CN103372012B

CN103372012B - 茶氨酸等在制备具有预防和治疗癌症等疾病的产品中的应用

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Publication number: CN103372012B
Application number: CN201210138933.8A
Authority: CN
Inventors: 张国营; 刘昆; 张颖; 吴犇昊
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhang Guoying
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2032-04-28
Also published as: CN106074484A; CN106074485B; CN105963288A; CN103372012A; CN105997971A; CN106074485A

Abstract

本发明涉及医疗技术领域。茶氨酸为茶叶的特征性氨基酸，能抑制人胰腺癌、宫颈癌、胃癌和乳腺癌等癌细胞的生长和侵袭，在体内能显著抑制肿瘤的生长，其抑制效果超过抗癌药物环磷酰胺等；作用机制涉及到下调抑制肿瘤生长、侵袭和转移密切相关的受体、信号传导调控蛋白和激酶水平及核因子与DNA结合，同时，上调抑癌蛋白和细胞周期抑制蛋白等因子；茶氨酸能直接抑制组蛋白脱乙酰酶和组蛋白转甲基酶EZH2的活性以及炎症因子NF‑κB与DNA的结合。此外，茶氨酸能与6‑氟‑4‑羟基香豆素(X)协同成倍提高对这些肿瘤细胞生长和侵袭的抑制，其活性超过环磷酰胺等。本发明提供了茶氨酸及其与X协同在预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管和免疫缺陷等疾病中的新用途。

Description

茶氨酸等在制备具有预防和治疗癌症等疾病的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体涉及茶氨酸及其与6-氟-4-羟基香豆素混合物在制备预防和治疗肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病抑制剂中的应用。

背景技术

人胰腺癌、宫颈癌、胃癌和雌激素受体阴性的人乳腺癌等恶性肿瘤的非正常生长、侵袭和转移是导致每年数以万记患者死亡的重要原因，其发病也保持一定的水平，已经成为严重危害人类健康的重大疾病。由于临床化疗和放疗的毒副作用，限制了对其有效的防治。茶氨酸(又名谷氨酰乙胺)为茶叶中一种表明其品质优劣的特征性氨基酸，由于是无毒副作用的食品成分，使其成为无限制用量的食品添加剂，香豆素也证明在每日7克食用无毒副作用，使其得以广泛用于食品工业,研究表明：茶氨酸能够增高抗癌药物在肿瘤中的浓度而协同增效治疗人卵巢癌(Sadzuki et al.,Toxicol Lett.123:159-67,2001)。我们先前的实验证明茶氨酸有抑制肝癌和肺癌的作用(Liu，et al.,Cytotechnology 59:211-217,2009；Zhang et al.Biosci BiotechnolBiochem.2002,66(4):711-6.)。

组蛋白转甲基酶EZH2抑制剂和蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)，valproic acid,和sodium butyrate等已经在美国进行了I期或II期血液和实体肿瘤临床试验,EZH2和HDAC在多种人的癌症包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、宫颈癌、肠癌和肝癌等恶性肿瘤中过度表达，美国对其作用抗癌药物靶点进行了大量的研究，这些EZH2抑制剂和HDAC抑制剂被广泛应用于各种肿瘤疾病的治疗中，被认为是应用前景较好的潜在的新型抗癌药物(Yamaguchi et al.,Cancer Sci.,10:355-62,2010；Denis,et al.,Clin Exp Metastasis 25:183–189,2008；Kelly et al.,Nat Clin Pract Oncol 2:150–157,2005；Martínez-Iglesias et al.,Clin TranslOncol.10:395-8,2008)。

核蛋白因子NF-κB被认为是促进多种肿瘤和炎症及心脑血管、免疫缺陷病等疾病的蛋白因子，正成为防治这类疾病的重要药物靶点(Ishii et al.,JClin Biochem Nutr.50:91-105,2012)。

高水平的受体VEGFR、EGFR和c-Met、非正常高表达的肿瘤信号传导相关的蛋白因子K-Ras,H-Ras，Akt，Cyclin D1,β-catenin和Bcl-2与多种肿瘤发生和恶化发展相关，而上调肿瘤抑制蛋白p53，p21，E-cadherin，Caspase3，Bax和胞浆细胞色素C水平显示了对多种癌细胞生长、侵袭和(或)转移的抑制作用(Cengel,et al.,Neoplasia 9:341-8,2007；Huang et al.,BiochemPharmacol.77:794-803,2009；Prasad et al.,Oncology.73:112-7,2007)，因此，这些癌症相关因子成为潜在的防治癌症的重要药物靶点，能够有效地影响这些蛋白因子表达水平和活性的化合物具有广泛防治癌症的应用前景。

本发明提供的茶氨酸具有显著的影响上述一系列蛋白因子的水平和活性，在制备预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管疾病和免疫缺陷病等疾病抑制剂的应用中应该有广阔的前景。

发明内容

1、本发明的目的是提供茶氨酸及其与6-氟-4-羟基香豆素混合物在制备预防和治疗肿瘤的炎症及心脑血管等疾病抑制剂中的应用。

2、本发明提供茶氨酸在制备组蛋白转甲基酶EZH2抑制剂中的应用。

3、本发明提供茶氨酸在制备组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的应用。

4、本发明提供茶氨酸在制备促肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子NF-κB抑制剂中的应用。

5、本发明提供茶氨酸在制备肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子VEGFR，EGFR,c-Met,K-Ras,H-Ras，Akt,Cyclin D1,β-catenin,Bcl-2/Bax抑制剂和上调p53，p21，E-cadherin,Caspase3,胞浆与线粒体细胞色素C之比激活剂中的应用。

6、茶氨酸(theanine)和6-氟-4-羟基香豆素(6-Fluoro-4-hydroxycoumarin)的化学结构式如下：

7、茶氨酸(编号：660981)和6-氟-4-羟基香豆素(编号：543748)可购自美国Sigma公司(网址：http://www.sigmaaldrich.com)，Sigma公司提供的化合物库中的化合物。

8、细胞系和细胞培养：人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela(epitheloidcarcinoma Hela)购于美国American Type Culture Collection。PANC-1和Hela细胞分别用DMEM和RPMI-1640培养液培养；

9、仪器设备：

二氧化碳培养箱：3111型，美国Thermo公司；倒置荧光显微镜：TE2000-U型，日本Nikon公司。倒置显微镜：CKX31型，日本Olympus公司；台式高速冷冻离心机：5810R型，德国Eppendorf公司；微量加样器：德国Eppendorf公司；细胞培养塑料平板(96孔)：BD公司；酶标仪：SYNERGY HT型，美国BIO-TEK公司；制冰机：XB 70型，GRANT公司。

具体实施方式

下面结合实例及附表对本发明进行详细描述。

(一)实施例1：茶氨酸及其与6-氟-4-羟基香豆素混合物体外抑制癌细胞生长抑制实验：

实验采用MTT法测试茶氨酸及其与6-氟-4-羟基香豆素混合物在体外条件下对癌细胞生长的抑制作用。步骤如下：

1、主要试剂、细胞系和仪器:

人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela细胞系和仪器如上所述。

RPMI1640和DMEM培养液：Hyclone公司；已灭活胎牛血清：Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％台盼蓝：Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司；

2、实验步骤:

(1)用0.25％的胰蛋白酶消化对数生长期的癌细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁴/mL，以100μl每孔接种于96孔培养板；

(2)将培养板移入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h；加入茶氨酸16-1000μM/L、6-氟-4-羟基香豆素或茶氨酸与6-氟-4-羟基香豆素混合物(1-1000μM/L)，或阳性药物对照(环磷酰胺CTX)，其终浓度为16-1500μM/L。设对照孔(只加细胞悬液200μl)和无药物空白对照孔(含溶媒0.01％DMSO)，每组均设8个复孔，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养；

(3)分别于加药48h、72h后取出96孔板，小心吸弃原培养基，每孔加入100μl无血清的DMEM培养基及10μl MTT(5mg/mL)溶液，继续培养4h后，终止培养；

(4)小心吸弃孔内上清液，每孔加入150l DMSO，室温震荡10-15min，使结晶充分溶解。

(5)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值(A值)，记录结果；

(6)实验重复3次；

(7)实验结果按下式计算：相对存活率＝(各实验组A值/细胞对照组A值)×100％

中效浓度(IC50，即抑制率为50％时的药物浓度，又称半数抑制浓度)的计算：用回归方程求出茶氨酸的IC50。

3、实验结果(见表1)

表1茶氨酸单独和与6-氟-4-羟基香豆素协同抑制人癌细胞的生长作用

注：*p＜0.05；有关MTT测试细胞生长的方法见上述实验方法部分。

§为茶氨酸(T)、6-氟-4-羟基香豆素(X)或T+X处理48小时抑制50％癌细胞成活的药物浓度(IC50)。

(二)实施例2：茶氨酸及其与香豆素混合物体外抑制癌细胞侵袭抑制实验：

1、主要试剂、细胞系和仪器:

人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela细胞系和仪器如上所述。

RPMI1640和DMEM培养液：Hyclone公司；已灭活胎牛血清：Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；碘化丙啶(PI)：美国Sigma公司。

Matrigel、Fibronectin：美国B D公司；Transwell Chamber：美国Costar公司；细胞培养塑料平板(24孔)：BD公司。

2、实验步骤:

(1)将Transwell小室置于24孔板内，分别将Fibronectin和Matrigel按100μl/孔均匀地铺在经小室底部聚碳酯膜上，37℃孵育2h后置超净工作台中风干；

(2)收集细胞，上室按5×10⁵/ml密度加入100μl细胞悬液并同时加入不同浓度的茶氨酸(1-16μM/L)或茶氨酸与6-氟-4-羟基香豆素混合物(1-30μM/L)，或阳性药物对照(环磷酰胺CTX)，其终浓度为10-50μM/L，设无药物空白对照孔(含溶媒0.01％DMSO)，下室加入660μl含10％FBS的培养液，37℃孵育16h；

(3)取出小室，加入冷甲醇固定后风干；

(4)PI染色1h，去除没有迁移或侵袭的细胞，于200倍显微镜下计数侵袭细胞数，每膜计数上中下左右5个不同视野的透过细胞数，计算平均值，每组平行设3孔。以侵袭细胞的相对数目分别表示肿瘤细胞的侵袭能力；

实验结果按下式计算：侵袭抑制率＝(l－实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100％。用回归方程求出茶氨酸的IC50。

3、实验结果

实验结果(见表2)

表2茶氨酸单独和与6-氟-4-羟基香豆素协同抑制人癌细胞的侵袭作用

注：*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

§为癌细胞经茶氨酸(T)、6-氟-4-羟基香豆素(X)或T+X处理16小时达到50％侵袭抑制率作用的药物浓度(IC50)。

(三)实施例3：茶氨酸抑制裸鼠体内人癌移植瘤生长作用的实验

1、实验动物，细胞系，主要试剂和仪器:

SPF级BALB/c裸小鼠，4～5周龄，18～22g，雄性，购自北京华阜康实验动物中心，动物许可证号SCXK(京)2009-0004,饲养于SPF级动物实验室；IVC独立送回风笼,苏州苏杭科技器材有限公司；人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela细胞系和其它仪器如上所述。

RPMI1640和DMEM培养液：Hyclone公司；已灭活胎牛血清：Hyclone公司，-20℃保存；胰蛋白酶(trypsin)：Amersco公司；0.4％台盼蓝：Sigma公司；

2、实验步骤:

(1)细胞培养和移植性肿瘤动物模型的建立：人胰腺癌PANC-1和人宫颈癌Hela癌细胞株分别培养于含10％胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培养液中，在37℃、5％CO₂的条件下培养，收集对数生长期的细胞并制备成浓度为2×10⁷个/ml的单细胞悬液，于超净工作台内每只裸小鼠于左右大腿部(对PANC-1细胞移植)或右大腿部(对Hela细胞移植)皮下分别接种0.1ml细胞悬液,每天观察各注射点有无红肿破溃。约2周后，注射局部出现明显皮丘，所有裸鼠均出现直径约8-10mm的皮下结节,移植瘤模型建立；

(2)裸鼠分组和给药：于接种第约2周后将已建立皮下移植瘤模型的裸小鼠随机分为3组，每组7只；阴性对照组(溶媒DMDO 0.05％，腹腔注射0.2ml/只，每2-3日一次；阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺(25mg/kg)，茶氨酸组，腹腔注射茶氨酸(25mg/kg)，每2-3日一次(PANC-1肿瘤每2日一次；Hela肿瘤每3日一次)；对PANC-1移植瘤用药治疗22天，对Hela移植瘤用药治疗29天；对于检测药物对体内肿瘤EZH2H和DAC酶酶活性的影响，在用药6小时后分别切除肿瘤，分别提取总蛋白和提取核蛋白用于酶活性检测分析，用阴性对照为DMSO(0.05％)溶媒、阳性对照SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)25mg/kg鼠)或化合物茶氨酸(T/25mg/kg鼠)处理小鼠6小时后取瘤，总蛋白和核蛋白提取物由总蛋白裂解液和核蛋白裂解液提取(总蛋白裂解液、核蛋白裂解液以及PMSF购于碧云天生物技术研究所)，1mg肿瘤组织加人1mL裂解液中加入10μl PMSF，反复吹打混匀，冰上放置15min；将样品转移至1.5mL EP管中，14000r/min，4℃离心10min，将上清蛋白提取物转移到无菌EP管中用于检测酶活性。

(3)裸鼠肿瘤瘤体生长的观察：每天观察裸鼠的活动情况(包括进食、大小便性状、精神状态等)、移植瘤的出瘤时间及生长情况，每2-3天测量一次体重、瘤体的大小，用游标卡尺量瘤体的长径a及短径b(mm)，计算其体积，体积V＝π1/2·ab2(mm3)；

(4)动物的处死：治疗实验结束，麻醉小鼠，照相；断颈处死裸鼠，在无菌条件下剥离瘤组织，称取瘤重；检测药物对各器官和组织的病理和毒性影响情况。

(5)通过实验组移植瘤的瘤重与空白对照组瘤重相比较计算抑瘤率，即抑瘤率(％)＝(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤重)×100％。

3.实验结果(见表3)

表3茶氨酸对三种人癌动物移植瘤体内生长的抑制作用*

注：*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

§抑制率％是与DMSO溶媒对照组相比较、对肿瘤重量的抑制率(％)。

动物病理和毒理学分析结果表明：在实验期间，我们使用茶氨酸处理处理正常的动物和治疗的人癌移植瘤裸鼠，未见茶氨酸产生毒副作用，体重未见减少，心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、骨骼肌未见毒性。

阳性对照药物环磷酰胺组小鼠有毒性反应，表现体重下降、厌食、用药2周后出现腹部肿胀和行动避缓等现象。

(四)实施例4：茶氨酸对动物体内EZH2酶活性抑制作用实验；

1、实验动物，细胞系、仪器和主要试剂、:

实验动物裸小鼠，细胞系和仪器详见上述(四)动物实验部分。

EZH2Assay Kit，购自BPS Bioscience公司。

检测茶氨酸对EZH2酶活性的抑制作用，实验方法严格按照试剂盒附带的说明书操作,步骤如下：

2、实验步骤：

(1)向微孔板中每个反应孔中加入150μl的TBST缓冲液,室温下孵育15min,甩去缓冲液；

(2)按照说明,配制S-腺苷甲硫氨酸和EZH2酶工作液,操作始终在冰浴上进行；

(3)按照说明书所注明的比例,配制空白对照品,底物对照品,阳性对照品和抑制剂对照品；

(4)将配制好的各对照品和待测试的样品(各组肿瘤蛋白提取物取代EZH2酶)分别加入反应孔中,50μl/孔,室温下反应1h,每个样品均设2个平行孔；各组肿瘤蛋白提取物获得方法详见如上(四)动物实验部分。洗板封闭:每个反应孔加入200μl TBST缓冲液洗板,重复3次；再向每个反应孔加入100μl封闭缓冲液,摇床上摇动封闭10min,弃去液体；

(5)将稀释好的一抗工作液加入反应孔中,100μl/孔,摇床上反应1h；

(6)洗板封闭,同操作(5)；

(7)将稀释好的HRP标记的二抗工作液加入反应孔中,100μl/孔,摇床上反应30min；

(8)洗板封闭,同操作(5)；

(9)将HRP化学发光底物A和B在冰浴上等体积混合均匀后,加入反应孔中,100μl/孔；

(10)立即在酶标仪上读取荧光数值

3、实验结果(见表4)

表4茶氨酸对体内调节与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关酶活性的影响

注：*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。H3和H4乙酰化水平(％)通过Western Blotting分析获得，方法详见如下(七)实施例6部分内容。

(五)实施例5：茶氨酸对组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)酶活性抑制作用的实验；

1、实验动物，细胞系、仪器和主要试剂

EpiQuik HDAC Activity/Inhibition Assay Kit(Colorimetric)，Epigentek公司；

EpiQuik Nuclear Extraction Kit，Epigentek公司；

2、实验步骤：

(1)严格按照EpiQuik Nuclear Extraction Kit说明书的操作要求，制备药物处理

的肿瘤核提取物见上述(四)动物实验部分；每个样品均设2个平行孔；

(2)在每个反应孔中加入样品稀释液50μll,封板膜封板后室温下反应30min；

(3)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液150μl，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；

(4)将2μl的HDAC酶或肿瘤组织核提取物分别与28μl的样品稀释液混匀,加入孔中,封板膜封板后37℃下反应60min；

(5)洗板3次，操作同(2)；将稀释好的捕捉抗体工作液加入到每个反应孔中,50μl/孔,室温下在摇床上反应60min；

(6)洗板4次，操作同(2)；

(7)将稀释好的检测抗体工作液加入到每个反应孔中,50μl/孔,室温下反应30min；

(8)洗板5次，操作同(2)；

加入显色剂,100μl/孔,室温下避光显色2-10min；

(9)当标准品孔的颜色变为中等强度的蓝色时,每孔加入50μl的终止液终止反应,此时蓝色立转黄色；

(10)450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行；

(12)酶活性抑制率按照以下公式计算:

抑制率％＝[1-(OD阳性对照-OD样品)/(OD阳性对照-OD空白对照)]*100％

3、实验结果(见表4)

(六)实施例6：茶氨酸对多种肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病和免疫缺陷疾病以及炎症等等密切相关蛋白因子水平调控作用实验

应用Western Blotting法检测茶氨酸对以下肿瘤相关蛋白因子水平调控作用，步骤如下：

1、主要试剂和仪器:

抗体：VEGFR，EGFR,c-Met,K-Ras,H-Ras，Akt,Cyclin D1,β-catenin,Bcl-2,Bax,p53，p21，E-cadherin,Caspase3蛋白一抗购于美国Cell SignalingTechnology公司和Santa Cruz Technology公司；H3乙酰化、H4乙酰化和HDAC(HDAC3和HDAC4等)Antibody Sample Kit抗体购自美国CellSignaling Technology公司。RPMI-1640,DMEM培养液和已灭活胎牛血清购于Hyclone公司；胰蛋白酶(trypsin)购于Amersco公司；蛋白质分子Marker、0.4％台盼蓝：购于美国Sigma公司；PVDF膜购于Millipore公司；

总蛋白裂解液和核蛋白裂解液以及PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液购于碧云天生物技术研究所；二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、辣根过氧化物酶标记驴抗山羊、彩色预染蛋白分子量标准、ECL Plus发光试剂盒、定影粉、显影粉购于碧云天生物技术研究所；医用X射线胶片购于柯达公司。

2、实验步骤:

(1)细胞处理：取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞密度长至70％～80％左右，分别向细胞中加入茶氨酸和环磷酰胺，使其终浓度分别为16-1500μM/L，另设无药物含溶媒(0.01％DMSO)等体积细胞培养液的对照组，继续培养48h后，收集细胞；

(2)细胞蛋白提取：用冷PBS洗2次后，用总蛋白或核蛋白细胞裂解液裂解细胞，1mL裂解液中加入10μl PMSF，反复吹打混匀，冰上放置15min；将样品转移至1.5mL EP管中，14000r/min，4℃离心10min，将上清转移到无菌EP管中，-80℃保存；

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：使用等量的蛋白裂解液样品分离蛋白、转膜、封闭、先后分别使用适当的一抗和二抗处理、洗膜之后、用ECL试剂盒显色，X光片曝光检测印迹蛋白条带；用Gel-Pro Analyzer进行灰度定量分析，对照与药物处理各浓度组分别与各自的内参的光密度值相比，所得的比值分别与对照组相比，半定量蛋白表达水平。

3、实验结果(见表5和表6)

表5茶氨酸抑制肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关的蛋白因子

注：p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

表中有关蛋白因子均分别来自于由茶氨酸或环磷酰胺或DMSO溶媒处理的人胰腺癌PANC-1、人宫颈癌Hela、人胃癌BGC-823和人乳腺癌MDA-MB-231等细胞系的蛋白裂解液，用Western blotting检测分析的结果。

表6茶氨酸对与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关蛋白因子水平和酶活性的影响

注：*p＜0.05；有关测试方法见上述实验方法部分。

#:有关肿瘤抑制蛋白p53、细胞周期抑制蛋白p21、细胞凋亡水解酶Caspase-3、细胞胞浆与线粒体细胞色素C之比和细胞粘附蛋白E-cadherin均分别来自于由茶氨酸或环磷酰胺或DMSO溶媒处理的人胰腺癌PANC-1、人宫颈癌Hela、人胃癌BGC-823和人乳腺癌MDA-MB-231等细胞系的蛋白裂解液，用Western blotting检测分析的结果。

(七)实施例7：茶氨酸对核蛋白因子NF-κB(p65)-DNA binding活性抑制作用体外实验(EMSA)

1、主要试剂和仪器:

化学发光法EMSA试剂盒：美国Pierce Biotechnology公司；

生物素标记EMSA探针NF-κB:美国Pierce Biotechnology公司；

蛋白质分子Marker和0.4％台盼蓝：美国Sigma公司；PVDF膜：Millipore公司；

核蛋白裂解液、PMSF(苯甲基磺酰氟)溶液：碧云天生物技术研究所

彩色预染蛋白分子量标准、ECL Plus发光试剂盒、定影粉、显影粉：碧云天生物技术研究所。医用X射线胶片：柯达公司。

2、实验步骤:

分别用16-500μM/L的茶氨酸、50-1000μM/L环磷酰胺和DMSO(0.01％)处理PANC-1细胞和Hela细胞48小时后获得细胞核蛋白提取物，方法详见(七)实施例6实验部分内容。NF-κB(p65)-DNA binding活性抑制作用体外实验应用美国Pierce Biotechnology公司的化学发光法EMSA试剂盒，实验方法严格按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：

(1)EMSA胶的配制

EMSA胶的配制如下表所示。药物处理的细胞经核蛋白提取液(碧云天生物技术研究所提供)提取后的核蛋白提取物10微克/管分别用于如下所示的样品反应和电泳检测分析。

表7-1关于4％聚丙烯酰胺凝胶的配制

(2)预电泳：将胶固定在电泳槽中，加满0.5×TBE电泳缓冲液，按照10V/厘米的电压电泳90分钟。探针结合反应如下：

表7-2阴性对照反应

表7-3样品反应

按照上表依次加在EP管中，混匀室温静置15分钟，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合。分别加入生物素标记的探针NF-κB 1μl，室温静置20分钟。

(3)电泳：换新鲜的0.5×TBE电泳缓冲液，按照10V/厘米的电压电泳1.5小时，确保胶的温度不超过30℃。

(4)转膜：EMSA胶上核蛋白因子与结合的探针转到尼龙膜过程是在380mA冰浴中电转40分钟。

(5)紫外交联：将尼龙膜放在254nm的紫外灯下照射15分钟。

(6)化学发光法检测生物素标记探针：取封闭液封闭交联过的尼龙膜、按试剂盒要求对处理的膜X光片曝光、显影和定影，分析结果。

3、实验结果

表8茶氨酸对与肿瘤生长、侵袭和转移、心脑血管疾病、免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关核蛋白因子NF-κB(p65)与DNA活性的抑制作用

Claims

1.茶氨酸和6-氟-4-羟基香豆素混合物在制备预防和治疗人胰腺癌、宫颈癌、胃癌和雌激素受体阴性的人乳腺癌肿瘤的药物中的应用。