CN103705438A

CN103705438A - 通过静电纺丝将核酸适配体修饰的高分子体系纺成纤维膜应用于控制释放

Info

Publication number: CN103705438A
Application number: CN201310712073.9A
Authority: CN
Inventors: 温永强; 桂万元; 王文谦; 李延生; 焦翔宇; 赵娜; 张学记
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: Shandong Blue Time New Materials Co Ltd
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103705438B

Abstract

通过静电纺丝将核酸适配体修饰的高分子体系纺成纤维膜应用于控制释放，本发明属于材料科学领域，本发明设计制备特定的核酸适配体，两条互补配对的DNA链，通过接枝将DNA双链分别接枝到线状聚丙烯酰胺高分子聚合物上，接着加入客体分子，通过引发适配子杂交形成包裹客体分子的装载体系。通过静电纺丝将装载体系纺成纤维膜，当加入与适配子结合能力更强的目标分子时，通过竞争结合适配子，装载体系解体，包裹的客体分子释放出来。本发明技术方案设计新颖合理，重复性好。本发明通过静电纺丝将适配子修饰的装载体系制成纤维膜，用于客体分子的控制释放，其具有大的比表面积且生物相容性好，大大扩展了释放领域研究空间，有望应用于医学等领域。

Description

通过静电纺丝将核酸适配体修饰的高分子体系纺成纤维膜应用于控制释放

技术领域

在生物医学领域，纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能；人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能；一些电纺原料具有很好的生物相容性及可降解性，可作为载体进入人体，并容易被吸收；加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性，因此，其在生物医学领域引起了研究者的持续关注，并已在药物控释、创伤修复、生物组织工程等方面得到了很好的应用。

背景技术

自1934年，Formalas发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置以来，通过静电纺丝技术制备纳米纤维材料已经成为近几十年来世界材料科学技术领域的最重要的学术与技术活动之一。静电纺丝并以其制造装置简单、纺丝成本低廉、可纺物质种类繁多、工艺可控等优点，已成为有效制备纳米纤维材料的主要途径之一。静电纺丝技术已经制备了种类丰富的纳米纤维，包括有机、有机/无机复合和无机纳米纤维。然而，利用静电纺丝技术制备纳米纤维还面临一些需要解决的问题。首先，在制备有机纳米纤维方面，用于静电纺丝的天然高分子品种还十分有限，对所得产品结构和性能的研究不够完善，最终产品的应用大都只处于实验阶段，尤其是这些产品的产业化生产还存在较大的问题。其次，静电纺有机/无机复合纳米纤维的性能不仅与纳米粒子的结构有关，还与纳米粒子的聚集方式和协同性能、聚合物基体的结构性能、粒子与基体的界面结构性能及加工复合工艺等有关。如何制备出适合需要的、高性能、多功能的复合纳米纤维是研究的关键。此外，静电纺纳米纤维拥有大的比表面积，开发通过静电纺丝将适配子修饰高分子体系制备成为纤维小球用于药物控制释放，无疑是控释领域的一个新的研究课题。

发明内容

针对控制释放，本发明通过静电纺丝将适配子修饰的高分子体系纺成具有生物性好，高比表面积的纤维膜的制备方法。

本发明的原理是在电纺丝过程中，喷射装置中装满了充电的聚合物溶液或熔融液。在外加电场作用下，受表面张力作用而保持在喷嘴处的高分子液滴，在电场诱导下表面聚集电荷，受到一个与表面张力方向相反的电场力。当电场逐渐增强时，喷嘴处的液滴由球状被拉长为锥状，形成所谓的泰勒锥。而当电场强度增加至一个临界值时，电场力就会克服液体的表面张力，从泰勒锥中喷出。喷射流在高电场的作用下发生震荡而不稳，产生频率极高的不规则性螺旋运动。在高速震荡中，喷射流被迅速拉细，溶剂也迅速挥发，最终形成直径在nm级的纤维，并以随机的方式散落在收集装置上，形成纤维材料。

本发明的目标主要是提供一种高比表面且生物相容性好的纤维小球或纤维丝的制备方法，并应用于药物控制释放领域。

本发明以适配子修饰的高分子体系为纺丝材料，来制备具有高的比表面且生物相容性好的纤维小球与纤维丝。

本发明所制得的纤维小球直径在1-2um之间，纤维丝的宽直径在1um左右。

本发明采用一步法合成的金纳米粒子直径为10-20nm。

本发明是在高分子体系上修饰DNA以及后续试验都是在室温下进行（不高于30°C）。

步骤（1）中制备得到的六条DNA片段的纯化的量是通过检测260nm处紫外吸收来确定的。

步骤（2）得到的无色油状目标化合物是通过柱层析提纯了粗制得的丙烯酸亚磷酰胺。

步骤（3）所制的高分子体系是通过引入DNA杂交引发剂，通过DNA杂交拉近两高分子链条的距离，交联度增大，从而形成高分子体系；

本发明技术方案设计新颖合理，重复性好。本发明所制得的纤维小球与纤维丝，用于蛋白与药物的控制释放、选择性和适用范围非常广。

附图说明

图1是本发明通过静电纺丝制备的纤维小球1的扫描电镜图片；

图2是本发明通过静电纺丝制备的纤维小球2的扫描电镜图片；

图3是本发明通过静电纺丝制备的纤维丝3的扫描电镜图片；

图4是本发明一步法合成金纳米粒子的SEM照片；

图5是本发明通过UV-1800观察表柔比星的释放曲线（电纺纤维膜响应腺苷释放表柔比星的吸光度曲线）；

图6是本发明电纺纤维膜响应凝血酶释放纳米金粒子的吸光曲线图。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

高分子体系1

（1）首先，合成A链与B链两条DNA单链，其A链碱基序列为：5’-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，B链碱基序列为：5’-acrydite-AAA AGT CTC CCG AGA T-3’，分别修饰两条DNA链得到S-A与S-B，将Acrydite修饰的 S-A 与 S-B分别加入到pH= 8.0含有4% 丙烯酸亚磷酰胺的10 mM的三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中，并且分别加入200mM的NaCl ，试样置于真空干燥箱中反应20分钟（试样做两份）。

（2）然后加入52mg的胰岛素，静置20分钟（另一份加入等量的金纳米颗粒）

（3）试样中加入1.4% 新配置的引发剂（0.5 mL 水，0.05 g 过硫酸铵）和催化剂（0.5 mL的水与25 μL四甲基乙二胺。将(PS-A)与(PS-B)以一定比例混合后，加入Linker-Apt，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶1（试样做两份）。

（4）首先，将溶胶1 溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液。将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.08mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球1。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜（试样做两份）。

（5）取100mg干燥后的纤维小球1，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的cocaine，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度，进而确定释放胰岛素的量。

高分子体系 2

（1）响应腺苷的高分子体系的制备：首先，合成C链与D链两条DNA单链，其C链碱基序列为：5’-Acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，D链碱基序列为：5’-Acrydite-AAA ACC CAG GTT CTC T-3’，分别修饰两条DNA链得到S-C与S-D，将Acrydite修饰的 S-C 与 S-D分别加入到含有4% 丙烯酸亚磷酰胺的（10 mM）三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐(pH= 8.0)中，并且分别加入（200mM）NaCl ，试样置于真空干燥箱中反应20分钟。

（2）接着加入（0.52mg/ml）的表柔比星，放置20分钟后，于试样中加入1.4% 新配置的引发剂（0.5 mL 水, 0.05 g 过硫酸铵）和催化剂（0.5 mL的水与25 μL四甲基乙二胺。将(PS-C)与(PS-D)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶2。

（3）首先，将溶胶2 溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液2。

（4）将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球2。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜。

（5）取100mg干燥后的纤维小球2，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的腺苷，通过紫外UV-1800来测释放的表柔比星的浓度。

高分子体系 3

（1）响应凝血酶的高分子体系的制备：首先，合成E链与F链两条DNA单链，其E链碱基序列为: 5’-Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3’,F链碱基序列为:5’-Acrydite-ACCAACCACAGT-3’，分别修饰两条DNA链得到S-E与S-F，将Acrydite修饰的 S-E 与 S-F分别加入到含有4% 丙烯酰胺的（10 mM）三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐(pH= 8.0)中，并且分别加入（200mM）NaCl，试样置于真空干燥箱中反应20分钟（试样做两份）。

（2）然后加入55mg的云南白药，静置20分钟后，试样中加入1.4% 新配置的引发剂（0.5 mL 水，0.05 g 过硫酸铵）和催化剂（0.5 mL的水与25 μL四甲基乙二胺。将(PS-E)与(PS-F)以一定比例混合后，加入Linker-Adap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成溶胶3（另一份加入等质量的金纳米粒子）。

（3）首先，将溶胶3 溶于3mL蒸馏水中,加入10uL(0.05mM/L)的DMSO，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液3（试样做两份）。

（4）将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为15cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为25kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维丝3。将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜（试样做两份）。

（5）取100mg干燥后的纤维丝3，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的凝血酶，通过紫外UV-1800来测释放的金纳米粒子的浓度来确定释放云南白药的量。

Claims

1.一种核酸适配体交联的聚丙烯酰胺高分子体系的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）核酸的合成

首先，将含有十几个或几十个碱基序列的能响应目标分子的DNA片段加入到2.5ml氢氧化铵中，于40°C水浴条件下培育17小时，DNA片段将在CPG岛处被分成两条单链DNA，单链DNA被转移到15ml离心管中，加入250uL物质的量浓度为3M的NaCl与6.25ml乙醇，将离心管放入到-20°C冰箱中醇沉DNA；然后，试样于将醇沉的DNA于4°C以下在4000rpm的转速条件下离心30分钟，移除上清液，沉淀下来的DNA试样溶解于500uL物质的量浓度为0.2M的三乙胺中用高相色谱纯化，干燥收集到的DNA产物，然后将DNA溶解在200uL 80%的乙酸中温育20分钟，从而脱掉三苯甲基，脱去三苯甲基DNA试样加入400uL乙醇并且真空干燥，通过检测260nm处紫外吸收来确定纯化的量，最后，纯化后的DNA溶解于水中，于-20°C下保存，以备下一步实验；

（2）丙烯酸亚磷酰胺的合成

首先， 9.32g的6-氨基-1-正己醇与16.16g的三乙胺加入到100mL二氯甲烷中，然后将10g甲基丙烯酰氯慢慢的加入，反应于0°C的冰水浴中搅拌2小时，通过加入100mL水终止反应，有机层用5%的HCl清洗并且干燥，得到粗制的6-羟乙基甲基丙烯酰胺，在0 °C 冰水浴中，将 2 g 的6-氨基-1-正己醇加入到40 mL无水乙腈中，15分钟内慢慢加入3.9 g的N, N'-二异丙腈，然后逐滴加入13 mmol 的2-氰乙基二异丙基氯代亚磷酰胺，反应混合物在0 °C 下搅拌5 小时，然后去除溶剂，沉淀再分散于乙酸乙酯中并且有机相用NaHCO3标准溶液与NaCl标准溶液清洗并用过量的无水硫酸镁干燥，当溶剂蒸发完之后，沉淀用柱层析法净化(乙酸乙酯/己烷/三乙胺= 40:60:3)，干燥后得3.33 g无色油状目标化合物；

（3）装载客体分子

Acrydite修饰的 S-A与 S-B分别加入到含有4% 丙烯酸亚磷酰胺的PH=8物质的量浓度为10 mM的三羟甲基氨基甲硅烷盐酸盐中,并且分别加入物质的量浓度为200mM的NaCl ，试样置于真空干燥箱中反应20分钟，然后加入适量客体分子，静置20分钟；

（4）装载体系的形成

试样中加入1.4% 新配置的过硫酸铵溶液作为引发剂和四甲基乙二胺作为催化剂，将PS-A与PS-B以一定比例混合后，加入LinkerAdap，于真空干燥箱中反应20分钟，形成装载体系，其中所述的引发剂为将0.05g的过硫酸铵溶解于0.5mL的水中形成的溶液，所述的催化剂为将25uL四甲基乙二胺溶解于0.5mL的水中形成的溶液；

（5）配置纺丝溶液

配置纺丝溶液：首先，将溶胶1 溶于10mL蒸馏水中，完全混匀后得到悬浮液；然后在搅拌速度为300r/min的磁力搅拌条件下搅拌4小时，即得到静电纺丝溶液；

（6）静电纺丝

纺丝1：将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.08mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球1，将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜；

纺丝2：将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为22cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为10kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维小球2，将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜；

纺丝3：将静电纺丝液注入到静电纺丝装置中，然后将接收屏与注射器垂直放置，且与注射器针头的垂直距离为15cm，然后在环境湿度小于30%RH，电压为25kv和推进速度为0.25mL/h的条件下静电纺丝，即在接收屏上得到分布均匀的电纺纤维网膜3，将得到的电纺纤维于真空干燥箱中30°C干燥过夜；

（7）金纳米粒子的制备

取一个250mL的圆底烧瓶，加入70mL水，接着再加入10mL质量分数0.1%的 HAuCl₄.3H2O，用电热套加热到70°C，撤下水浴，然后加入还原剂，所述催化剂为4mL（1%）的柠檬酸钠与5mL质量分数为1%的单宁酸，最后加入5mL物质的量浓度为2.5mM的K2CO3与6mL水,用电热套加热使反应迅速升温，反应6分钟即可；

（8）控制释放

取100mg干燥后的纤维小球，加入到1mL的水中，待纤维小球分散均匀之后再加入1mM的目标分子，通过紫外UV-1800来测释放的目标分子的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：高分子体系电纺纤维膜包括电纺纤维小球与电纺纤维丝。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：通过静电纺丝制得的高分子体系电纺电纺纤维小球1的平均粒径为1～2 um；通过静电纺丝制得的高分子体系电纺纤维小球2的平均粒径为1～2 um；通过静电纺丝制得的高分子体系电纺纤维丝3的平均宽直径为1 um。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：引发高分子体系1聚合的引发剂为Linker-Apt，引发高分子体系2、高分子体系3、聚合的引发剂为LinkerApad。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：6条DNA片段依次为S-A为SEQ ID NO:1,5’-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’， S-B为SEQ ID NO:2,5’-acrydite-AAA AGT CTC CCG AGA T-3 S-C为SEQ ID NO:3,5’-Acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’， S-D为SEQ ID NO:4, 5’-Acrydite-AAA ACC CAG GTT CTC T-3’， S-E为SEQ ID NO:5, 5’-Acrydite-ACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3’, S-F为SEQ ID NO:6, 5’-Acrydite-ACCAACCACAGT-3’。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：高分子体系电纺纤维小球1可以特异性结合cocaine，高分子体系电纺纤维小球2可以特异性结合腺苷，高分子体系电纺纤维丝3可以特异性结合凝血酶。

7.根据权利要求1所述的的方法，其特征是合成的DNA链段是多种DNA链段。

8.根据权利要求1所述的的方法，其特征是响应性目标分子是多种物质。

9. 根据权利要求1所述的的方法，其特征是装载到高分子体系的客体可以为金纳米粒子，银纳米粒子，量子点，荧光物质，磁性纳米粒子，抗原，抗体，蛋白，RNA，DNA，药物分子。

10. 根据权利要求1所述的的方法，其特征是高分子体系可以是聚乙烯，聚乙烯醇，蚕丝蛋白，聚笨乙烯，聚酰胺，丝弹性蛋白的高分子体系。