CN103688862A

CN103688862A - 一种荸荠组培苗高效增殖的方法

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Publication number: CN103688862A
Application number: CN201310700988.8A
Authority: CN
Inventors: 高美萍; 陈丽娟; 蔡炳华; 江文; 周瑜; 郭畅; 闭志强; 唐军; 董伟清; 周维; 杨柳
Original assignee: Biotechnology Research Institute Guangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Institute Guangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: CN103688862B

Abstract

本发明公开了一种荸荠组培苗高效增殖的方法，该方法使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行增殖培养，利用间歇浸没培养的方法，先后使用液体继代培养基和液体生根培养基进行荸荠组培苗的增殖培养。本发明方法可有效的防止营养沉积和有害物质在培养基中的积累，从而更有效利用培养基的营养成分；本发明的培养基配方适合于使用间歇浸没式培养增殖荸荠组培苗，在本发明的培养基配方和培养条件下，荸荠组培苗的长势和增殖率大大优于传统方法，生根苗移栽驯化的成活率高，缩短生产时间，提高生产效率，并且降低了生产成本和劳动力成本，可大规模推广应用。

Description

一种荸荠组培苗高效增殖的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种荸荠组培苗高效增殖的方法。

背景技术

荸荠(Eleocharis tuberosaRoem.et.Schlt)属莎草科荸荠属，又叫马蹄、乌芋、通天草等，是我国原产的一种多年水生草本植物。荸荠不仅是广西名特优农产品之一，也是我国传统的重要出口创汇产品之一。近十年来我国荸荠产业迅速发展。为了保持新品种的优良性状，学者研究发展了荸荠组织培养技术。但传统荸荠组培主要是采用半固体培养，该方法在组织培养操作过程中需要大量的手工劳动，成本高，增殖率较低，需要增殖7～8代才能获得大量组培苗，是一种劳动密集型技术。因此，改善荸荠培养工艺，建立新的培养方法体系，减少劳动力耗费，实现自动化培养是降低成本实现荸荠商业培养的一种趋势。

自20世纪80年代中期开始，西方国家开始了大规模液体浸没组织培养的研究，到90年代中后期取得了突破性的进展。间歇浸没式生物反应器(TIBs)是近20年来国际上新创造的一种用于植物组织快繁及次生代谢产物生产的系统，其主要是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式的培养，相对于传统的方法而言，它不仅拥有液体培养的优势，又避免了由于液体培养过程中周期长而带来的玻璃化畸形和次生代谢物的伤害带来的生理问题。间歇浸没式生物反应器(TIBs)自动化程度高，在两个月的培养周期中，材料无需转接，节省人力物力，在组织培养过程中大大的降低生产成本。该培养方式结合了固体培养和液体培养的优点而舍弃其缺点，使培养材料达到最大的增殖数。国外利用浸没式生物反应器进行(TIBs)进行组培快繁研究的植物组培品种较多，而国内却鲜少有相关报道。目前国内外研究报道的植物种类主要集中在果树上，水生蔬菜作物未见报道。主要有菠萝(Aragone.ral.2010)、香蕉(杨柳，2010;Ikraul akqe.ral.，2007;Roelseral.，2005;Matsumotoeral.，2002)、海葱(wroseh.ral.，2005)、辰星草(廉美兰，2004)、甘蔗(Bernale.ral.2008;刘丽敏，2009;Angelaeral.2009;杨柳，2010)、山药(Jova.ral.，2005)、木薯(Pati.ral.，2007)、桉树(MeAliste.ral.，2005)、苹果(Zhu.ral.，2005)、Aragoneq.ral.，2006)、马铃薯(Jimnez.ral.，1999)等。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的发明人经过创造性的劳动，针对荸荠的植物特点和生长特性设计了一种荸荠组培苗高效增殖的方法，该方法利用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行增殖，增殖效率高、成本低。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种荸荠组培苗高效增殖的方法，该方法使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行继代增殖培养和生根培养，包括以下步骤：

（1）将脱毒培养的荸荠组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中；

（2）利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对荸荠组培苗进行继代增殖培养；

（3）利用间歇浸没式培养方法，使用液体生根培养基对继代增殖培养后的荸荠组培苗进行生根培养。

优选地，步骤（1）所述的荸荠组培苗为第4代或第5代荸荠组培苗。

优选地，步骤（1）中，将荸荠组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中的接种密度是10～15丛/L。

优选地，步骤（2）中，液体继代培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA2.5mg/L+NAA 0.01mg/L+白糖30g/L，pH值为5.8～6.2。

优选地，步骤（2）中，间歇式浸没培养的浸没频率为每4小时浸没10分钟，连续培养40天。

优选地，步骤（3）中，液体生根培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA0.1mg/L+NAA 1.0mg/L+白糖30g/L，pH值为5.8～6.2。

优选地，步骤（3）中，间歇式浸没培养的浸没频率为每6小时浸没10分钟，连续培养30天。

优选地，在使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行继代增殖培养和生根培养的整个过程中，控制培养条件为：光照强度1500lx，培养温度28℃，压力0.05～0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d。

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：

（1）本发明使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行增殖培养，可有效的防止营养沉积和有害物质在培养基中的积累，从而更有效利用培养基的营养成分；

（2）本发明的培养基配方适合于使用间歇浸没式培养增殖荸荠组培苗，通过合适的6-BA和NAA浓度配合恰当的间歇浸没频率，在继代培养时加速了外植体的诱导分化，提高了增殖系数，在生根培养时提高了生根效果和壮苗率，生根苗移栽驯化的成活率较传统方法高；在本发明的培养基配方和培养条件下，荸荠组培苗的长势和增殖率大大优于传统方法；

（3）本发明在两个月的培养周期中，材料无需转接，降低了劳动力成本，节约了生产成本，增加经济效益；

（4）传统方法获得大量组培苗需要增殖7～8代，而本发明方法增殖2～3代即可满足，大大缩短生产时间，生产效率更高，更适于工厂规模化生产，可大规模推广应用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例使用间歇浸没式生物反应器进行荸荠组培苗的高效增殖

（1）建立无菌培养体系，选用荸荠茎尖脱毒培养的第4代组培苗，在超净工作台上，用无菌水洗去基部固体培养基，打顶，转接于间歇浸没式生物反应器容器中，接种密度为10丛/L；

（2）继代增殖培养

利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对荸荠组培苗进行继代增殖培养，继代增殖培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA 2.5mg/L+NAA0.01mg/L+白糖30g/L，pH值为6.0；浸没频率为每4小时一次，浸没时间为10分钟；控制培养条件为：光照强度1500lx，培养温度28℃，压力0.05～0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d；连续培养40天。统计增殖效果。

（4）生根培养

利用间歇浸没式培养方法，使用液体生根培养基对继代增殖培养后的荸荠组培苗进行生根培养，待增殖培养结束后，更换液体生根培养基，液体生根培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA 0.1mg/L+NAA 1.0mg/L+白糖30g/L，pH值为6.0；浸没频率为每6小时一次，浸没时间为10分钟；控制培养条件为：光照强度1500lx，培养温度28℃，压力0.05～0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d；连续培养30天。

结束生根培养后，将组培苗移栽驯化，统计成活率。

其中，MS液体培养基的各组分的质量浓度为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水合氯化钾440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸纳0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、蔗糖30g/L。

对照例使用传统固体组培进行荸荠组培苗的增殖

固体培养参照杭玲等组培快繁技术设计（荸荠脱毒及组培快繁技术研究与应用[J]．江苏农业科学2007(6):143-144、荸荠的组织培养和快速繁殖探讨[J]．浙江农业科学，2011(6)：1241—1243），培养瓶为250ml翠绿色玻璃瓶，瓶高13cm，直径7cm，固体培养基体积30ml，凝固剂用卡拉胶；培养40天时统计增殖效果与实施例进行比较，结果见表1，结束生根培养后，将组培苗移栽驯化，统计成活率。

试验例1 荸荠不同继代组培苗对荸荠组培苗增殖的影响

使用本发明方法对不同继代数的荸荠组培苗进行培养，统计萌芽时间、增殖芽数和增值系数，试验结果见表2。

试验例2 不同间歇频率对荸荠组培苗增殖的影响

使用本发明方法对荸荠组培苗进行培养，试验共分6组，在继代培养时每组采用不同的浸没间歇频率，统计各组荸荠组培苗的增殖情况，试验结果见表3。

试验例3 不同激素组合对荸荠组培苗增殖的影响

使用本发明方法对荸荠组培苗进行培养，试验共分10组，每组的液体继代培养基采用不同的激素比例，对比增殖效果，结果见表4。

试验例4 不同接种密度对荸荠组培苗增殖的影响

使用本发明方法对荸荠组培苗进行培养，试验共分5组，每组的采用不同的接种密度，统计各组荸荠组培苗的生长情况，试验结果见表5。

试验例5 不同间歇频率对荸荠组培苗生根的影响

使用本发明方法对荸荠组培苗进行培养，试验共分6组，在生根培养时每组采用不同的浸没间歇频率，统计各组荸荠组培苗的生根情况，试验结果见表6。

结果：

1.荸荠组培苗增殖效果对比

表1 对照例与实施例培养荸荠组培苗40d的效果比较

从表1可以看出，使用本发明方法增殖的荸荠组培苗增殖系数可达45.6倍，传统组培方法的荸荠组培苗增殖系数仅为8.4倍，远远高于传统固体培养方法增殖的增殖系数，且萌芽时间早、接种密度大，增殖效果优于传统固体培养方法。

2.不同继代组培苗对荸荠组培苗增殖的影响

表2 不同继代组培苗对荸荠组培苗增殖的影响

从表2可以看出，在使用间歇浸没式生物反应器培养荸荠组培苗时，第4、5、6继代材料增殖率较高，但4、5、6继代差异不显著（P>0.05），到第7代后增殖率开始降低；为了节省材料又保证高增殖率，我们选用4代或5代继代材料。

3.不同间歇频率对荸荠组培苗增殖的影响

表3 不同间歇频率对荸荠组培苗增殖的影响

适当的间歇浸没时间有利于促进植株的生长，由于荸荠为水生作物，根据品种特性，我们选择浸没时间为10min效果最好，不同于其他作物浸没时间1～3min；从表3可以看出，随着间歇时间的延长，污染率逐渐升高，增值系数也随之降低，综合考虑，选用4h的间歇时间为佳。

4.不同激素组合对荸荠组培苗增殖的影响

表4 不同激素组合对荸荠组培苗增殖的影响

从表4可以看出，在一定6-BA条件下，NAA浓度为0.05mg/L增殖系数低于NAA为0.01mg/L，且增殖系数随着6-BA浓度的增加逐渐升高；当6-BA浓度为2.0～3.0mg/L时，芽的增殖系数普遍高达40倍以上，且该浓度范围内增殖倍数的差异不显著（P>0.05），综合考虑组培苗的稳定性状，在继代培养时最适合的荸荠激素组合为6-BA 2.5mg/L+NAA 0.01mg/L。

5.不同接种密度对荸荠组培苗增殖的影响

表5 不同接种密度对荸荠组培苗增殖的影响

从表5可以看出，荸荠组培苗在TIBs系统增殖阶段中接种密度10丛/L、15丛/L、20丛/L、25丛/L差异不显著（P>0.05），增殖芽数均在450丛左右，但是污染率逐渐升高，综合考虑，为保证材料低污染率和高增殖率，接种最佳密度选择10丛/L。

6.不同间歇频率对荸荠组培苗生根的影响

表6 不同间歇频率对荸荠组培苗生根的影响

间歇频率/h	发根时间/d	根数/条	根长/cm	增殖系数
					10min/3h	12.2dD	3.2aAB	2.6aA	20.4cC
10min/4h	11.4cC	3.5bBC	2.9aA	24.3dD
					10min/5h	10.3bB	3.7bcC	3.4bB	23.5dD
10min/6h	9.2aA	3.8cC	3.6bcB	24.3eE
					10min/12h	13.6eE	3.2aAB	4.0cBC	18.1bB
10min/24h	13.9fE	2.9aA	4.5dC	15.4aA

从表6数据可以看出，相对于其他作物1～3min的浸没时间，10min的浸没时间有利于荸荠组培苗根的萌发和促进根的伸长，当间歇时间为6h时，植株根的生长情况较佳，因此综合考虑生产效率和成本，选用6h浸没一次。

7.其他

（1）荸荠组培苗生根效果比较

对照例：生根数少，根短，且发根时间长，根细，且易有创伤根和毛根；

实施例：生根数多，根系长，发根时间短，根粗，且有效功能根数多。

（2）荸荠组培苗移栽驯化成活率比较

对照例的荸荠组培苗移栽驯化成活率为85%，实施例的荸荠组培苗移栽驯化成活率为90.2%。

（3）对照例和实施例的生产成本比较

对照例生产成本为0.29/株，实施例生产成本为0.22/株。

从以上数据可知，使用本发明方法增殖的荸荠组培苗增殖系数可达45.6倍，传统组培方法的荸荠组培苗增殖系数仅为8.4倍，远远高于传统固体培养方法增殖的增殖系数，且萌芽时间早、接种密度大，增殖效果优于传统固体培养方法，使用本发明方法生根的荸荠组培苗生根效果也优于传统固体培养方法，移栽驯化成活率高于传统方法，生产成本也得到了降低。另外该生产中，传统方法获得大量组培苗需要增殖7～8代，而该方法增殖2～3代即可满足，大大缩短生产时间，效率更高，更适于工厂化生产。

Claims

1.一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行继代增殖培养和生根培养。

2.按照权利要求1所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（1）所述的荸荠组培苗为第4代或第5代荸荠组培苗。

4.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（1）中，将荸荠组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中的接种密度是10～15丛/L。

5.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（2）中，液体继代培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA 2.5mg/L+NAA0.01mg/L+白糖30g/L，pH值为5.8～6.2。

6.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（2）中，间歇式浸没培养的浸没频率为每4小时浸没10分钟，连续培养40天。

7.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（3）中，液体生根培养基的配方为：MS液体培养基+6-BA 0.1mg/L+NAA1.0mg/L+白糖30g/L，pH值为5.8～6.2。

8.按照权利要求2所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：步骤（3）中，间歇式浸没培养的浸没频率为每6小时浸没10分钟，连续培养30天。

9.按照权利要求1～6任一项所述的一种荸荠组培苗高效增殖的方法，其特征在于：

在使用间歇浸没式生物反应器对荸荠组培苗进行增殖培养的整个过程中，控制培养条件为：光照强度1500lx，培养温度28℃，压力0.05～0.08Mpa，光照16h/d，黑暗8h/d。