CN103704204A - 一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属海洋生物技术领域，具体地讲是一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法。选择活力95%以上的优质太平洋牡蛎担轮幼虫，用200目的筛绢过滤收集，加入适量添加剂，按担轮幼虫与抗冻保护剂的体积比9：1比例稀释混匀，在4℃孵育30分钟，分装于0.25ml或0.5ml麦管，分步程序降温至-180℃后投入液氮中长期保存。解冻时采用水浴解冻法，28℃水浴解冻5-10s，然后置于室温20℃至完全融化，加入到含5%BSA的新鲜灭菌海水检测担轮幼虫活力，获得复活的担轮幼虫高于70%。本发明的太平洋牡蛎胚胎长期冷冻保存方法对于太平洋牡蛎人工繁育、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。
Description
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法，把太平洋牡蛎胚胎经过抗冻保护剂处理、降温冷冻、置于液氮中长期保存及复温培育的过程。
背景技术
太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)属于牡蛎科，巨蛎属，俗称真牡蛎，其个体较大，在我国主要分布于山东及辽宁地区，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，尤其蛋白质、脂肪、肝糖、碘、维生素等营养物质含量丰富，有海洋牛奶之美称。20世纪80年代从日本、澳洲和台湾地区引入我国，在我国养殖十分广泛，目前已经成为我国最重要的养殖贝类，具有极高商业开发价值的海洋经济动物。近年来，由于养殖规模的不断扩大，对太平洋牡蛎种质需求也不断扩大，然而近几年来，由于累代养殖、近亲交配造成了种质退化、杂合度降低等一系列问题，致使太平洋牡蛎的生长速度与引进初期相比明显下降，养成周期不断延长。因此，选育具有优良生长性状的太平洋牡蛎品系、建立太平洋牡蛎的胚胎冷冻技术成为太平洋牡蛎养殖的当务之急。太平洋牡蛎胚胎的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义：太平洋牡蛎胚胎的超低温保存对于太平洋牡蛎这种海水名贵贝类的种质保存、遗传多样性和育种、可持续养殖、种质的长距离运输、贝类品的选育以及基因多样性的保护等方面有着重要意义
发明内容
本发明的目的在于提供一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
从养殖场购得太平洋牡蛎，解剖取的精液和卵子，经人工授精获得太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，加入抗冻保护剂，预冷后装入0.5ml或者0.25ml的麦管中进行分步降温，-40℃前采用两步慢速降温，-40℃后采用快速降温至-180℃后直接投入液氮中保存28℃水浴解冻复温培育，采用计算机辅助分析（CASA）检测太平洋牡蛎胚胎的运动率。所述太平洋牡蛎胚胎为担轮幼虫期胚胎，人工受精后于19±1℃温度条件下培养12-14h后发育至担轮幼虫期，用于胚胎冷冻保存。
所述冷冻保存的太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，是经200目筛绢过滤浓缩获得。
所述抗冻保护剂为10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积），太平洋牡蛎胚胎中提前添加有0.2M的海藻糖溶解混匀。
所述太平洋牡蛎担轮幼虫加入海藻糖和抗冻保护剂后充分混匀，在0～4℃冰箱中预冷30分钟。
所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积）太平洋牡蛎胚胎预冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麦管中，用封口粉封口后放入程序降温仪进行程序降温。
所述两步慢速降温是指0～-15℃降温速率为-1℃/分钟，-15～-40℃降温速率为-3℃/分钟，并且在-15℃停留3分钟，以便其充分形成冰核。所述快速降温是指-40～-180℃降温速率为-20℃/分钟，降至-180℃后取出，立即投入液氮中长期保存。
所述保存后的太平洋牡蛎担轮幼虫解冻时，用镊子从液氮中取出装有太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎的麦管，放入28℃水浴轻轻摇晃解冻至麦管开始呈现透明状态后取出，室温放至完全融化，剪刀剪开麦管两端放入海水中培育，获取复活胚胎。
所述培育胚胎的海水，是将海水经煮沸消毒后，按海水体积计加有5%BSA。
本发明具有如下优点：
1.本发明采用200目筛绢过滤浓缩太平洋牡蛎胚胎，保存胚胎量大；
2.本发明冷冻保存担轮幼虫期太平洋牡蛎的胚胎，抗冻能力强，解冻后活力高；
3.本发明采用0.25和0.5ml麦管装太平洋牡蛎胚胎，温度控制更加精密；
4.本发明采用10%（v/v）二甲亚砜（DMSO）为抗冻保护剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
5.本发明抗冻液中加入了0.2M海藻糖作为添加剂，通过其非渗透性保护作用对胚胎的质膜起到很好的保护作用；
6.本发明降温前太平洋牡蛎担轮幼虫与抗冻液混匀，4℃冰箱中预冷30分钟，既能保证抗冻保护剂充分渗入到太平洋牡蛎胚胎内部，又不会因抗冻保护剂本身的毒性作用对胚胎造成过大的损害；
7.本发明慢速降温时，首先采用以-1℃/min速度降温，降至-15℃后平衡3分钟，以便太平洋牡蛎胚胎内部形成冰核，又以-3℃/min降至-40℃，使冷冻胚胎安全度过“危险温度区”节省了时间，操作简便易行；
8.本发明采用-20℃/min的降温速率快速进入稳定状态-180℃，然后投入液氮，整个降温过程时间短，实用性强；
9.本发明冷冻胚胎从液氮中取出后，放入28℃水浴解冻至麦管呈透明状态取出，室温放至完全融化，可使胚胎快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤；
10.该技术降温程序精密，稳定性好，胚胎解冻后复苏率高，激活后运动率高于70%，与鲜精活性差异不大。
11.本发明采用添加5%BSA的消毒海水复水培育太平洋牡蛎胚胎，既降低了细菌真菌等有害微生物对胚胎的损害，又有效的防止解冻后胚胎相互黏连。
具体实施方式
实施例1：
2013年4月份正值太平洋牡蛎生殖期，与青岛崂东海珍品良种培育有限公司，捞取同批自然产太平洋牡蛎受精卵，放置海水温度19±1℃、微充气的孵化桶内培育，至担轮幼虫期胚胎，室温培养12-14h；
用200目筛绢网捞取胚胎，用滤纸轻蘸吸去表面海水，放入10%DMSO+0.2M海藻糖作为抗冻保护剂，混合均匀后在0～4℃冰箱中预冷30分钟，得混合样品；从冰箱中取2种0.25ml、0.5ml的麦管和混合样品，用2种麦管分别吸取0.25ml、0.5ml的混合样品，封口粉（IMV卡苏公司）封口后快速放入程序降温仪（Kryo360-1.7），开始降温；
降温程序为：0～-15℃，降温速率为-1℃/min；-15～-40℃，降温速率为-3℃/min；其中在-12℃时，平衡3分钟，使其胚胎内形成冰晶，然后以-20℃/min快速降温达至-180℃时，迅速将麦管投入装满液氮的液氮罐中保存；
保存2小时后取出麦管，迅速放入28℃水浴锅中解冻，至麦管呈现透亮状态后取出，室温放至冰核全部融化；
用剪刀剪开麦管两端，将管内胚胎倒入含有5%BSA的煮沸消毒的灭菌海水中，18±1℃静水培育；
取少量液体显微镜下观察，采集视频，统计担轮幼虫运动和死亡的个数，计算运动率大于70%。
实施例2：
2013年5月份正值太平洋牡蛎生殖期，与黄岛胶南增养殖站取得近海笼养牡蛎200只，带回中国科学院海洋研究所贝类养殖室暂养（暂养温度19±1℃），取性腺发育良好的太平洋牡蛎雌雄个体解剖取得精液和卵子进行人工授精，显微镜观察大约12-14h太平洋牡蛎胚胎进入担轮幼虫期；
采用200目筛绢过滤浓缩太平洋牡蛎胚胎，装入50ml离心管中，用200目的筛绢过滤收集到离心管中，按过滤后担轮幼虫与抗冻保护剂DMSO的体积比9：1比例稀释混匀，加入0.2M海藻糖作为添加剂；
将混有抗冻保护剂的太平洋牡蛎胚胎放入4℃冰箱中预冷30min后分装于0.25ml或0.5ml麦管快速放入程序降温仪中；
慢速分步降温程序为：-1℃/min由0降至-15℃，平衡3分钟后以-3℃/min由-15降至-40℃；快速降温程序为：-20℃/min由-40℃快速降温至-180℃时，迅速将麦管投入液氮罐中保存；
保存一周后取出麦管，放入28℃水浴锅中解冻5-10秒后取出，室温（20℃）放至冰核全部融化；
用剪刀剪开两端，待里面的液体完全流到载玻片上，置于显微镜下观察，采用计算机辅助精子分析（CASA）系统随机取三个视野采集太平洋牡蛎担轮幼虫运动状态的视频文件，统计运动率，计算运动率为73.00±2.00%。
Claims (10)
1.一种太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，加入抗冻保护剂，预冷后装入麦管中进行分步降温，-40℃前采用两步慢速降温，-40℃后采用快速降温至-180℃后直接投入液氮中保存，28℃水浴解冻复温培育，检测运动率。
2.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎胚胎为担轮幼虫期胚胎，受精后于19±1℃温度条件下培养12-14h后发育至担轮幼虫期。
3.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，经200目筛绢过滤浓缩。
4.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻保护剂为10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积），太平洋牡蛎胚胎中添加有0.2M的海藻糖。
5.按照权利要求1或4所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎担轮幼虫加入海藻糖和抗冻保护剂后充分混匀，在0～4℃冰箱中预冷30分钟。
6.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积）太平洋牡蛎胚胎预冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麦管中，用封口粉封口后放入程序降温仪进行程序降温。
7.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述两步慢速降温是指0～-15℃降温速率为-1℃/分钟，-15～-40℃降温速率为-3℃/分钟，并且在-15℃停留3分钟。
8.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述快速降温是指-40～-180℃降温速率为-20℃/分钟，降至-180℃后直接投入液氮中长期保存。
9.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述保存后的太平洋牡蛎担轮幼虫解冻时取出装有担轮幼虫的麦管，放入28℃水浴解冻至麦管呈透明状态取出，室温放至完全融化，剪开麦管两端放入海水中培育，获取复活胚胎。
10.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述培育胚胎的海水，是将海水消毒后，按海水体积计加有5%BSA。
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