CN103695499A - 细菌纤维素微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素微球的制备方法，包括：制备培养液；将木醋杆菌菌种接种至所述培养液中培养，生成细菌纤维薄膜，无菌条件下打散薄膜，过滤，得到细菌接种液；将细菌接种液和培养液充分混合，旋转速度为50～200rpm旋转培养，得到细菌纤维微球。本发明的细菌纤维素微球的制备方法，通过改变旋转发酵的速度，获得不同尺寸的细菌纤维素微球，通过不同碳源浓度获得不同密度的细菌纤维素微球，满足各种应用需求。
Description
【技术领域】
本发明涉及功能材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素微球的制备方法。
【背景技术】
细菌纤维素是由细菌合成的，通过β-1,4-糖苷键将葡萄糖基连接起来的一种多糖类高分子，其结构与植物纤维素的结构基本相同，但是细菌纤维素的合成比植物纤维素的合成更高效，且纯度更高，细菌纤维素是有超微纤维素组成的超微纤维网，故具有许多植物纤维素所无法比拟的特性。细菌纤维素在食品行业、生物医学、造纸工业和石油开采等方面都有广泛的用途。细菌纤维素作为一种新型生物医用工程材料，具有高纯度、高结晶度、高聚合度，及高吸水性、高保水性、对液体和气体的高透过率、高湿态强度等特性。
细菌纤维素的生产是在静态培养下在液体表面上生成胶质膜，在摇瓶培养时由于剪应力等作用生成微球或絮状纤维素。目前，对于细菌纤维素的研究较少，主要集中于对胶质膜的研究，而对微球状细菌纤维素的应用研究较少，因微球类物质颗粒小，不同大小或形貌的微球可用作微存储器、微反应器、微分离器和微结构单元。如纤维素微球的孔作为微反应器，通过原位法合成纳米的Fe3O4粒子，制备出新型磁性纤维素微球；催化剂载体微球，并有效固定化青霉素G酰化酶；构建出包埋活性炭磁性纤维素珠粒吸附剂用于染料吸附；构建出纤维素／甲壳素磁性复合微球吸附剂用于重金属离子吸附等。
微球的尺寸不同，其功能也不同，现有技术中关于细菌纤维素微球的制备主要有以下几种：
现有技术CN201010283198通过绿色环保纤维素溶剂制备纤维素溶液，然后采用高压静电喷射技术来制备纤维素微球，通过改变高分子溶液的浓度、静电喷射条件等工艺条件来控制纤维素微球的形态和尺寸。由于纤维素无毒和生物相容性好，所以可作应用于药物，酶或其它生物材料的载体，用作吸附剂和色谱柱填料等不同领域。产品废弃后可在自然条件下降解，对环境无影响。但是，合成原料为碱/尿素水溶液或碱/硫脲水溶液等化学物质，需要在高压电场中进行静电喷射，需要专门的电纺设备，喷射电压为10-50kV，操作复杂，成本高。
现有技术CN200810047793分离了保藏号为CCTCC M207163的木醋杆菌，并利用该木醋杆菌制备了纳米纤维素皮肤组织修复材料，但是，该现有技术没有制备出不同尺寸和功能的纤维素微球，无法满足需求。
因此，研究出一种无需使用专门设备，操作方法简单，成本低，能够得到不同尺寸细菌纤维素微球的制备方法成为本领域亟待解决的问题。
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种细菌纤维素微球的制备方法，解决现有技术中需要使用专门设备、操作复杂、成本高、不能获得不同尺寸微球的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的方案如下：
一种细菌纤维素微球的制备方法，包括：
制备包含葡萄糖、蛋白胨和无机盐的培养液；
将保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种接种至所述培养液中，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液；
将体积为1～5ml的细菌接种液和体积为100～200ml的培养液充分混合，在28～32℃旋转培养4～7天，旋转速度为50～200rpm，得到细菌纤维微球。
优选地，所述培养液还包括有机酸、硫酸镁、硫酸铵和玉米浆提取液；所述有机酸为醋酸、乳酸或柠檬酸；所述无机盐为磷酸氢二钠、Ca2+盐或Mg2+盐。
优选地，每100ml的培养液中含有：20～50g葡萄糖，2～8g蛋白胨，2～8g酵母粉，1～2g柠檬酸，0.5～2g磷酸氢二钠，0.1～2g硫酸镁，1～2g硫酸铵，0.5～2ml玉米提取液。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：
将所得细菌纤维素微球置于0.05～1.5mol/L氢氧化钠溶液中，在80～100℃水浴处理20～40min，得到纯化的细菌纤维素微球。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：
将纯化的细菌纤维素微球用去离子水冲洗至无碱性成分残留，灭菌；
将灭菌后的细菌纤维素微球置于去离子水中，于4℃保存。
优选地，所述细菌接种液和所述培养液在体积为150ml或250ml的锥形瓶中混合，旋转培养。
优选地，所述旋转培养中旋转速度为100～200rpm。
优选地，所述旋转培养中旋转速度为175～200rpm。
优选地，所述细菌纤维素微球的粒径为100～500μm。
优选地，每100ml的培养液中含有40～50g葡萄糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明的细菌纤维素微球的制备方法中使用的设备简单，操作方法简单，成本低；本发明的细菌纤维素微球的制备方法，通过改变旋转发酵的速度，获得不同尺寸的细菌纤维素微球，通过不同碳源浓度获得不同密度的细菌纤维素微球，满足各种应用需求；本发明的细菌纤维素微球的制备方法，没有使用到化学药物，无需高电压等条件，具有安全性、不对环境产生污染，大规模培养时具有较高的经济效益和社会效益。
【附图说明】
图1是本发明的细菌纤维素微球的制备方法的流程图；
图2是本发明实施例17、11、18、12所得细菌纤维素微球图；
图3是本发明实施例17和实施例19所得细菌纤维素微球密度对比图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的提供了一种细菌纤维素微球的制备方法，如图1所示，该方法包括：
步骤S101：制备包含葡萄糖、蛋白胨和无机盐的培养液；
培养液即为液态培养基，满足菌体生长和代谢所需的成分。在本实施例中，培养液包括碳源、氮源和无机盐成分，碳源可以是葡萄糖、果糖或蔗糖；氮源可以选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆提取液中的一种或几种；培养液还包括有机酸、硫酸镁、硫酸铵；其中，有机酸为醋酸、乳酸或柠檬酸；无机盐为磷酸氢二钠、Ca2+盐或Mg2+盐。在本实施例的一个较佳方案中，每100ml的培养液中含有：20～50g葡萄糖，2～8g蛋白胨，2～8g酵母粉，1～2g柠檬酸，0.5～2g磷酸氢二钠，0.1～2g硫酸镁，1～2g硫酸铵，0.5～2ml玉米浆提取液。根据不同菌种对营养液的不用需求，可在培养液中加入其它成分。
在本实施例的另一个较佳方案中，每100ml的培养液中含有40～50g葡萄糖。所制备出的细菌纤维素微球的密度显著增加。
步骤S102：将保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种接种至所述培养液中，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液；
木醋杆菌是合成纤维素最强的细菌之一，且木醋杆菌所合成的纤维素具有较高的结晶度、聚合度和非常一致的分子取向，并且以单一的纤维素形式存在；同时纯度高，获得的纤维素抗拉力强度高，有极强的持水性和透水、透气性；还具有生物可降解性，属于环境友好型产品。本实施例中，选用保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种，作为产生细菌纤维素微球的菌种，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液。在整个培养细菌接种液的过程中，一直保持无菌操作，以保证能获得所需要的细菌。
步骤S103：将体积为1～5ml的细菌接种液和体积为100～200ml的培养液充分混合，在28～32℃旋转培养4～7天，旋转速度为50～200rpm，得到细菌纤维微球；
在本实施例中，细菌接种液和培养液可以在无菌条件下在体积为150ml或250ml的锥形瓶中混合，旋转培养。在本实施例的一个较佳方案中，旋转培养中旋转速度为100～200rpm；进一步地，旋转培养中旋转速度为175～200rpm。
随着旋转速度的增加，所制备的细菌纤维素微球的粒径有逐渐变小的趋势，旋转培养中旋转速度为100～200rpm，细菌纤维素微球的粒径为1000～10000μm；旋转培养中旋转速度为175～200rpm，细菌纤维素微球的粒径为100～500μm。
步骤S104：将所得细菌纤维素微球置于0.05～1.5mol/L氢氧化钠溶液中，在80～100℃水浴处理20～40min，得到纯化的细菌纤维素微球；
将纯化的细菌纤维素微球用去离子水冲洗至无碱性成分残留，灭菌；
将灭菌后的细菌纤维素微球置于去离子水中，于4℃保存。
保藏号为ATCC23769的木醋杆菌在上述制备方法下无法生成细菌纤维素微球。而选用保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种能够得到细菌纤维素微球。
具体地，本发明实施例的细菌纤维素微球的制备方法，通过改变旋转发酵的速度，获得不同尺寸的细菌纤维素微球，通过不同碳源浓度获得不同密度的细菌纤维素微球，满足各种应用需求；本发明实施例的细菌纤维素微球的制备方法中使用的设备简单，操作方法简单，成本低；本发明实施例的细菌纤维素微球的制备方法，没有使用到化学药物，无需高电压等条件，具有安全性、不对环境产生污染，大规模培养时具有较高的经济效益和社会效益。
实施例1
本发明实施例1提供了一种细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、制备培养液：每100ml的培养液中含有：20g葡萄糖，2～8g蛋白胨，2～8g酵母粉，1～2g柠檬酸，0.5～2g磷酸氢二钠，0.1～2g硫酸镁，1～2g硫酸铵，0.5～2ml玉米浆提取液；
步骤2、制备细菌接种液：将保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种接种至所述培养液中，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液；
步骤3、于在体积为150ml的锥形瓶中，将体积为1～5ml的细菌接种液和体积为50ml的培养液充分混合，在28～32℃旋转培养4～7天，旋转速度为50rpm，得到细菌纤维微球；
步骤4、将所得细菌纤维素微球置于0.05～1.5mol/L氢氧化钠溶液中，在80～100℃水浴处理20～40min，得到纯化的细菌纤维素微球；
将纯化的细菌纤维素微球用去离子水冲洗至无碱性成分残留，灭菌；
将灭菌后的细菌纤维素微球置于去离子水中，于4℃保存。
实施例2
本发明实施例2提供了一种细菌纤维素微球的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、制备培养液：每100ml的培养液中含有：30g葡萄糖，2～8g蛋白胨，2～8g酵母粉，1～2g柠檬酸，0.5～2g磷酸氢二钠，0.1～2g硫酸镁，1～2g硫酸铵，0.5～2ml玉米浆提取液；
步骤2、制备细菌接种液：将保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种接种至所述培养液中，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液；
步骤3、于在体积为150ml的锥形瓶中，将体积为1～5ml的细菌接种液和体积为50ml的培养液充分混合，在28～32℃旋转培养4～7天，旋转速度为100rpm，得到细菌纤维微球；
步骤4、将所得细菌纤维素微球置于0.05～1.5mol/L氢氧化钠溶液中，在80～100℃水浴处理20～40min，得到纯化的细菌纤维素微球；
将纯化的细菌纤维素微球用去离子水冲洗至无碱性成分残留，灭菌；
将灭菌后的细菌纤维素微球置于去离子水中，于4℃保存。
实施例3～实施例19
本发明实施例3～实施例19提供了细菌纤维素微球的制备方法，其步骤与实施例1或实施例2相同，区别在于，步骤3中旋转培养的旋转速度不同、步骤1中每100ml培养液中葡萄糖的质量不同、步骤3中所用锥形瓶的体积不同、步骤3中与细菌接种液混合的培养液的体积不同，具体参见表1所述。
表1实施例3～实施例16中的参数
将实施例1～实施例19所得细菌纤维素微球进行粒径的测量，在培养液与细菌接种液混合培养24h、48h、96h、144h对所得细菌纤维素微球的密度进行测量。所得结果参见表2及图2～图3所示，图2中a是实施例17所得细菌纤维素微球图；b是本发明实施例11所得细菌纤维素微球图；c是本发明实施例18所得细菌纤维素微球图；d是本发明实施例12所得细菌纤维素微球图。
根据上述结果，随着旋转速度的增加，所制备的细菌纤维素微球的粒径有逐渐变小的趋势；随着培养液中葡萄糖含量的增加，所制备的细菌纤维素微球密度有逐渐变大的趋势。本发明实施例的细菌纤维素微球的制备方法，通过改变旋转发酵的速度，获得不同尺寸的细菌纤维素微球，通过不同碳源浓度获得不同密度的细菌纤维素微球，满足各种应用需求。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，包括：
制备包含葡萄糖、蛋白胨和无机盐的培养液；
将保藏号为ATCC700178或保藏号为ATCC53528的木醋杆菌菌种接种至所述培养液中，在28～32℃静态培养3～4天，在所述培养液中生成细菌纤维薄膜，在无菌条件下打散所述细菌纤维薄膜，过滤，得到细菌接种液；
将体积为1～5ml的细菌接种液和体积为100～200ml的培养液充分混合，在28～32℃旋转培养4～7天，旋转速度为50～200rpm，得到细菌纤维微球。
2.根据权利要求1所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述培养液还包括有机酸、硫酸镁、硫酸铵和玉米浆提取液；所述有机酸为醋酸、乳酸或柠檬酸；所述无机盐为磷酸氢二钠、Ca2+盐或Mg2+盐。
3.根据权利要求2所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，每100ml的培养液中含有：20～50g葡萄糖，2～8g蛋白胨，2～8g酵母粉，1～2g柠檬酸，0.5～2g磷酸氢二钠，0.1～2g硫酸镁，1～2g硫酸铵，0.5～2ml玉米提取液。
4.根据权利要求1所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：
将所得细菌纤维素微球置于0.05～1.5mol/L氢氧化钠溶液中，在80～100℃水浴处理20～40min，得到纯化的细菌纤维素微球。
5.根据权利要求4所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：
将纯化的细菌纤维素微球用去离子水冲洗至无碱性成分残留，灭菌；
将灭菌后的细菌纤维素微球置于去离子水中，于4℃保存。
6.根据权利要求1所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述细菌接种液和所述培养液在体积为150ml或250ml的锥形瓶中混合，旋转培养。
7.根据权利要求6所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述旋转培养中旋转速度为100～200rpm。
8.根据权利要求7所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述旋转培养中旋转速度为175～200rpm。
9.根据权利要求8所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，所述细菌纤维素微球的粒径为100～500μm。
10.根据权利要求3所述的细菌纤维素微球的制备方法，其特征在于，每100ml的培养液中含有40～50g葡萄糖。
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