CN103690530A

CN103690530A - 茶氨酸氯香酰胺等在制备具有预防和治疗癌症等疾病的产品中的应用

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Publication number: CN103690530A
Application number: CN201210363369.XA
Authority: CN
Inventors: 张国营; 姚建文; 刘昆; 张颖; 吴犇昊
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明涉及医疗技术领域。茶氨酸氯香酰胺为一种新合成的化合物，能抑制人肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌、淋巴瘤和白血病以及黑色素瘤等癌细胞的生长和侵袭，在体内能显著抑制肿瘤的生长和转移，其抑制效果超过抗癌药物；作用机制涉及到下调抑制肿瘤生长、侵袭和转移密切相关的受体、信号传导调控蛋白和激酶水平及核因子与DNA结合，同时，上调抑癌蛋白和细胞周期抑制蛋白等因子；茶氨酸氯香酰胺能直接抑制组蛋白去乙酰酶和组蛋白转甲基酶EZH2的活性以及炎症因子NF-κB与DNA的结合，茶氨酸氯香酰胺活性超过临床抗癌药物。本发明提供了茶氨酸氯香酰胺在预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管和免疫缺陷等疾病中的新用途。

Description

茶氨酸氯香酰胺等在制备具有预防和治疗癌症等疾病的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体涉及茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(CLC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备预防和治疗肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病抑制剂中的应用。

背景技术

人肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌和慢性白血病、淋巴瘤以及黑色素瘤等恶性肿瘤的非正常生长、侵袭和转移是导致每年数以万记患者死亡的重要原因，其发病也保持一定的水平，已经成为严重危害人类健康的重大疾病。由于临床化疗和放疗的毒副作用，限制了对其有效的防治。茶氨酸(又名谷氨酰乙胺)为茶叶中一种表明其品质优劣的特征性氨基酸，由于是无毒副作用的食品成分，使其成为无限制用量的食品添加剂，香豆素也证明在每日7克食用无毒副作用，使其得以广泛用于食品工业，研究表明：茶氨酸能够增高抗癌药物在肿瘤中的浓度而协同增效治疗人卵巢癌(Sadzukiet al.，Toxicol Lett.123：159-67，2001)。我们先前的实验证明茶氨酸有抑制肝癌和肺癌的作用(Liu，et al.，Cytotechnology59：211-217，2009；Zhang et al.BiosciBiotechnol Biochem.2002，66(4)：711-6.)。本发明将茶氨酸通过化学方法形成了一种新的化合物茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)，其抗肿瘤活性超过抗癌药物和茶氨酸。

组蛋白转甲基酶EZH2抑制剂和蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)，valproic acid，和sodium butyrate等已经在美国进行了I期或II期血液和实体肿瘤临床试验，EZH2和HDAC在多种人的癌症包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、白血病、胰腺癌、宫颈癌、肠癌和肝癌等恶性肿瘤中过度表达，美国对其作用抗癌药物靶点进行了大量的研究，这些EZH2抑制剂和HDAC抑制剂被广泛应用于各种肿瘤疾病的治疗中，被认为是应用前景较好的潜在的新型抗癌药物(Yamaguchi et al.，Cancer Sci.，10：355-62，2010；Denis，et al.，Clin Exp Metastasis25：183-189，2008；Kelly et al.，Nat Clin PractOncol2：150-157，2005；Martínez-Iglesias et al.，Clin Transl Oncol.10：395-8，2008)。

核蛋白因子NF-κB被认为是促进多种肿瘤和炎症及心脑血管、免疫缺陷病等疾病的蛋白因子，正成为防治这类疾病的重要药物靶点(Ishii et al.，J ClinBiochem Nutr.50：91-105，2012)。

高水平的受体VEGFR、EGFR和c-Met、非正常高表达的肿瘤信号传导相关的蛋白因子K-Ras，H-Ras，Akt，Cyclin D1，β-catenin和Bcl-2与多种肿瘤发生和恶化发展相关，而上调肿瘤抑制蛋白p53，p21，E-cadherin，Caspase3，Bax和胞浆细胞色素C水平显示了对多种癌细胞生长、侵袭和(或)转移的抑制作用(Cengel，et al.，Neoplasia9：341-8，2007；Huang et al.，Biochem pharmacol.77：794-803，2009；Prasad et al.，Oncology.73：112-7，2007)，因此，这些癌症相关因子成为潜在的防治癌症的重要药物靶点，能够有效地影响这些蛋白因子表达水平和活性的化合物具有广泛防治癌症的应用前景。

本发明提供的茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)具有显著的影响上述一系列蛋白因子的水平和活性，在制备预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管疾病和免疫缺陷病等疾病抑制剂的应用中有广阔的前景。

发明内容

1、本发明的目的是提供茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备预防和治疗肿瘤和炎症及心脑血管等疾病抑制剂中的应用。

2、本发明提供茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备组蛋白转甲基酶EZH2抑制剂中的应用。

3、本发明提供茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的应用。

4、本发明提供茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备促肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子NF-κB抑制剂中的应用。

5、本发明提供茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素(ClC)和茶氨酸乙酯(TE)在制备肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子VEGFR，EGFR，c-Met，K-Ras，H-Ras，Akt，Cyclin D1，β-catenin，Bcl-2/Bax抑制剂和上调p53，p21，E-cadherin，Caspase3，胞浆与线粒体细胞色素C之比激活剂中的应用。

6、本发明提供的的技术方案如下：

用于治疗肿瘤的化合物，其名称为茶氨酸氯香酰胺(TClC)，全称为(R)-乙酯-2-(6-C1-2-O-2H-苯并吡喃-3-羧基)-5-(乙氨基)-5-氧代戊酸酯，其中间体化合物6-氯香豆素3-羧酸(CLC)和茶氨酸乙酯(TE)的化学结构式如下：

如式(I)所示的化合物，物理性状为淡黄色粉末状固体，熔点在摄氏温度242°以上分解。

如式(I)所示的化合物为药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体包括适于注射的任何物质。较佳为注射用水，或乳化剂及其它药学载体。

如式(I)所示化合物的制备方法，主要包括以下步骤：

1、6-氯香豆素-3-羧酸的制备，如结构式(II)所示；

2、茶氨酸乙酯的制备，如结构式(III)所示；

3、由6-氯香豆素-3-羧酸与茶氨酸乙酯进一步合成茶氨酸氯香酰胺，如结构式(I)所示。

反应总步骤如下：

步骤1：制备6-氯-香豆素-3-羧酸

5-氯水杨醛与丙二酸二乙酯在六氢吡啶的催化下缩合成香豆素-3-甲酸乙酯，后者加碱水解，此时酯基和内酯均被水解，然后经酸化再次闭环形成内酯，即为6-氯香豆素-3-羧酸。具体操作步骤如下：(1)依次加入200-215g5-氯水杨醛、200-215mL丙二酸二乙酯、600-615mL无水乙醇和10-12mL六氢吡啶及1-1.3ml冰醋酸；(2)在无水条件下，水浴80℃条件下，搅拌回流2-3h，冷却；(3)加入约600-615mL冷水(0℃)，待结晶析出后抽滤并用115mL被冰水(0℃)冷却过的50％乙醇洗两次，可得6-氯香豆素-3-缩酸酯；(4)分别用加入6-氯香豆素-3-羧酸乙酯124-136g和100-109g氢氧化钠，然后加入500-515ml无水乙醇和500-515mL水，80℃水浴条件下，加热回流约2-3h；(5)待反应结束后，立即置于0℃冰浴，加浓盐酸(HCL含量：36-38％)，使体系pH在2-3之间，体系会析出固体，冰浴冷却后过滤，用少量冰水洗涤，干燥后的粗品用水重结晶进行纯化，获得如结构式(II)6-氯香豆素-3-羧酸。

步骤2：制备茶氨酸乙酯

茶氨酸按照87-91g/L的比例溶解在乙醇(指每升乙醇溶解87-91g克茶氨酸)，随后向体系缓慢添加二氯亚砜体积比为17-19∶1(指茶氨酸和乙醇的溶解液与二氯亚砜的体积比)，混合物在室温条件下搅拌1-2小时后，将产生的混合物在减压条件下浓缩，获得如结构式(III)的茶氨酸乙酯。

步骤3：制备茶氨酸氯香酰胺(TClC)

20-22g茶氨酸乙酯溶解于2-2.2L无水二氯甲烷，加入27--29g6-氯-香豆素-3-羧酸，分别添加0.20-0.22L DIPEA(二异丙基乙胺)，76-78g EDCI。混合物在室温条件下搅拌1-2小时，接着减压浓缩，除去溶剂，通过柱层析进行纯化，获得如结构式(I)的(R)-乙酯-2-(6-Cl-2-O-2H-苯并吡喃-3-羧基)-5-(乙氨基)-5-氧代戊酸酯)，简称茶氨酸氯香酰胺，为淡黄色粉末状固体。

7、本发明如结构式(I)所示的化合物，可用于协同放疗和化疗药物联合治疗肿瘤，在制备用于配合放疗和化疗肿瘤药物中的应用。

8、本发明如结构式(I)所示的化合物，为1％皮下或肌肉或静脉或腹腔(2％)注射液或口服液。

所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、支气管癌、细支气管癌、尿道癌、肾癌、口腔癌、阴道癌、胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、鼻咽癌以及其它各种肿瘤。

本化合物在能够有效地杀伤肿瘤细胞、能够增强放疗和化疗药物治疗肿瘤的疗效，本化合物抑制肿瘤的药效超过抗癌药物和茶氨酸，而且，毒副作用大大降低，无明显毒副作用。

本发明提出的化合物能够整合化疗和增效放疗为一体的功效，是具有应用更广泛、疗效更好、毒副作用更小、适应症更广、潜在的应用价值和市场效益更大的新型抗肿瘤药物。

本发明所得到的茶氨酸氯香酰胺和6-氯-香豆素-3-羧酸以及茶氨酸乙酯可以通过肌肉、皮下、静脉和腹腔注射或口服，对各种人癌和动物癌细胞和对动物人癌移植瘤的治疗均优于环磷酰胺和恩度等抗癌药物。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施方式，用来对本发明作进一步的说明。

(本申请书中所有涉及到的温度均为摄氏温度)。

实施例1

本实施例的一种治疗肿瘤的化合物，其名称为(R)-乙酯-2-(6-Cl-2-O-2H-苯并吡喃-3-羧基)-5-(乙氨基)-5-氧代戊酸酯，简称茶氨酸氯香酰胺(TClC)，具有式(I)所示的化学结构式：

如式(I)所示的化合物，物理性状为淡黄色粉末状固体，熔点在摄氏242°以上分解；

如式(I)所示的化合物为药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体包括适于注射的任何物质，较佳为注射用水，或乳化剂、脂质体、纳米制剂及其它药学载体。

如式(I)所示化合物茶氨酸氯香酰胺的制备方法，主要包括以下步骤：

1、中间体6-氯香豆素-3-羧酸的制备，如结构式(II)所示；

2、中间体茶氨酸乙酯的制备，如结构式(III)所示；

具体步骤1：制备6-氯-香豆素-3-羧酸

(1)依次加入200g5-氯水杨醛、200mL丙二酸二乙酯、600mL无水乙醇和10mL六氢吡啶(10.3g)及1ml冰醋酸；(2)在无水条件下，水浴80℃条件下，搅拌回流2h，冷却；(3)加入约600mL冷水(0℃)，待结晶析出后抽滤并用100mL被冰水(0℃)冷却过的50％乙醇洗两次，可得6-氯香豆素-3-缩酸酯；(4)分别用加入6-氯香豆素-3-羧酸乙酯124g和100g氢氧化钠，然后加入500mL无水乙醇和500mL水，80℃水浴条件下，加热回流约2h；(5)待反应结束后，立即置于0℃冰浴，加浓盐酸，使体系pH在2-3之间，体系会析出固体，冰浴冷却后过滤，用少量冰水洗涤，干燥后的粗品用水重结晶进行纯化，获得如结构式(II)6-氯香豆素-3-羧酸。

步骤2：制备茶氨酸乙酯

茶氨酸按照87g/L的比例溶解在乙醇(指每升乙醇溶解87g克茶氨酸)，随后向体系缓慢添加二氯亚砜体积比为55ml，混合物在室温条件下搅拌1小时后，将产生的混合物在减压条件下浓缩，获得如结构式(III)的茶氨酸乙酯。

步骤3：制备茶氨酸氯香酰胺(TClC)

20g茶氨酸乙酯溶解于2L无水二氯甲烷，加入27g6-氯-香豆素-3-羧酸，分别添加0.21L DIPEA(二异丙基乙胺)，76g EDCI。混合物在室温条件下搅拌一小时，接着减压浓缩，除去溶剂，通过柱层析进行纯化，收集产物获得如结构式(I)所示的茶氨酸氯香酰胺(TClC)，该产物为淡黄色粉末状固体，熔点摄氏242°以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：1.12(t，J＝7.25Hz，3H，CH₃)，1.28(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃)，2.15-2.40(m，4H，CH₂)，3.26(m，2H，NH-CH₂)，4.14(m，1H，NH-CH)，4.21(q，J＝7.1Hz，2H，O-CH₂)，5.47(br，1H，NH)，6.91(d，J＝8.6Hz，1H，coumarin-8H)，7.25-7.28(m，2H，coumarin-5H，7H)，8.33(s，coumarin-4H)，12.93(s，1H，NH).¹³C-NMRδ：14.1(CH₃)，14.8(CH₃)，29.1(CH₂)，32.0(CH₂)，34.4(CH₂)，61.6(CH)，70.0(CH₂)，118.7(C)，119.3(CH)，123.4(C)，130.9(CH)，132.7(CH)，159.6(C)，166.3(C)，170.7(C)，171.2(C).ESI-MS(m/z)：407.1[M-H]^-.

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

步骤1：制备6-氯-香豆素-3-羧酸

(1)依次加入205g5-氯水杨醛、205mL丙二酸二乙酯、610mL无水乙醇和11mL六氢吡啶及1-1.3ml冰醋酸；(2)在无水条件下，水浴80℃条件下，搅拌回流2.5h，冷却；(3)加入约610mL冷水(0℃)，待结晶析出后抽滤并用110mL被冰水(0℃)冷却过的50％乙醇洗两次，可得6-氯香豆素-3-缩酸酯；(4)分别用加入6-氯香豆素-3-羧酸乙酯128g和103g氢氧化钠，然后加入510ml无水乙醇和510mL水，80℃水浴条件下，加热回流约2.5h；(5)待反应结束后，立即置于0℃冰浴，加浓盐酸(HCL含量：36-38％)，使体系pH在2-3之间，体系会析出固体，冰浴冷却后过滤，用少量冰水洗涤，干燥后的粗品用水重结晶进行纯化，获得如结构式(II)6-氯香豆素-3-羧酸。

步骤2：制备茶氨酸乙酯

茶氨酸按照88g/L的比例溶解在乙醇(指每升乙醇溶解88g克茶氨酸)，随后向体系缓慢添加二氯亚砜体积比为56ml(指茶氨酸和乙醇的溶解液与二氯亚砜的体积比)，混合物在室温条件下搅拌1.5小时后，将产生的混合物在减压条件下浓缩，获得如结构式(III)的茶氨酸乙酯。

步骤3：制备茶氨酸氯香酰胺(TClC)

21g茶氨酸乙酯溶解于2.1L无水二氯甲烷，加入28g6-氯-香豆素-3-羧酸，分别添加0.21L DIPEA(二异丙基乙胺)，77g EDCI。混合物在室温条件下搅拌1.5小时，接着减压浓缩，除去溶剂，通过柱层析进行纯化，获得如结构式(I)的茶氨酸氯香酰胺(TClC)，为淡黄色粉末状固体。

实施例3

本实施例与实施例2的区别在于

步骤1：制备6-氯-香豆素-3-羧酸

(1)依次加入210g5-氯水杨醛、210mL丙二酸二乙酯、615mL无水乙醇和12mL六氢吡啶及1-1.3ml冰醋酸；(2)在无水条件下，水浴80℃条件下，搅拌回流3h，冷却；(3)加入约615mL冷水(0℃)，待结晶析出后抽滤并用115mL被冰水(0℃)冷却过的50％乙醇洗两次，可得6-氯香豆素-3-缩酸酯；(4)分别用加入6-氯香豆素-3-羧酸乙酯132g和106g氢氧化钠，然后加入515ml无水乙醇和515mL水，80℃水浴条件下，加热回流约3h；(5)待反应结束后，立即置于0℃冰浴，加浓盐酸(HCL含量：36-38％)，使体系pH在2-3之间，体系会析出固体，冰浴冷却后过滤，用少量冰水洗涤，干燥后的粗品用水重结晶进行纯化，获得如结构式(II)6-氯香豆素-3-羧酸。

步骤2：制备茶氨酸乙酯

茶氨酸按照91g/L的比例溶解在乙醇(指每升乙醇溶解91g克茶氨酸)，随后向体系缓慢添加二氯亚砜体积比为57ml(指茶氨酸和乙醇的溶解液与二氯亚砜的体积比)，混合物在室温条件下搅拌2小时后，将产生的混合物在减压条件下浓缩，获得如结构式(III)的茶氨酸乙酯。

步骤3：制备茶氨酸氯香酰胺(TClC)

22g茶氨酸乙酯溶解于2.2L无水二氯甲烷，加入32g6-氯-香豆素-3-羧酸，分别添加0.22L DIPEA(二异丙基乙胺)，78g EDCI。混合物在室温条件下搅拌2小时，接着减压浓缩，除去溶剂，通过柱层析进行纯化，获得如结构式(I)的(R)-乙酯-2-(6-Cl-2-O-2H-苯并吡喃-3-羧基)-5-(乙氨基)-5-氧代戊酸酯)，简称茶氨酸氯香酰胺(TClC)，为淡黄色粉末状固体。

实施例4

茶氨酸氯香酰胺(TClC)钠盐注射液的配制

按照1∶1比例将茶氨酸氯香酰胺，加入100％乙醇或其它适当的有机溶剂溶解后，用注射用水配制的0.2N的NaOH和0.2N的HCL调节pH至7-7.5，而后，加生理盐水稀释定容至总体积1000倍(相当于浓度为0.1％的茶氨酸氯香酰胺溶液)，然后加压滤菌，所得滤液分装入1ml玻璃安瓿瓶中，熔封后经抽样热源试验结果阴性并经高效液相色谱分析结果制剂中茶氨酸氯香酰胺含量与标示一致，即得0.1％茶氨酸氯香酰胺(TClC)钠盐注射液

实施例5

新化合物TClC和茶氨酸乙酯等对各种人癌细胞系灭活作用

参照文献方法(Zhang Y，et al.，Cytotechnology2009，59(3)：191-200)测定了新化合物(TClC)(茶氨酸氯香酰胺)和TE(茶氨酸乙酯)、CLC(6-氯香豆素-3-羧酸)和阳性对照抗癌药物等体外培养对各种人癌细胞灭活作用，结果见下表-1。

1、细胞系和细胞培养：人肺癌A549和H460，人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231，人胃癌BGC-823，人前列腺癌PC-3，人慢性白血病K562，人淋巴瘤细胞U937，人肝癌SMMC7721和HepG2，人结肠癌HT29，人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela细胞系、小鼠黑色素瘤B16以及Lewis肺癌细胞系细胞系购于美国American TypeCulture Collection。这些细胞分别用DMEM和RPMI-1640培养液培养；

2、仪器设备：

二氧化碳培养箱：3111型，美国Thermo公司；倒置荧光显微镜：TE2000-U型，日本Nikon公司。倒置显微镜：CKX31型，日本Olympus公司；台式高速冷冻离心机：5810R型，德国Eppendorf公司；微量加样器：德国Eppendorf公司；细胞培养塑料平板(96孔)：BD公司；酶标仪：SYNERGY HT型，美国BIO-TEK公司；制冰机：XB70型，GRANT公司。

实验采用MTT法测试茶氨酸氯香酰胺(TCLC)、茶氨酸乙酯(TE)和6-氯香豆素-3-羧酸(CLC)及茶氨酸(T)在体外条件下对癌细胞生长的抑制作用，苔芬蓝染色法对其验证。步骤如下：

1、主要试剂、细胞系和仪器：

癌细胞系和仪器如上1和2所述。

RPMI1640和DMEM培养液：Hyclone公司；已灭活胎牛血清：Hyclone公司；

胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％台盼蓝：Sigma公司；

四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司；

2、实验步骤：

(1)用0.25％的胰蛋白酶消化对数生长期的癌细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴/mL，以100μl每孔接种于96孔培养板；

(2)将培养板移入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h；加入茶氨酸氯香酰胺16-1000μM/L、6-氯-香豆素-3-羧酸(1-1000μM/L)，茶氨酸乙酯(1-1000μM/L)，茶氨酸(1-1000μM/L)，或阳性药物对照抗癌药物其终浓度为16-1500μM/L。设对照孔(只加细胞悬液200μl)和无药物空白对照孔(含溶媒0.01％DMSO)，每组均设8个复孔，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养；

(3)分别于加药48h、72h后取出96孔板，小心吸弃原培养基，每孔加入100μl无血清的DMEM培养基及10μl MTT(5mg/mL)溶液，继续培养4h后，终止培养；

(4)小心吸弃孔内上清液，每孔加入1501DMSO，室温震荡10-15min，使结晶充分溶解。

(5)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值(A值)，记录结果；

(6)实验重复3次；

(7)实验结果按下式计算：相对存活率＝(各实验组A值/细胞对照组A值)×100％

中效浓度(IC50，即抑制率为50％时的药物浓度，又称半数抑制浓度)的计算：

用回归方程求出茶氨酸氯香酰胺等的IC50。

3、实验结果(见表1)

表1茶氨酸氯香酰胺(TClC)对人癌细胞生长的抑制作用

注：*p＜0.05与溶媒对照相比较；有关MTT测试细胞生长的方法见上述实验方法部分。上述结果使用苔芬蓝染色法对其验证表明药效相同无误。

§为茶氨酸氯香酰胺(CLCT)、茶氨酸乙酯(TE)、氯香豆素和茶氨酸等分别处理72小时后50％癌细胞成活的药物浓度(IC50)。

实施例6

茶氨酸氯香酰胺等抑制裸鼠体内多种人癌移植瘤生长和小鼠肺癌转移的实验

参照文献方法(George N.Naumov，et al.Combined Vascular EndothelialGrowth Factor Receptor and Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)BlockadeInhibits Tumor Growth in Xenograft Models of EGFR Inhibitor Resistance ClinCancer Res2009，15：3484-3494；杨镇洲等，)测定了新化合物茶氨酸氯香酰胺(TCLC)和茶氨酸乙酯(TE)等对多种人癌动物移植瘤体内生长的抑制作用，结果见下表-2。

1、实验动物，细胞系，主要试剂和仪器：

SPF级BALB/c裸小鼠和C57/BL6J小黑鼠，4～5周龄，18～22g，雌性，购自北京华阜康实验动物中心，动物许可证号SCXK(京)2009-0004。饲养于SPF级动物实验室；IVC独立送回风笼，苏州苏杭科技器材有限公司；人肺癌A549，雌激素受体阴性的人乳腺癌MDA-MB231，雌激素受体阳性的人乳腺癌MCF-7，人肝癌SMMC7721，Lewis lung cancer细胞系和其它仪器如上所述。RPMI1640和DMEM培养液：Hyclone公司；已灭活胎牛血清：Hyclone公司，-20℃保存；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％台盼蓝：Sigma公司；

2、实验步骤：

(1)细胞培养和移植性肿瘤动物模型的建立：人癌细胞株分别培养于含10％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养液中，在37℃、5％CO₂的条件下培养，收集对数生长期的细胞并制备成浓度为2×10⁷个/ml的单细胞悬液，于超净工作台内每只裸小鼠于大腿后部皮下分别接种0.1ml细胞悬液，每天观察各注射点有无红肿破溃。约2-5周后，注射局部出现明显皮丘，所有裸鼠均出现直径约10-15mm的皮下结节，移植瘤模型建立；对于建立小鼠Lewis肺癌转移模型，制备成浓度为6×10⁶个/ml的单细胞悬液，静脉注射0.1ml细胞悬液进入C57/BL6J小黑鼠尾静脉后分组第2天开始用药，用药剂量和方式同于裸鼠见如下说明。

(2)裸鼠分组和给药：于接种约3-5周后将已建立皮下移植瘤模型的裸小鼠随机分为3组，每组7只；阴性对照组(溶媒DMDO0.05％，腹腔注射0.2ml/只，每2-3日一次；药物和成分均为腹腔注射(25mg/kg)：抗癌药物环磷酰胺和恩度阳性对照组，茶氨酸氯香酰胺组，茶氨酸乙酯组，每2-3日一次，用药治疗3-5周；对于检测药物对体内肿瘤EZH2H和HDAC酶酶活性的影响，在用药6小时后分别切除肿瘤，分别提取总蛋白和提取核蛋白用于酶活性检测分析，用阴性对照为DMSO(0.05％)溶媒、阳性对照SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)25mg/kg鼠)或化合物茶氨酸氯香酰胺(TCLT/25mg/kg鼠)或茶氨酸乙酯(TE/25mg/kg鼠)处理小鼠6小时后取瘤，总蛋白和核蛋白提取物由总蛋白裂解液和核蛋白裂解液提取(总蛋白裂解液、核蛋白裂解液以及PMSF购于碧云天生物技术研究所)，1mg肿瘤组织加人1mL裂解液中加入10μlPMSF，反复吹打混匀，冰上放置15min；将样品转移至1.5mL EP管中，14000r/min，4℃离心10min，将上清蛋白提取物转移到无菌EP管中用于检测酶活性。

(3)裸鼠肿瘤瘤体生长的观察：每天观察裸鼠的活动情况(包括进食、大小便性状、精神状态等)、移植瘤的出瘤时间及生长情况，每2-3天测量一次体重、瘤体的大小，用游标卡尺量瘤体的长径a及短径b(mm)，计算其体积，体积V＝π1/2·ab2(mm3)；

(4)动物的处死：治疗实验结束，麻醉小鼠，照相；断颈处死裸鼠，在无菌条件下剥离瘤组织，称取瘤重；检测药物对各器官和组织的病理和毒性影响情况。

(5)通过实验组移植瘤的瘤重与空白对照组瘤重(或肺转移瘤)相比较计算抑瘤率，即抑瘤率(％)＝(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤重)×100％。

3.实验结果(见表3)

表2茶氨酸氯香酰胺等对多种人癌动物移植瘤体内生长和小鼠肺癌转移的抑制作用*

注：*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

§抑制率％是与DMSO溶媒对照组相比较、用药组对肿瘤重量的平均抑制率(％)。

#小鼠Lewis肺癌的肿瘤肺转移抑制率％。

动物病理和毒理学分析结果表明：在实验期间，我们使用茶氨酸氯香酰胺和茶氨酸乙酯处理处理正常的动物和治疗的人癌移植瘤裸鼠，未见产生毒副作用，体重未见减少，心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、骨骼肌未见毒性。阳性对照药物环磷酰胺组小鼠有毒性反应，表现体重下降、厌食、用药2周后出现腹部肿胀和行动避缓等现象。恩度阳性对照组的小鼠也出现体重下降、厌食和行动避缓等毒性现象。

实施例7：茶氨酸氯香酰胺对动物体内EZH2酶活性抑制作用实验；

2、实验动物，细胞系、仪器和主要试剂、：

实验动物裸小鼠，细胞系和仪器详见上述(四)动物实验部分。

EZH2Assay Kit，购自BPS Bioscience公司。

检测茶氨酸氯香酰胺对EZH2酶活性的抑制作用，实验方法严格按照试剂盒附带的说明书操作，步骤如下：

3、实验步骤：

(1)向微孔板中每个反应孔中加入150μl的TBST缓冲液，室温下孵育15min，甩去缓冲液；

(2)按照说明，配制S-腺苷甲硫氨酸和EZH2酶工作液，操作始终在冰浴上进行；

(3)按照说明书所注明的比例，配制空白对照品，底物对照品，阳性对照品和抑制剂对照品；

(4)将配制好的各对照品和待测试的样品(各组肿瘤蛋白提取物取代EZH2酶)分别加入反应孔中，50μl/孔，室温下反应1h，每个样品均设2个平行孔；各组肿瘤蛋白提取物获得方法详见如上(四)动物实验部分。洗板封闭：每个反应孔加入200μl TBST缓冲液洗板，重复3次；再向每个反应孔加入100μl封闭缓冲液，摇床上摇动封闭10min，弃去液体；

(5)将稀释好的一抗工作液加入反应孔中，100μl/孔，摇床上反应1h；

(6)洗板封闭，同操作(5)；

(7)将稀释好的HRP标记的二抗工作液加入反应孔中，100μl/孔，摇床上反应30min；

(8)洗板封闭，同操作(5)；

(9)将HRP化学发光底物A和B在冰浴上等体积混合均匀后，加入反应孔中，100μl/孔；

(10)立即在酶标仪上读取荧光数值

4、实验结果(见表4)

表4茶氨酸氯香酰胺对体内调节与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关酶活性的影响

注：^*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。H3和H4乙酰化水平(％)通过Westem Blotting分析获得，方法详见如下实施例8部分内容。

实施例8：茶氨酸氯香酰胺对组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)酶活性抑制作用的实验；

5、实验动物，细胞系、仪器和主要试剂

EpiQuik HDAC Activity/Inhibition Assay Kit(Colorimetric)，Epigentek公司；

EpiQuik Nuclear Extraction Kit，Epigentek公司；

2、实验步骤：

(1)严格按照EpiQuik Nuclear Extraction Kit说明书的操作要求，制备药物处理的肿瘤核提取物见上述(四)动物实验部分；每个样品均设2个平行孔；

(2)在每个反应孔中加入样品稀释液50μll，封板膜封板后室温下反应30min；

(3)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液150μl，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；

(4)将2μl的HDAC酶或肿瘤组织核提取物分别与28μl的样品稀释液混匀，加入孔中，封板膜封板后37℃下反应60min；

(5)洗板3次，操作同(2)；将稀释好的捕捉抗体工作液加入到每个反应孔中，50μl/孔，室温下在摇床上反应60min；

(6)洗板4次，操作同(2)；

(7)将稀释好的检测抗体工作液加入到每个反应孔中，50μl/孔，室温下反应30min；

(8)洗板5次，操作同(2)；

加入显色剂，100μl/孔，室温下避光显色2-10min；

(9)当标准品孔的颜色变为中等强度的蓝色时，每孔加入50μl的终止液终止反应，此时蓝色立转黄色；

(10)450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行；

(12)酶活性抑制率按照以下公式计算：

抑制率％^*＝[1-(OD阳性对照-OD样品)/(OD阳性对照-OD空白对照)]*100％^*

3、实验结果(见表4)

实施例9：茶氨酸氯香酰胺对多种肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病和免疫缺陷疾病以及炎症等等密切相关蛋白因子水平调控作用实验

应用Western Blotting法检测茶氨酸氯香酰胺对以下肿瘤相关蛋白因子水平调控作用，步骤如下：

1、主要试剂和仪器：

抗体：VEGFR，EGFR，c-Met，K-Ras，H-Ras，Akt，Cyclin D1，β-catenin，Bcl-2，Bax，p53，p21，E-cadherin，Caspase3蛋白一抗购于美国Cell Signaling Technology公司和Santa Cruz Technology公司；H3乙酰化、H4乙酰化和HDAC(HDAC3和HDAC4等)Antibody Sample Kit抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

RPMI-1640，DMEM培养液和已灭活胎牛血清购于Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)购于Amersco公司；蛋白质分子Marker、0.4％^*台盼蓝：购于美国Sigma公司；PVDF膜购于Millipore公司；

总蛋白裂解液和核蛋白裂解液以及PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液购于碧云天生物技术研究所；二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、辣根过氧化物酶标记驴抗山羊、彩色预染蛋白分子量标准、ECL Plus发光试剂盒、定影粉、显影粉购于碧云天生物技术研究所；医用X射线胶片购于柯达公司。

二氧化碳培养箱：3111型，美国Thermo公司；倒置显微镜：CKX31型，日本Olympus公司；台式高速冷冻离心机：5810R型，德国Eppendorf公司；微量加样器：德国Eppendorf公司；细胞培养塑料平板(6孔)：Nunclon公司；小型垂直电泳槽：美国BIO-RAD公司；小型湿式电转移槽：美国BIO-RAD公司；脱色摇床：TS-1型，江苏海门市基林贝尔仪器制造有限公司；制冰机：XB70型，GRANT公司；OMEGA10凝胶成像分析仪：美国μlTRA LUM公司；封口机：SF-B型，温州市兴业机械有限公司；蛋白分析灯箱：上海荆轲实业有限公司。

2、实验步骤：

(1)细胞处理：取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞密度长至70％^*～80％^*左右，分别向细胞中加入茶氨酸氯香酰胺和环磷酰胺，使其终浓度分别为16-1500μM/L，另设无药物含溶媒(0.01％^*DMSO)等体积细胞培养液的对照组，继续培养48h后，收集细胞；

(2)细胞蛋白提取：用冷PBS洗2次后，用总蛋白或核蛋白细胞裂解液裂解细胞，1mL裂解液中加入10μl PMSF，反复吹打混匀，冰上放置15min；将样品转移至1.5mL EP管中，14000r/min，4℃离心10min，将上清转移到无菌EP管中，-80℃保存；

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：使用等量的蛋白裂解液样品分离蛋白、转膜、封闭、先后分别使用适当的一抗和二抗处理、洗膜之后、用ECL试剂盒显色，X光片曝光检测印迹蛋白条带；用Gel-Pro Analyzer进行灰度定量分析，对照与药物处理各浓度组分别与各自的内参的光密度值相比，所得的比值分别与对照组相比，半定量蛋白表达水平。

6、实验结果(见表5和表6)

表5茶氨酸氯香酰胺抑制肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关的蛋白因子

注：p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

表中有关蛋白因子均分别来自于由茶氨酸氯香酰胺或环磷酰胺或DMSO溶媒处理的人乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、白血病等癌细胞系的蛋白裂解液，用Western blotting检测分析的结果。

表6茶氨酸氯香酰胺对与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关蛋白因子水平和酶活性的影响

注：^*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

#：有关肿瘤抑制蛋白p53、细胞周期抑制蛋白p21、细胞凋亡水解酶Caspase-3、细胞胞浆与线粒体细胞色素C之比和细胞粘附蛋白E-cadherin均分别来自于由茶氨酸氯香酰胺或环磷酰胺或DMSO溶媒处理的乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、白血病等癌细胞系的蛋白裂解液，用Western blotting检测分析的结果。

实施例10：茶氨酸氯香酰胺对核蛋白因子NF-κB(p65)-DNA binding活性抑制作用体外实验(EMSA)

1、主要试剂和仪器：

化学发光法EMSA试剂盒：美国Pierce Biotechnology公司；

生物素标记EMSA探针NF-κB：美国Pierce Biotechnology公司；

蛋白质分子Marker和0.4％^*台盼蓝：美国Sigma公司；PVDF膜：Millipore公司；

核蛋白裂解液、PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液：碧云天生物技术研究所

彩色预染蛋白分子量标准、ECL Plus发光试剂盒、定影粉、显影粉：碧云天生物技术研究所。医用X射线胶片：柯达公司。

2、实验步骤：

分别用16-500μM/L的茶氨酸氯香酰胺、50-1000μM/L环磷酰胺和DMSO(0.01％^*)处理癌细胞48小时后获得细胞核蛋白提取物，方法详见实施例6实验部分内容。NF-κB(p65)-DNAbinding活性抑制作用体外实验应用美国PierceBiotechnology公司的化学发光法EMSA试剂盒，实验方法严格按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：

(1)EMSA胶的配制

EMSA胶的配制如下表所示。药物处理的细胞经核蛋白提取液(碧云天生物技术研究所提供)提取后的核蛋白提取物10微克/管分别用于如下所示的样品反应和电泳检测分析。

表7-1关于4％^*聚丙烯酰胺凝胶的配制

(2)预电泳：将胶固定在电泳槽中，加满0.5×TBE电泳缓冲液，按照10V/厘米的电压电泳90分钟。探针结合反应如下：

表7-2阴性对照反应

表7-3样品反应

按照上表依次加在EP管中，混匀室温静置15分钟，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合。分别加入生物素标记的探针NF-κB1μl，室温静置20分钟。

(3)电泳：换新鲜的0.5×TBE电泳缓冲液，按照10V/厘米的电压电泳1.5小时，确保胶的温度不超过30℃。

(4)转膜：EMSA胶上核蛋白因子与结合的探针转到尼龙膜过程是在380mA冰浴中电转40分钟。

(5)紫外交联：将尼龙膜放在254nm的紫外灯下照射15分钟。

(6)化学发光法检测生物素标记探针：取封闭液封闭交联过的尼龙膜、按试剂盒要求对处理的膜X光片曝光、显影和定影，分析结果。

3、实验结果

表8茶氨酸氯香酰胺对与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关核蛋白因子NF-κB(p65)与DNA活性的抑制作用

§使用体内肿瘤组织核蛋白裂解液检测时茶氨酸氯香酰胺和环磷酰胺腹腔注射均为25mg/kg用量。

补充说明：本专利申请和其中成果相关的研究工作受国家863课题“肿瘤蛋白质分子标志物的研究与开发(2012AA020206)”和山东省科技发展计划项目“酯型儿茶素EGCG等活性成分结构改造优化和抗癌候选新药的研究(2009GG10002087)”资助。

Claims

1.茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素和茶氨酸乙酯在制备预防和治疗人肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌和慢性白血病、淋巴瘤以及黑色素瘤等肿瘤的药物中的应用。

2.茶氨酸氯香酰胺及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素和茶氨酸乙酯在制备组蛋白转甲基酶EZH2抑制剂中的应用。

3.茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素和茶氨酸乙酯在制备组蛋白脱乙酰酶抑制剂中的应用。

4.茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素和茶氨酸乙酯在制备促肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷病等疾病相关的因子NF-κB抑制剂中的应用。

5.茶氨酸氯香酰胺(TClC)及其中间体化合物6-氯-3-羧酸香豆素和茶氨酸乙酯在制备下调促肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷病等疾病相关的因子VEGFR，EGFR，c-Met，K-Ras，H-Ras，Akt，Cyclin D1，β-catenin和Bcl-2/Bax等蛋白水平和上调p53，p21，E-cadherin，Caspase3及胞浆细胞色素C蛋白水平中的应用。