CN103675300A - Rbx1作为血清标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents
Rbx1作为血清标志物的应用及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了RBX1作为血清标志物的应用，RBX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，RBX1作为血清标志物可用于诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌等；本发明还公开了RBX1血清检测试剂盒，该试剂盒能够用于肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的移转复发监控等，具有特异性好、灵敏度高等优点，可早于体征发现，具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明属于用于癌症的标志物，具体涉及RBX1作为血清标志物的应用，还涉及RBX1的血清检测试剂盒。
背景技术
RBX1（Ring-box1）蛋白，又称为ROC1蛋白，是泛素连接酶E3复合物—SCF复合物的组成成分，蛋白保守程度高。RBX1蛋白由Rbx1基因（NM_014248）编码，该基因定位于22号染色体22q13.2区，cDNA全长为521bp，开放阅读框为327bp，编码108个氨基酸，预测蛋白的分子量大约为12kDa。RBX1也能与其他亚基相互作用形成复合物发挥泛素连接酶作用，如RBX1与eullin-1形成异源二聚体从而催化泛素化进程，在蛋白的泛素化过程中发挥了重要的作用。蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。泛素介导的蛋白质降解参与到细胞周期、炎症反应、细胞凋亡、抗原提呈等许多生命过程中。因此，泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病，如恶性肿瘤、肌肉萎缩等的发生密切相关。Jia等通过免疫组织化学方法检测RBX1在肺癌、肝癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌中过表达，且通过基因沉默可刺激细胞死亡、细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞生长，表明ROC1可作为抗肿瘤靶点（RBX1/ROC1-SCF E3ubiquitin ligase is required formouseembryogenesis and cancer cell survival.Cell Division2009，4：16；ROC1/RBX1E3Ubiquitin Ligase Silencing Suppresses Tumor CellGrowth via Sequential Induction of G2-MArrest，Apoptosis，and Senescence Lijun Jia，Maria S.Soengas，and Yi Sun.Cancer Res2009；69：（12）.June15，2009）。Wei等公开了RBX1在肿瘤细胞中过表达，抑制RBX1可使肿瘤细胞衰老、凋亡，同时抑制RBX1也影响正常组织细胞（Small RING Finger Proteins RBX1and RBX2of SCF E3Ubiquitin Ligases：The Role in Cancer and as Cancer Targets.Genes&Cancer1.（7）700–707.2010）。后续研究证实通过降低RBX1表达能够抑制肝癌细胞的生长和分化，并且ROC1表达水平与预后相关，可作为肝癌干预的靶点。在其他癌症中，诸如膀胱癌和非小细胞肺癌也与RBX1表达相关，可以作为治疗靶点和疾病诊断。
虽然目前已在不同的组织细胞中检测到RBX1，且与其肿瘤（如肝癌、乳腺癌、肠癌）相关，以及与癌细胞的生长和分化相关，但目前为止RBX1的可溶形式从未被提及，即RBX1在血清中的存在与癌细胞的相关未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供RBX1作为血清标志物的应用；本发明的目的之二在于提供RBX1血清检测试剂盒。
为实现上述发明目的，提供如下技术方案：
RBX1作为血清标志物的应用，所述RBX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述血清标志物为诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的血清标志物。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2.RBX1血清检测试剂盒，所述试剂盒含有捕获血清RBX1的捕获剂，所述RBX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述捕获剂为特异识别RBX1的抗体。
优选的，所述捕获剂为兔RBX1单克隆抗体。
优选的，所述捕获剂固定于固相载体上。
更优选的，所述固相载体为酶标板。
更优选的，所述试剂盒还含有酶标多克隆抗体和显色底物。
优选的，所述酶标多克隆抗体为HRP标记的鼠RBX1多克隆抗体，所述显色底物TMB。
本发明的有益效果在于：本发明公开了RBX1作为血清标志物的应用，因此可以通过检测血清中的RBX1来诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌等疾病，检测血清具有取样方便，给患者带来的痛苦较少；本发明还公开了RBX1血清检测试剂盒，该试剂盒能够用于肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的移转复发监控等，具有特异性好、灵敏度高等优点，可早于体征发现，具有重要的临床意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为RBX1血清检测试剂盒检测肠癌患者与健康人血清中RBX1浓度散点图。
图2为RBX1血清检测试剂盒检测肠癌患者与健康人血清的ROC曲线。
图3为RBX1血清检测试剂盒检测肝癌患者与健康人血清中RBX1浓度散点图。
图4为RBX1血清检测试剂盒检测肝癌患者与健康人血清的ROC曲线。
图5为RBX1血清检测试剂盒检测乳腺癌患者与健康人血清中RBX1浓度散点图。
图6为RBX1血清检测试剂盒检测乳腺癌患者与健康人血清的ROC曲线。
图7为RBX1血清检测试剂盒检测胃癌患者与健康人血清中RBX1浓度散点图。
图8为RBX1血清检测试剂盒检测胃癌患者与健康人血清的ROC曲线。
图9为RBX1血清检测试剂盒检测胰腺癌患者与健康人血清的RBX1浓度散点图。
图10为RBX1血清检测试剂盒检测胰腺癌患者与健康人血清的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1建立RBX1血清检测反应体系
将浓度为5μg/mL兔RBX1单克隆抗体包被ELISA板，于4℃条件下包被过夜，洗板；然后每孔加入200μL酶标板稳定剂I（IBS-001）（购自湖州英创生物科技有限公司），在37℃封闭1小时，洗板3次，将；将浓度度分别为0pg/mL，31.25pg/mL，62.5pg/mL，125pg/mL，250pg/mL，500pg/mL，1000pg/mL的标准品（RBX1重组蛋白）或样品加入到封闭板中，在37℃条件下反应1小时，洗板三次；然后使用浓度为0.5μg/mL的HRP标记的鼠RBX1多克隆抗体（购自Novus Biologicals，货号为H00009978-B01），37℃条件下反应1小时后洗板三次，用TMB显色2-3分钟，再用浓度为2M硫酸终止反应，最后检测在450nm处的OD值。
检测体系优化：
RBX1抗体：购买三株RBX1抗体，鼠RBX1多克隆抗体（购自Novus Biologicals，货号为H00009978-B01）；兔RBX1多克隆抗体（购自OriGene，货号为TA317744）；兔RBX1单克隆抗体（购自abcam，货号为ab133565），比对三种抗体对检测体系的影响。结果显示，RBX1抗体优选abcam提供的产品，其工作浓度为5μg/mL。
RBX1重组蛋白（SEQ ID NO.3）：购买3株RBX1重组蛋白，分别为Novus Biologicals公司提供、货号为H00009978-P01的RBX1重组蛋白；abcam公司提供、货号为ab157035的RBX1重组蛋白；OriGene公司提供、货号为TP300348的RBX1重组蛋白，比对3种重组蛋白对检测体系的影响。结果显示，Novus Biologicals公司提供的RBX1重组蛋白效果最佳，其最佳工作浓度为1.6ng/mL。
酶标多克隆抗体使用HRP标记Novus Biologicals的鼠多克隆抗体（HRP标记试剂盒购自湖州英创生物科技有限公司，标记方法按试剂盒说明书进行）。使用该酶标多克隆抗体的最佳工作浓度为0.5μg/mL。在此条件下，可实现背景OD值＜0.1，有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
固相载体的确定：对4种不同厂家的酶标板进行了比较，分别为美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc，结果表明，美国corning公司（货号为：9018）和thermo（货号为：468667）公司的酶标板符合背景OD值＜0.1，且信噪比较高。
包被液的选择：根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液（pH7.5）和碳酸盐缓冲液（pH9.6）检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液（pH9.6）可满足空白组OD值＜0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
稀释剂的选择：稀释剂作为试剂盒组分之一，主要用于稀释标准品、酶标抗体，并稳定反应体系，由于稀释对象具有生物活性，市面已有商品化稀释剂，同时可查询到多种稀释剂配方，本实施例通过实验对比了2种商品化稀释剂（分别购自天津博美科生物技术有限公司（货号BMKF017-1）和上海西唐生物科技有限公司（货号C0901））和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂效果更佳，自制稀释剂的终浓度如下：含浓度为3m的EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1×PBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞（pH6.0）。
稳定剂的选择：使用3种不同稳定剂（具体如下：稳定剂Ⅰ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl；稳定剂Ⅱ：质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂Ⅲ：体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞）分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL，使用时按体积比为1：100稀释。并于第0天、第7天和第14天进行检测。结果显示稳定剂Ⅲ效果最佳，具体组分为：体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
通过以上主要原材料的研究确定了检测体系的主要组分，建立了成熟的RBX1血清检测体系。
实施例2RBX1血清检测试剂盒
根据实施例1中建立RBX1血清检测体系构建RBX1血清检测试剂盒，具体组分如表1所示：
表1、RBX1血清检测试剂盒
评价RBX1血清检测试剂盒：利用RBX1血清检测试剂盒检测不同浓度的RBX1重组蛋白，确定其线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990；回收率在90%～110%范围内；用RBX1血清检测试剂盒分别检测浓度为160pg/mL和80pg/mL的样本，各重复检测10次，结果表明变异系数CV≤10%；用3个批号的RBX1血清检测试剂盒检测同一样本，结果显示3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15%。并对试剂盒稳定性进行了研究，在4℃条件下保存8个月，开封后在4℃条件下保存2个月，在0-4℃运输7天均能保持稳定，符合产品预期效果。
实施例3RBX1血清检测试剂盒用于肠癌诊断和预示、疗效评估、复发监控
（1）RBX1血清检测试剂盒诊断和预示肠癌
从江苏省肿瘤医院收集肠癌患者血清样本30例，血站收集健康献血人员血清50例；每例血清1mL。应用实施例2中的RBX1血清检测试剂盒，分别检测肠癌患者和健康人血清中RBX1浓度，结果如图1所示。然后通过通过ROC曲线统计（图2），结果显示，曲线下面积为0.747，95%CI=0.64-0.853，初步确定临床诊断Cut-off值为176.2736pg/mL，灵敏度为60%，特异性为80%。血清RBX1浓度明显高于176.2736pg/mL的判断为肠癌患者，明显低于176.2736pg/mL的判断为正常人，在该值附近的为疑似肠癌患者。
（2）RBX1血清检测试剂盒评估肠癌疗效
从上海肿瘤医院取10例肠癌患者治疗前血清，检测血清中RBX1浓度，疗程结束后再取患者血清，检测血清中RBX1浓度，然后根据公式计算治疗效果，具体公式为P=治疗后血清RBX1浓度值/治疗前RBX1浓度值，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著。10名肠癌患者的疗效评估结果如表2所示，同时对这10名患者进行临床评价，结果如表2所示。
表2.RBX1血清检测试剂盒评估肠癌疗效结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度比值 | 临床评价 |
| 01 | 1.252 | 无效 |
| 02 | 0.287 | 疗效显著 |
| 03 | 0.577 | 无效 |
| 04 | 0.637 | 改善 |
| 05 | 1.341 | 无效 |
| 06 | 1.668 | 无效 |
| 07 | 1.277 | 无效 |
| 08 | 0.506 | 疗效显著 |
| 09 | 0.711 | 改善 |
| 10 | 1.462 | 无效 |
由表2可知，RBX1血清检测试剂盒评估结果是10例肠癌患者中3例患者疗效显著，5例肠癌患者无治疗效果，其他2例治疗后病情得到改善，与临床判断结果对比符合率达90%。
（3）RBX1血清检测试剂盒监控肠癌复发
从上海肿瘤医院取6例早期肠癌患者化疗后血清，用RBX1血清检测试剂盒检测化疗后血清RBX1浓度。并对患者进行跟踪随访，于疗程结束后六周首次检测血清RBX1浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次，将检测的血清RBX1浓度与化疗后血清RBX1浓度相除，计算其P值，结果如表3所示。当P值大于1时表明发生了转移复发，当P值小于或等于1时表明未发生转移复发，为无进展生存。同时医师根据临床症状评价其转移复发情况，结果如表3所示。
表3.RBX1血清检测试剂盒监控肠癌复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 01 | 0.774 | 0.869 | 1.120 | 1.328 | 转移复发 |
| 02 | 1.148 | 1.219 | 1.235 | 1.369 | 无进展生存 |
| 03 | 1.083 | 1.085 | 1.113 | 1.416 | 无进展生存 |
| 04 | 1.012 | 1.242 | 1.244 | 1.290 | 无进展生存 |
| 05 | 0.884 | 1.001 | 1.152 | 1.232 | 转移复发 |
| 06 | 1.084 | 1.244 | 1.645 | 1.700 | 无进展生存 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒监控结果为6例肠癌患者中，疗程结束后6周有4例发生了转移复发，治疗后9个月6例患者均发生了转移复发，而临床评价只有2例出现了转移复发，因此使用试剂盒监控肠癌复发早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
实施例4RBX1血清检测试剂盒用于肝癌的诊断和预示、疗效评估、复发监控
（1）RBX1血清检测试剂盒诊断和预示肝癌
从江苏省肿瘤医院收集肝癌患者血清样本30例，血站收集健康献血人员血清50例；每例血清1mL。应用实施例2中的RBX1血清检测试剂盒，分别检测肝癌患者和正常人血清中RBX1，其结果如图3所示。然后利用ROC曲线统计，结果如图图4所示。ROC曲线统计结果为曲线下面积为839，95%CI=0.714-0.963，初步确定临床使用Cut-off值为140.5858pg/mL，灵敏度为80%，特异性为75%。RBX1血清浓度明显高于140.5858pg/mL的判断为肝癌患者，RBX1浓度明显低于140.5858pg/mL的判断为正常人，在该值附近的为疑似肝癌患者。
（2）RBX1血清检测试剂盒评估肝癌疗效
从上海肿瘤医院取10例肝癌患者治疗前血清，检测血清中RBX1浓度，疗程结束后再取患者血清，检测血清中RBX1浓度，然后根据公式计算治疗效果，具体公式为P=治疗后血清RBX1浓度值/治疗前RBX1浓度值，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著。10名肝癌患者的疗效评估结果如表4所示，同时对这10名患者进行临床评价，结果如表4所示。
表4.RBX1血清检测试剂盒评估肝癌疗效结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度比值 | 临床评价 |
| 01 | 1.487 | 无效 |
| 02 | 0.861 | 改善 |
| 03 | 1.278 | 无效 |
| 04 | 0.476 | 疗效显著 |
| 05 | 1.463 | 无效 |
| 06 | 1.723 | 无效 |
| 07 | 0.710 | 改善 |
| 08 | 1.018 | 改善 |
| 09 | 1.264 | 无效 |
| 10 | 1.548 | 无效 |
由表4可知，RBX1血清检测试剂盒评估结果是10例肝癌患者中1例患者疗效显著，7例肝癌患者无治疗效果，其余2例治疗后病情得到改善，与临床判断结果对比符合率达90%。（3）RBX1血清检测试剂盒用于肝癌复发监控
从上海肿瘤医院取6例早期肝癌患者化疗后血清，用RBX1血清检测试剂盒检测血清RBX1浓度，并对患者进行跟踪随访。疗程结束后六周首次检测血清RBX1浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次，将检测的血清RBX1浓度与化疗后血清RBX1浓度相除，计算其P值，结果如表5所示。当P值大于1时判断为发生了转移复发，当P值小于或等于1时判断为未发生转移复发，为无进展生存；同时临床评价其转移复发情况，结果如表5所示。
表5.RBX1血清检测试剂盒监控肝癌复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 01 | 1.147 | 1.171 | 1.172 | 1.218 | 无进展生存 |
| 02 | 0.582 | 0.993 | 1.09 | 1.222 | 转移复发 |
| 03 | 0.833 | 0.977 | 1.008 | 1.163 | 转移复发 |
| 04 | 1.184 | 1.368 | 1.397 | 1.52 | 无进展生存 |
| 05 | 0.933 | 0.954 | 1.085 | 1.332 | 转移复发 |
| 06 | 1.032 | 1.125 | 1.379 | 1.402 | 无进展生存 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒监控结果为6例肝癌患者中，治疗后6周有3例发生了转移复发，治疗后9个月6例患者均发生了转移复发，而临床评价结果只有3例发生了转移复发，因此试剂盒监控结果早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
实施例5RBX1血清检测试剂盒用于乳腺癌的诊断和预示、疗效评估、复发监控
（1）RBX1血清检测试剂盒诊断和预示乳腺癌
从江苏省肿瘤医院收集乳腺癌患者血清样本30例，血站收集健康献血人员血清50例；每例血清1mL。应用实施例2中的RBX1血清检测试剂盒分别检测乳腺癌患者和健康人血清中RBX1，结果如图5所示。然后利用ROC曲线统计，结果如图6所示。ROC曲线统计结果为曲线下面积为0.947，95%CI=0.89-1.004。初步确定临床使用Cut-off值为99.4305pg/mL，灵敏度为86.2%，特异性为90%。RBX1血清浓度明显高于99.4305pg/mL的判断为乳腺癌患者，RBX1血清浓度明显低于99.4305pg/mL的判断为正常人，在该值附近的为疑似乳腺癌患者。
（2）RBX1血清检测试剂盒评估乳腺癌疗效
从上海肿瘤医院取10例乳腺癌患者治疗前血清，检测血清中RBX1浓度，疗程结束后再取患者血清，检测血清中RBX1浓度，然后根据公式计算治疗效果，具体公式为P=治疗后血清RBX1浓度值/治疗前RBX1浓度值，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著。10名乳腺癌患者的疗效评估结果如表6所示，同时对这10名患者进行临床评价，结果如表6所示。
表6.RBX1血清检测试剂盒评估乳腺癌疗效结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度比值 | 临床评价 |
| 01 | 1.732 | 无效 |
| 02 | 0.689 | 改善 |
| 03 | 0.515 | 改善 |
| 04 | 1.281 | 无效 |
| 05 | 0.744 | 改善 |
| 06 | 1.297 | 无效 |
| 07 | 1.346 | 无效 |
| 08 | 1.628 | 无效 |
| 09 | 0.306 | 疗效显著 |
| 10 | 1.711 | 无效 |
由表6可知，RBX1血清检测试剂盒评估结果是10例乳腺癌患者中2例患者疗效显著，6例乳腺癌患者无治疗效果，其余1例患者治疗后病情得到改善，与临床判断结果对比符合率达90%。
（3）RBX1血清检测试剂盒监控乳腺癌复发
从上海肿瘤医院取6例早期乳腺癌患者化疗疗程结束后血清，然后检测血清RBX1浓度，并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次检测患者血清RBX1浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，检测四次，将检测的血清RBX1浓度与化疗后血清RBX1浓度相除，计算其P值，结果如表7所示。当P值大于1时判断为发生了转移复发，当P值小于或等于1时判断为未发生转移复发，为无进展生存；同时临床评价其转移复发情况，结果如表7所示。
表7.RBX1血清检测试剂盒监控乳腺癌复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 01 | 0.501 | 0.841 | 1.183 | 1.392 | 转移复发 |
| 02 | 1.118 | 1.056 | 1.034 | 1.139 | 无进展生存 |
| 03 | 1.300 | 1.193 | 1.281 | 1.043 | 无进展生存 |
| 04 | 1.155 | 1.191 | 1.254 | 1.202 | 无进展生存 |
| 05 | 1.096 | 1.178 | 0.974 | 1.098 | 无进展生存 |
| 06 | 0.564 | 0.781 | 0.933 | 1.249 | 转移复发 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒监控结果为6例乳腺癌患者在疗程结束后6周有4例患者出现了转移复发，治疗后9个月全部出现转移复发，而临床监控仅有2例发生了转移复发。因此，使用RBX1血清检测试剂盒监控早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供临床指导。
实施例6RBX1血清检测试剂盒用于胃癌诊断和预示、疗效评估、复发监控
（1）RBX1血清检测试剂盒诊断和预示胃癌
从江苏省肿瘤医院收集胃癌患者血清样本30例，血站收集健康献血人员血清50例；每例血清1mL。应用实施例2中的RBX1血清检测试剂盒，分别检测胃癌患者和正常人血清中RBX1浓度，结果如图7所示。然后利用ROC曲线统计，结果如图8所示。ROC曲线统计显示曲线下面积为0.62，95%CI=0.495-0.745。初步确定临床使用Cut-off值为213.6932pg/mL，灵敏度为65%，特异性为57.5%。RBX1血清浓度明显高于213.6932pg/mL的判断为胃癌患者，RBX1血清浓度明显低于RBX1血清浓度的判断为正常人，在该值附近的为疑似胃癌患者。
（2）RBX1血清检测试剂盒评估胃癌疗效
从上海肿瘤医院取10例胃癌患者治疗前血清，检测血清中RBX1浓度，疗程结束后再取胃癌患者血清，检测患者血清RBX1浓度，然后根据公式计算P值，具体公式为P=治疗后RBX1浓度值/治疗前RBX1浓度值，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著。RBX1血清检测试剂盒检测10名胃癌患者的疗效评估结果如表8所示，同时对这10名患者进行临床评价，结果如表8所示。
表8RBX1血清检测试剂盒用于胃癌的疗效预测结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度比值 | 临床评价 |
| 01 | 1.295 | 无效 |
| 02 | 1.646 | 无效 |
| 03 | 0.503 | 疗效显著 |
| 04 | 1.322 | 无效 |
| 05 | 1.441 | 无效 |
| 06 | 0.573 | 无效 |
| 07 | 0.748 | 改善 |
| 08 | 0.836 | 改善 |
| 09 | 1.116 | 无效 |
| 10 | 0.709 | 改善 |
由表8可知，RBX1血清检测试剂盒评估结果是10例胃癌患者中2例患者疗效显著，5例乳腺癌患者无治疗效果，其余3例患者治疗后病情得到改善，与临床判断结果对比符合率达90%。
（3）RBX1血清检测试剂盒监控胃癌复发
从上海肿瘤医院取6例早期胃癌患者血清化疗结束后再取患者血清，然后检测化疗前和化疗后血清中RBX1浓度，疗程结束后并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次检测血清RBX1浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，检测四次，将检测的血清RBX1浓度与化疗后血清RBX1浓度相除，计算其P值，结果如表9所示。当P值大于1时判断为发生了转移复发，当P值小于或等于1时判断为未发生转移复发，为无进展生存，同时临床评价6例患者的转移复发情况，结果如表9所示。
表9.RBX1血清检测试剂盒监控胃癌的复发结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 01 | 0.896 | 1.007 | 1.136 | 1.238 | 转移复发 |
| 02 | 0.869 | 0.94 | 0.992 | 1.306 | 转移复发 |
| 03 | 1.145 | 1.261 | 1.402 | 1.575 | 无进展生存 |
| 04 | 1.183 | 1.295 | 1.415 | 1.443 | 无进展生存 |
| 05 | 0.772 | 0.925 | 1.023 | 1.263 | 转移复发 |
| 06 | 0.882 | 1.289 | 1.399 | 1.424 | 转移复发 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒监控结果为6例胃癌患者在疗程结束后6周有2例患者出现了转移复发，治疗后9个月6例患者均出现转移复发，而临床监控显示只有4例出现了转移复发，因此使用试剂盒监控结果早于临床症状和体征发现，为医生提前进行干预提供指导。
实施例7RBX1试剂盒用于胰腺癌的诊断和预示、疗效评估、复发监控
（1）RBX1血清检测试剂盒诊断和预示胰腺癌
从江苏省肿瘤医院收集胰腺癌血清样本100例，血站收集健康献血人员血清145例；每例血清1mL。应用实施例2中的RBX1血清检测试剂盒分别检测胰腺癌患者和正常人血清中RBX1浓度，结果如图9所示。然后用ROC曲线统计结果（图10），结果显示曲线下面积为0.845，95%CI=0.809-0.882。初步确定临床使用Cut-off值为85.5068pg/mL，灵敏度为78%，特异性为74.7%。RBX1血清浓度明显高于85.5068pg/ml判断为胰腺癌患者，RBX1血清浓度明显低于85.5068pg/mL判断为正常人，在该值附近的为疑似胰腺癌患者。
（2）RBX1血清检测试剂盒用于胰腺癌疗效评估
从上海肿瘤医院取10例胰腺癌患者血清，治疗前检测血清中RBX1浓度，疗程结束后再取患者血清，检测血清中RBX1浓度，然后根据计算公式计算P值，具体公式为P=治疗后RBX1浓度值/治疗前RBX1浓度值，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著。10例患者的疗效评估结果如表10所示，同时对患者进行临床评价，结果如表10所示。
表10.RBX1血清检测试剂盒用于胰腺癌疗效评估结果
| 患者编号 | 治疗前后浓度比值 | 临床评价 |
| 01 | 0.798 | 改善 |
| 02 | 1.689 | 无效 |
| 03 | 0.643 | 改善 |
| 04 | 1.427 | 无效 |
| 05 | 0.889 | 改善 |
| 06 | 1.207 | 无效 |
| 07 | 1.183 | 改善 |
| 08 | 1.189 | 无效 |
| 09 | 0.437 | 无效 |
| 10 | 0.330 | 有效 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒检测结果为10例胰腺癌患者中，2例患者疗效显著，5例患者无治疗效果，其余3例患者无治疗效果，与临床判断结果对比符合率达90%。
（3）RBX1血清检测试剂盒用于胰腺癌复发监控
从上海肿瘤医院取6例早期胰腺癌患者化疗结束后血清，然后检测血清中RBX1浓度，疗程结束后并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次检测血清RBX1浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，检测四次，将检测的血清RBX1浓度与化疗后血清RBX1浓度相除，计算其P值，结果如表11所示。当P值大于1时判断为发生了转移复发，当P值小于或等于1时判断为未发生转移复发，为无进展生存。同时临床评价6例患者的转移复发情况，结果如表11所示。
表11.RBX1血清检测试剂盒用于胰腺癌复发监控结果
| 患者编号 | 6周 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 临床评价 |
| 01 | 0.905 | 0.960 | 0.984 | 1.257 | 转移复发 |
| 02 | 1.007 | 1.160 | 1.432 | 1.569 | 转移复发 |
| 03 | 1.079 | 1.086 | 1.087 | 1.114 | 无进展生存 |
| 04 | 1.207 | 1.367 | 1.638 | 1.663 | 无进展生存 |
| 05 | 0.869 | 0.971 | 0.973 | 1.269 | 转移复发 |
| 06 | 1.310 | 1.334 | 1.439 | 1.482 | 无进展生存 |
结果显示，RBX1血清检测试剂盒监控结果为6例胰腺癌患者在疗程结束后6周有4例患者出现了转移复发，治疗后9个月6例患者均出现转移复发，而临床监控显示只有3例出现了转移复发，因此使用试剂盒监控结果早于临床症状和体征发现，医生可提前进行干预。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.RBX1作为血清标志物的应用，所述RBX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血清标志物为诊断和预示肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌或胰腺癌的血清标志物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
4.RBX1血清检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有捕获血清RBX1的捕获剂，所述RBX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获剂为特异识别RBX1的抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获剂为兔RBX1单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获剂固定于固相载体上。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述固相载体为酶标板。
9.根据权利要求4-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有酶标多克隆抗体和显色底物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标多克隆抗体为HRP标记的鼠RBX1多克隆抗体，所述显色底物TMB。
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