CN103705438B - 通过静电纺丝将核酸适配体修饰的高分子体系纺成纤维膜应用于控制释放 - Google Patents
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Abstract
通过静电纺丝将核酸适配体修饰的高分子体系纺成纤维膜应用于控制释放，本发明属于材料科学领域,本发明设计制备特定的核酸适配体，两条互补配对的DNA链，通过接枝将DNA双链分别接枝到线状聚丙烯酰胺高分子聚合物上，接着加入客体分子，通过引发适配子杂交形成包裹客体分子的装载体系。通过静电纺丝将装载体系纺成纤维膜，当加入与适配子结合能力更强的目标分子时，通过竞争结合适配子，装载体系解体，包裹的客体分子释放出来。本发明技术方案设计新颖合理，重复性好。本发明通过静电纺丝将适配子修饰的装载体系制成纤维膜，用于客体分子的控制释放，其具有大的比表面积且生物相容性好，大大扩展了释放领域研究空间，有望应用于医学等领域。
Description
技术领域
在生物医学领域，纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能；人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能；一些电纺原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收；加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性，因此，其在生物医学领域引起了研究者的持续关注，并已在药物控释、创伤修复、生物组织工程等方面得到了很好的应用。
背景技术
自1934年，Formalas发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置以来，通过静电纺丝技术制备纳米纤维材料已经成为近几十年来世界材料科学技术领域的最重要的学术与技术活动之一。静电纺丝并以其制造装置简单、纺丝成本低廉、可纺物质种类繁多、工艺可控等优点，已成为有效制备纳米纤维材料的主要途径之一。静电纺丝技术已经制备了种类丰富的纳米纤维，包括有机、有机/无机复合和无机纳米纤维。然而，利用静电纺丝技术制备纳米纤维还面临一些需要解决的问题。首先，在制备有机纳米纤维方面，用于静电纺丝的天然高分子品种还十分有限，对所得产品结构和性能的研究不够完善，最终产品的应用大都只处于实验阶段，尤其是这些产品的产业化生产还存在较大的问题。其次，静电纺有机/无机复合纳米纤维的性能不仅与纳米粒子的结构有关，还与纳米粒子的聚集方式和协同性能、聚合物基体的结构性能、粒子与基体的界面结构性能及加工复合工艺等有关。如何制备出适合需要的、高性能、多功能的复合纳米纤维是研究的关键。此外，静电纺纳米纤维拥有大的比表面积，开发通过静电纺丝将适配子修饰高分子体系制备成为纤维小球用于药物控制释放，无疑是控释领域的一个新的研究课题。
发明内容
针对控制释放，本发明通过静电纺丝将适配子修饰的高分子体系纺成具有生物性好，高比表面积的纤维膜的制备方法。
本发明的原理是在电纺丝过程中,喷射装置中装满了充电的聚合物溶液或熔融液。在外加电场作用下,受表面张力作用而保持在喷嘴处的高分子液滴,在电场诱导下表面聚集电荷,受到一个与表面张力方向相反的电场力。当电场逐渐增强时,喷嘴处的液滴由球状被拉长为锥状,形成所谓的泰勒锥。而当电场强度增加至一个临界值时,电场力就会克服液体的表面张力,从泰勒锥中喷出。喷射流在高电场的作用下发生震荡而不稳,产生频率极高的不规则性螺旋运动。在高速震荡中,喷射流被迅速拉细,溶剂也迅速挥发,最终形成直径在nm级的纤维,并以随机的方式散落在收集装置上,形成纤维材料。
本发明的目标主要是提供一种高比表面且生物相容性好的纤维小球或纤维丝的制备方法，并应用于药物控制释放领域。
本发明以适配子修饰的高分子体系为纺丝材料，来制备具有高的比表面且生物相容性好的纤维小球与纤维丝。
本发明所制得的纤维小球直径在1-2um之间，纤维丝的宽直径在1um左右。
本发明采用一步法合成的金纳米粒子直径为10-20nm。
本发明是在高分子体系上修饰DNA以及后续试验都是在室温下进行（不高于30°C）。
步骤（1）中制备得到的六条DNA片段的纯化的量是通过检测260nm处紫外吸收来确定的。
步骤（2）得到的无色油状目标化合物是通过柱层析提纯了粗制得的丙烯酸亚磷酰胺。
步骤（3）所制的高分子体系是通过引入DNA杂交引发剂，通过DNA杂交拉近两高分子链条的距离，交联度增大，从而形成高分子体系；
本发明技术方案设计新颖合理，重复性好。本发明所制得的纤维小球与纤维丝，用于蛋白与药物的控制释放、选择性和适用范围非常广。
附图说明
图1是本发明通过静电纺丝制备的纤维小球1的扫描电镜图片；
图2是本发明通过静电纺丝制备的纤维小球2的扫描电镜图片；
图3是本发明通过静电纺丝制备的纤维丝3的扫描电镜图片；
图4是本发明一步法合成金纳米粒子的SEM照片；
图5是本发明通过UV-1800观察表柔比星的释放曲线（电纺纤维膜响应腺苷释放表柔比星的吸光度曲线）；
图6是本发明电纺纤维膜响应凝血酶释放纳米金粒子的吸光曲线图。
具体实施方案
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明
高分子体系1
（1）首先，合成A链与B链两条DNA单链，其A链碱基序列为：5’-acrydite-AAAATCACAGATGAGT-3’，B链碱基序列为：5’-acrydite-AAAAGTCTCCCGAGAT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-A与S-B,将Acrydite修饰的S-A与S-B分别加入到pH=8.0含有4%丙烯酸亚磷酰胺的10mM的三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中,并且分别加入200mM的NaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟（试样做两份）。
（2）然后加入52mg的胰岛素，静置20分钟（另一份加入等量的金纳米颗粒）
（3）试样中加入1.4%新配置的引发剂（0.5mL水,0.05g过硫酸铵）和催化剂（0.5mL的水与25μL四甲基乙二胺。将(PS-A)与(PS-B)以一定比例混合后，加入Linker-Apt，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶1（试样做两份）。
（4）首先，将溶胶1溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液。将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.08mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球1。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜（试样做两份）。
（5）取100mg干燥后的纤维小球1，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的cocaine，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度，进而确定释放胰岛素的量。
高分子体系2
（1）响应腺苷的高分子体系的制备：首先，合成C链与D链两条DNA单链，其C链碱基序列为：5’-Acrydite-AAAATCACAGATGAGT-3’，D链碱基序列为：5’-Acrydite-AAAACCCAGGTTCTCT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-C与S-D，将Acrydite修饰的S-C与S-D分别加入到含有4%丙烯酸亚磷酰胺的（10mM）三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐(pH=8.0)中,并且分别加入（200mM）NaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟。
（2）接着加入（0.52mg/ml）的表柔比星，放置20分钟后，于试样中加入1.4%新配置的引发剂（0.5mL水,0.05g过硫酸铵）和催化剂（0.5mL的水与25μL四甲基乙二胺。将(PS-C)与(PS-D)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶2。
（3）首先，将溶胶2溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液2。
（4）将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球2。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜。
（5）取100mg干燥后的纤维小球2，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的腺苷，通过紫外UV-1800来测释放的表柔比星的浓度。
高分子体系3
（1）响应凝血酶的高分子体系的制备：首先，合成E链与F链两条DNA单链，其E链碱基序列为:5’-Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3’,F链碱基序列为:5’-Acrydite-ACCAACCACAGT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-E与S-F，将Acrydite修饰的S-E与S-F分别加入到含有4%丙烯酰胺的（10mM）三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐(pH=8.0)中,并且分别加入（200mM）NaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟（试样做两份）。
（2）然后加入55mg的云南白药，静置20分钟后，试样中加入1.4%新配置的引发剂（0.5mL水,0.05g过硫酸铵）和催化剂（0.5mL的水与25μL四甲基乙二胺。将(PS-E)与(PS-F)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶3（另一份加入等质量的金纳米粒子）。
（3）首先，将溶胶3溶于3mL蒸馏水中,加入10uL(0.05mM/L)的DMSO，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液3（试样做两份）。
（4）将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为15cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为25kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维丝3。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜（试样做两份）。
（5）取100mg干燥后的纤维丝3，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的凝血酶，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度来确定释放云南白药的量。
Claims (4)
1.一种核酸适配体交联的聚丙烯酰胺高分子体系的制备方法，其特征在于，步骤如下：
高分子体系1的制备
(1)首先，合成A链与B链两条DNA单链，其A链碱基序列为：5’-acrydite-AAAATCACAGATGAGT-3’，B链碱基序列为：5’-acrydite-AAAAGTCTCCCGAGAT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-A与S-B,将Acrydite修饰的S-A与S-B分别加入到pH＝8.0含有4％丙烯酸亚磷酰胺的10mM的三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中,并且分别加入200mM的NaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟，试样做两份；
(2)然后一份加入52mg的胰岛素，静置20分钟，另一份加入等量的金纳米颗粒；
(3)试样中加入1.4％新配置的引发剂和催化剂，将得到的(PS-A)与(PS-B)以一定比例混合后，加入Linker-Apt，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶1，所述引发剂为0.05g过硫酸铵、0.5mL的水,所述的催化剂为25μL四甲基乙二胺、0.5mL水；
(4)将溶胶1溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液1，将静电纺丝溶液1注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30％RH，电压为10kv和推进速度为0.08mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球1，将得到的电纺纤维小球1于真空干燥箱中30℃干燥过夜；
(5)取100mg干燥后的纤维小球1，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的可卡因，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度，进而确定释放胰岛素的量；
高分子体系2的制备
(1)响应腺苷的高分子体系的制备：首先，合成C链与D链两条DNA单链，其C链碱基序列为：5’-Acrydite-AAAATCACAGATGAGT-3’，D链碱基序列为：5’-Acrydite-AAAACCCAGGTTCTCT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-C与S-D，将Acrydite修饰的S-C与S-D分别加入到pH＝8.0的含有4％丙烯酸亚磷酰胺的10mM三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中,并且分别加入200mMNaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟；
(2)接着加入0.52mg/mL的表柔比星，放置20分钟后试样中加入1.4％新配置的引发剂和催化剂，将得到的(PS-C)与(PS-D)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶2，所述引发剂为0.05g过硫酸铵、0.5mL的水,所述的催化剂为25μL四甲基乙二胺、0.5mL水；
(3)将溶胶2溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液2，将静电纺丝溶液2注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30％RH，电压为10kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球2，将得到的电纺纤维小球2于真空干燥箱中30℃干燥过夜；
(4)取100mg干燥后的纤维小球2，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的腺苷，通过紫外UV-1800来测释放的表柔比星的浓度；
高分子体系3的制备
(1)响应凝血酶的高分子体系的制备：首先，合成E链与F链两条DNA单链，其E链碱基序列为:5’-Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3’,F链碱基序列为:5’-Acrydite-ACCAACCACAGT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-E与S-F，将Acrydite修饰的S-E与S-F分别加入到pH＝8.0的含有4％丙烯酰胺的10mM三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中,并且分别加入200mMNaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟，试样做两份；
(2)然后加入55mg的云南白药，静置20分钟后，试样中加入1.4％新配置的引发剂和催化剂，将得到的(PS-E)与(PS-F)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶3，另一份加入等质量的金纳米粒子；所述引发剂为0.05g过硫酸铵、0.5ml的水,所述的催化剂为25μl四甲基乙二胺、0.5ml水；
(3)首先，将溶胶3溶于3mL蒸馏水中,加入10uL，0.05mM/L的DMSO，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液3；
(4)将静电纺丝溶液3注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为15cm，然后在环境湿度小于30％RH，电压为25kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维丝3；将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30℃干燥过夜；
(5)取100mg干燥后的纤维丝3，加入到1mL的水中，待纤维丝分散均匀之后再加入1mM的凝血酶，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度来确定释放云南白药的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：通过静电纺丝制得的电纺纤维小球1的平均粒径为1～2μm；通过静电纺丝制得的高分子体系电纺纤维小球2的平均粒径为1～2μm；通过静电纺丝制得的高分子体系电纺纤维丝3的平均直径为1μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：引发高分子体系1聚合的引发剂为Linker-Apt，引发高分子体系2、高分子体系3聚合的引发剂为Linker-Adap。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：高分子体系电纺纤维小球1可以特异性结合可卡因，高分子体系电纺纤维小球2可以特异性结合腺苷，高分子体系电纺纤维丝3可以特异性结合凝血酶。
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