用于提高CPS1表达的应用。 
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明根据CPS1启动子区域甲基化位点周围的碱基序列构建TALENS表达质粒，并将TALENs表达质粒及与甲基化位点同源的非甲基化序列转染至HepGL肝癌细胞中，其中，同源非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列。通过上述方法，可将甲基化位点切除，然后切除端口重组同源性的非甲基化序列，由于该同源非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列，因此可使CPS1启动子区域异常甲基化的基础消失，从而提高CPS1的启动子活性，使CPS1的mRNA及蛋白表达水平提高，最终提高HepGL肝癌细胞对氨的清除能力。 
具体实施方式
实施例1 
本实施例的研究材料为HepGL肝癌细胞。 
在本实施例中，首先验证CPS1的甲基化是否对其mRNA和蛋白的表达存在影响，具体验证方法如下： 
将HepGL肝癌细胞分为实验组与对照组，在实验组培养基中加入地西他滨（5umol/ml），对照组中加入与地西他滨等量的PBS，每24小时换一次液，连续培养3天后，进行Q-PCR、蛋白质印迹法（western blot）检测，以确认对照组与实验组之间CPS1的mRNA及蛋白是否存在表达差异。实验证明，CPS1的甲基化对其mRNA和蛋白的表达存在影响，具体为，对照组CPS1mRNA和蛋白的表达低于实验组。 
因此，消除CPS1的甲基化，提高HepGL肝癌细胞CPS1的表达，进而提高HepGL肝癌细胞代谢氨的能力，对肝癌细胞的治疗具有重要作用。 
在本实施例中，提高HepGL肝癌细胞CPS1表达的方法，包括以下步骤： 
1、提取HepGL肝癌细胞的CPS1基因组DNA。 
利用Wizard Genomic DNA分离试剂盒（Promega Madison WI）提取HepGL肝癌细胞的CPS1基因组DNA。 
2、将提取的DNA进行重亚硫酸盐处理。 
采用试剂盒（EZ DNA Methylation Direct Kit;Zymo Research,Orange,CA）对提取的DNA进行重亚硫酸盐处理。具体方法如下： 
a.取1μgDNA溶解于36μl的ddH2O中，加入新鲜配制的4μl3M NaOH，且使NaOH的最终浓度为0.3M，37℃水浴15分钟，对DNA进行变性。 
b.新鲜配制的10mM对苯二酚30μl和3.6M（PH5.0）重亚硫酸钠520μl加入上述变性后的溶液中，轻轻摇匀，55℃水浴16小时。 
c.修饰后的DNA用脱盐柱（Wizard DNA clean-up system）进行脱盐，具体为首先把灭菌的3ml注射器活塞拔出，注射器桶接上脱盐柱。取1ml Wizard脱盐树脂加入含有已修饰的DNA的1.5ml离心管中，轻柔倒置进行混合。 
然后用微量移液管吸取离心管中的混合液到已灭菌的3ml注射器桶内，插入注射器活塞缓慢而轻柔地把混合液推入脱盐柱中。从脱盐柱取下注射器，拔出活塞，再把注射器桶接上脱盐柱，吸取80%的异丙醇2ml加入到注射器桶中，插入活塞把异丙醇溶液推入脱盐柱中清洗脱盐柱。取下注射器，把脱盐柱放在1.5ml离心管中，10000×g，离心2分钟，甩干树脂。 
最后把离心后的脱盐柱放入另一个已灭菌的1.5ml离心管，在脱盐柱中加入70℃灭菌的双蒸水50μl，等待1分钟，10000×g，离心20秒，洗提DNA。 
3、以处理后的DNA为模板，扩增CPS1的启动子区域序列。 
针对重亚硫酸盐处理后的DNA，设计引物以扩增CPS1启动子区域序列。其中，设计的引物为序列5’-GGAAATTTAAAG-3’， 5’-ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3’。 
扩增出的CPS1启动子序列再经QIAquick胶抽提试剂盒进行胶纯化。 
4、以启动子区域序列为模板，进行甲基化特异性基因扩增。 
针对甲基化DNA的引物序列为：5’-ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3’，5’-TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3’。 
针对非甲基化DNA的引物序列为：5’-GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’-AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。 
若针对甲基化DNA的引物扩增出片段，则说明被检测的位点存在甲基化，若针对非甲基化DNA的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。 
扩增出片段后测序，并以原代肝细胞CPS1启动子基因作为对照组进行比对。在本实施例中，针对甲基化DNA的引物扩增出甲基化序列，对扩出的甲基化序列进行测序。 
5、根据甲基化序列中甲基化位点周围的碱基序列构建TALENS表达质粒及与所述甲基化位点同源的非甲基化同源质粒。 
在本实施例中，甲基化位点周围的碱基序列为，L:agttgctttcttagga，R:catgaatttgatgaggt。 
本实施例构建表达质粒的试剂盒为上海斯丹赛生物技术有限公司生产的TALEN试剂盒（TALEN-kit）。利用该试剂盒构建表达质粒的方法如下： 
a.从试剂盒中取出相应编号的模块，每个模块取1.5μl，加入同一PCR管中。 
b.将试剂盒中标有溶液1、溶液2的EP管从-20℃冰箱里取出置于冰盒上，溶液3放置于37℃水浴锅中溶解。 
c.在步骤a的PCR管中加入相应的TALEN骨架载体，然后再依次加入溶液3、溶液1和溶液2，最后加水补至20μl，短暂离心混匀。 
d.将混匀后的PCR管放入PCR仪中进行连接反应。 
e.连接反应后，取出PCR管并加入1μl溶液4、0.5μl溶液5，溶 液5需37℃预先融化，混匀，在PCR仪或水浴锅中37℃孵育1小时。 
f.取孵育后的产物20μl加入含感受态细胞（预先融化）的EP管中，混匀，在冰上放置30min，然后放入42℃水浴锅中热激45s，再迅速放置于冰上3min。 
g.在超净工作台中向步骤f的EP管中加入500μl SOC溶液，然后将EP管置于37℃、250rpm的摇床中培养30min。 
h.培养完成后取出EP管，将其在4000rpm的离心机中离心5min。 
i.在超净工作台中弃去EP管中的大部分上清，留下约100μl上清，并将沉淀轻轻吹打混匀，然后均匀涂布于卡纳霉素抗性（Ka+）的平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时。 
j.培养后挑取24个单克隆，将单克隆接种于装有5ml LB培养液（含Ka+）的15ml离心管中，然后置于37℃、250rpm的摇床中培养16h左右。 
g.培养后，提取TALENS表达质粒。 
同时，构建的同源质粒也导入感受态大肠杆菌进行单克隆培养，以获得较多的同源质粒。 
6、将TALENs表达质粒和同源质粒转染至HepGL肝癌细胞中，其中，同源质粒中同源的非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列。 
在本实施例中，转染至HepGL肝癌细胞中的TALENs表达质粒特异性结合于CPS1转录起始位点-9位的左边和125位的右边，用于使用核酸内切酶进行切割，使得DNA双链断裂。同时，结合转染至HepGL肝癌细胞中的与切割的甲基化位点同源的非甲基化序列，诱使DNA出现同源性重组。DNA同源重组使异常甲基化的基础消失，从而提高CPS1的启动子活性，使CPS1的mRNA及蛋白表达水平提高，最终提高该细胞对氨的清除能力。 
转染的具体步骤如下： 
a.转染前1天将0.5～2×105个HepGL肝癌细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。 
b.复合物的制备 
①将0.8ugTALENs表达质粒和同源质粒稀释于50ul无血清、无抗生素的培养液中，轻轻混匀。 
②将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清、无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5min。此过程在25min内进行。 
③步骤①和步骤②中混匀的液体，5min后混合，室温孵育20min。 
c.吸去24孔培养板中的培养基，用PBS或无血清培养基清洗HepGL肝癌细胞2次。 
d.将步骤b制备的复合物100ul加入24孔培养板的培养孔中，前后摇动培养板使复合物分布均匀。 
e.将培养板放入培养箱孵育4～6h后，更换含血清培养基以去除复合物。 
f.换含血清培养基24h后，将HepGL肝癌细胞以1：10的比例传代，1天后更换筛选培养基进行筛选，具体为吸出含血清培养基，用G418选择性培养基稀释HepGL肝癌细胞，进行筛选。 
g.将筛选的发生转染的HepGL肝癌细胞进行克隆。 
此方法处理得到的HepGL肝癌细胞可置于含氯化铵20mmol/ml或50mmol/ml的培养基中培养，通过MTT法或台盼蓝实验检测细胞的增值或凋亡情况，也可抽取隔日培养基检测培养基中氨的浓度以检测细胞对于氨的清除能力。 
7、设等量的2组HepGL肝癌细胞进行Q-PCR和蛋白质印迹法处理，以比较各组细胞中CPS1的mRNA及蛋白的表达差异，具体设有实验组和阴性对照组，实验组为转染后的HepGL肝癌细胞，阴性对照组为加入磷酸盐缓冲液的HepGL肝癌细胞。 
在本实施例中，还可在上述2组HepGL肝癌细胞中分别加入20mmol/L的氨，以检测其除氨能力。 
本发明方法耗时较短，转入DNA序列短，且成功率高，同时DNA转入后可整合入细胞染色体中形成稳定表达，利于推广使用。 
本发明提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法可应 用于生物人工肝种子细胞，使生物人工肝种子细胞中CPS1的表达提高，增强种子细胞的除氨能力。 
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

Claims (4)

1.一种提高HepGL肝癌细胞氨基甲酰磷酸合成酶表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取HepGL肝癌细胞CPS1基因组DNA序列，并将所述DNA进行重亚硫酸盐处理；
以所述处理后的DNA为模板，扩增CPS1的启动子区域序列；
以所述启动子区域序列为模板，进行甲基化特异性基因扩增；
将扩增出的甲基化序列进行测序，并与正常肝细胞的CPS1的启动子区域序列进行比对；
根据所述甲基化序列中甲基化位点周围的碱基序列构建TALENs表达质粒及与所述甲基化位点同源的非甲基化同源质粒，其中，所述同源质粒中同源非甲基化序列为CG突变为CA的突变序列；
将所述TALENs表达质粒与同源质粒分别导入感受态大肠杆菌，并进行单克隆培养以获取较多的TALENs表达质粒和同源质粒；
将所述TALENs表达质粒和同源质粒转染至HepGL肝癌细胞中；
筛选发生转染的HepGL肝癌细胞；
设等量的2组HepGL肝癌细胞进行Q-PCR和蛋白质印迹法处理，以比较各组细胞中CPS1的mRNA及蛋白的表达差异，具体为设置实验组和阴性对照组2组处理，其中，实验组为转染后的HepGL肝癌细胞，阴性对照组为加入PBS的HepGL肝癌细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增所述CPS1的启动子区域的引物序列为5’-GGAAATTTAAAG-3’，5’-ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3’。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以所述启动子区域序列为模板，进行甲基化特异性基因扩增的引物包括针对甲基化DNA的引物和针对非甲基化DNA的引物；
所述针对甲基化DNA的引物序列为5’-ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3’，5’-TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3’；
所述针对非甲基化DNA的引物序列为5’-GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’-AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。
4.权利要求1所述的方法在生物人工肝种子细胞中用于提高CPS1表达的应用。
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