CN103667203A - 棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用 - Google Patents

棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物营养生长相关的由序列1衍生的蛋白质；（c）将序列1所示经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉纤维长度相关的由序列1衍生的蛋白质；（d）将序列1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明对于培育高纤维品质和高产的棉花新品种具有巨大参考价值，对提高棉花的产量具有重要意义。

Description

棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用。
背景技术
丙酮酸激酶（PK，EC2.7.1.40）是一类保守的蛋白酶，催化糖酵解途径的关键步骤“磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转变，其催化的反应式为：PEP＋ADPPyruvate＋ATP”。由于丙酮酸激酶催化反应的产物丙酮酸可以进入线粒体参与三羧酸循环，因此丙酮酸激酶是联系糖酵解途径和三羧酸循环的关键限速酶。在动物中，丙酮酸激酶在不同组织中以不同类型存在，在快速增殖的细胞（如肿瘤细胞中）丙酮酸激酶为PKM2，而在肝脏和肾脏中为PKL，在肌肉和脑组织中则为PKM1。这些不同类型的丙酮酸激酶异构体具有不同的催化活性和调控活性，可能为不同组织发挥正常的生理功能所必须。在植物中，丙酮酸激酶则以细胞质和质体两种不同亚细胞定位的异构体形式存在。质体定位的丙酮酸激酶被发现与植物细胞的油脂合成相关，而细胞质定位的丙酮酸激酶的具体生理功能则颇具争议。
棉花纤维细胞是植物界最长的同时也是伸长最快的细胞之一。成熟的棉花纤维作为纺织工业的原材料具有重要的经济价值，提高棉花纤维的长度和品质对于棉花的增产和经济创收具有巨大的社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花细胞质丙酮酸激酶编码基因及其应用。
本发明提供的蛋白质，获自陆地棉栽培种中棉所35号（Gossypium hirsutumcultivar CRI35），命名为GhPK1蛋白，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物营养生长相关的由序列1衍生的蛋白质；
（c）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉纤维长度相关的由序列1衍生的蛋白质；
（d）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）或（c）或（d）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）或（c）或（d）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码GhPK1蛋白的基因（GhPK1基因）也属于本发明的保护范围。
所述GhPK1基因是如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）或（8）所述的DNA分子：
（1）编码区如序列表中序列2自5’末端第105-1625位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码植物营养生长相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码植物营养生长相关蛋白的DNA分子；
（5）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码棉纤维长度相关蛋白的DNA分子；
（6）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码棉纤维长度相关蛋白的DNA分子；
（7）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码丙酮酸激酶的DNA分子；
（8）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码丙酮酸激酶的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述GhPK1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为将所述GhPK1基因插入pET28a(+)载体或载体pBE2113的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，为将所述GhPK1基因导入目的植物，得到营养生长水平低于所述目的植物的转基因植物。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。所述营养生长水平低体现为根长短和/或叶片湿重轻和/或株高短。
本发明还保护一种培育转基因棉花的方法，为将抑制所述GhPK1基因表达的物质导入出发棉花植株，得到棉纤维长度高于所述出发棉花植株的转基因棉花植株。
所述“抑制所述GhPK1基因表达的物质”具体可为pTRV1质粒和重组质粒pTRV2-GhPK1。所述重组质粒pTRV2-GhPK1为在pTRV2质粒的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第105-554位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述出发棉花可为陆地棉，更具体可为陆地棉栽培种中棉所35号。
以上任一所述的方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述GhPK1蛋白作为丙酮酸激酶的应用或所述GhPK1蛋白在制备丙酮酸激酶中的应用。
本发明还保护所述GhPK1蛋白在调节植物的营养生长中的应用或所述GhPK1蛋白在调节棉花的棉纤维长度中的应用。
本发明发现了GhPK1蛋白及其编码基因。GhPK1蛋白在棉花纤维和种子中优势表达，而在营养组织中低表达。GhPK1蛋白具有典型的丙酮酸激酶活性。在拟南芥植株中过量表达GhPK1基因能够显著抑制植株的营养生长（在正常生长情况下，转基因植物的根和茎相比对照植株均较短，叶片湿重较轻）。在棉花植株中抑制GhPK1基因的表达则能显著提升成熟棉花纤维的长度。本发明对于培育高纤维品质和高产的棉花新品种具有巨大参考价值，对提高棉花的产量具有重要意义。
附图说明
图1为GhPK1蛋白和GhPK1基因在棉花不同组织中的表达情况。
图2为重组GhPK1蛋白的丙酮酸激酶活性的检测情况。
图3为过表达GhPK1基因的拟南芥植株的western blot和酶活检测结果。
图4为过表达GhPK1基因的拟南芥植株及对照植株的各营养组织生长情况照片和比较结果。
图5为沉默GhPK1基因的棉花植株的western blot和酶活检测结果。
图6为沉默GhPK1基因的棉花植株及对照植株的成熟棉花纤维长度测定照片和比较结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
陆地棉栽培种中棉所35号（Gossypium hirsutum cultivar CRI35）：中国农业科学院棉花研究所。载体pET-28a(+)：Novagen,69864-3。载体pBE2113（植物双元表达载体）：日本国立农业资源研究所（参考文献：Mitsuhara I,Ugaki M,Hirochika H,et al.Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genesin dicotyledonous and monocotyledonous plants.Plant and CellPhysiology,1996,37:49-59）。pTRV1质粒和pTRV2质粒：参考文献：Qu J,Ye J,GengYF,et al.Dissecting functions of KATANIN and WRINKLED1in cotton fiberdevelopment by virus-induced gene silencing.PlantPhysiology,2012,160:738-748。哥伦比亚生态型拟南芥（Col）：国际拟南芥信息资源中心（The Arabidopsis Information Resource，http://arabidopsis.org/）。大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物技术有限公司。农杆菌菌株GV3101：参考文献：Dong CJ,Liu JY.The Arabidopsis EAR-motif-containing protein RAP2.1functions as an active transcriptional repressor to keep stress responses undertight control.BMC Plant Biology,2010,10:47。
实施例1、丙酮酸激酶蛋白GhPK1的发现及其基因克隆与活性分析
一、棉纤维细胞总蛋白制备
将棉花种子（陆地棉栽培种中棉所35号）于4月下旬种植于试验田中。约三个月后，在棉花开花的盛花期间于开花当天(0DPA)挂牌，于5、10、15、20、25DPA时间点进行样品的采集。采集方法为用镊子将胚珠连同纤维（称为棉花纤维或棉纤维）从棉桃中取出，在液氮中速冻后，置于-80℃低温冰箱冻存。采用姚远等报道的棉花纤维蛋白提取方法提取蛋白，具体步骤如下：将纤维样品在液氮中研磨，研磨时加入10%(w/w)石英砂和10%(w/w)PVPP，前者作用为辅助研磨，后者作用为防止酚类物质氧化；将研磨好的纤维粉末小心转入含15mL冰冷丙酮的离心管中，充分振荡悬浮后4℃、12000g离心5分钟；弃上清，加入冷丙酮洗两次，冷冻干燥约30分钟使丙酮完全挥发；向上述冻干的纤维粗提物中加入5mL蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.65,2%SDS，30%蔗糖,2%β-巯基乙醇),振荡混匀使蛋白充分溶解后，加入等体积的Tris饱和酚(pH7.9)，充分振荡混匀5分钟后室温12000g离心10分钟；转移上层酚相至一干净的离心管中，加入5倍体积冰冷的0.1M的醋酸铵/甲醇溶液，置于-20℃沉淀过夜，4℃、12000g离心15分钟后，弃去上清，获得蛋白沉淀；将沉淀依次用0.1M醋酸铵-甲醇、80%丙酮、100%丙酮各洗三遍；用真空冷冻干燥仪将最终所获得的蛋白沉淀冷冻干燥至干粉；将冻干后的蛋白粉末溶解于等电聚焦水化缓冲液[7M尿素,2M硫脲,4%(w/v)CHAPS,2%(v/v)IPG缓冲液,40mM DTT]中，室温12000g离心20分钟，弃去不溶残渣，上清即为可用于双向电泳的棉花纤维蛋白样品。
二、双向电泳
在GE IPGphor IEF系统上进行一向等电聚焦，用等电聚焦水化缓冲液稀释蛋白样品至2500μg/ml，室温10000g离心10分钟后吸取1.2ml上样于pH3-10、24cm的IPG胶条，在20℃不带电水化12小时，然后按照下面的程序进行等电聚焦：200V40分钟，500V40分钟，1000V1小时，4000V2小时，8000V8小时直至总的VHT达到约73000即停止聚焦。取出胶条，用10mL分别含1%DTT和含2.5%IAA的平衡缓冲液[6M尿素，50mM Tris-HCl，pH8.8，30%(v/v)甘油，2%(w/v)SDS]依次平衡15分钟。在GE EttanTMDALTsix系统上进行二向SDS-PAGE，平衡好的胶条用mini-Q ddH2O洗净，小心置于预制好的12.5%浓度SDS-PAGE凝胶上进行电泳，电泳程序为：每根胶条2.5W预电泳30分钟，随后17W电泳至溴酚蓝前沿至胶底为止。用“Blue Silver”高灵敏考马斯亮蓝G250染色法进行染色：从胶板中取出凝胶，用固定液（40%甲醇，10%冰醋酸）固定1小时，然后用mini-Q ddH2O将凝胶润洗两次，每次15分钟，加入“Blue Silver”染色液[10%磷酸，10%(w/v)硫酸铵，20%甲醇,0.12%(w/v)CBB G-250]染色约24小时，最后用mini Q ddH2O进行脱色约12小时。使用UMAX2100XL扫描仪对凝胶进行扫描，获得分辨率为600dpi的5个时期的纤维蛋白双向电泳图谱。
三、质谱鉴定
使用Image Master5.0软件（GE Healthcare）对电泳图谱进行蛋白点分析，所选参数为：检出点区域边缘平滑度Smooth＝3；检出点与背景的对比度Saliency＝9；检出点最小面积Min Area＝300。在此基础上进一步对蛋白点进行手工校正以去除假阳性点。通过比较5个时期的每个蛋白点相对于总蛋白的面积比值（%Vol），统计分析得到共235个差异表达蛋白。用毛细管将差异表达蛋白点从凝胶上挖出后，用脱色液（25mM NH4HCO3，50%乙腈）对胶粒进行脱色，100%乙腈冲洗脱色后的胶粒两次，每次10分钟，真空干燥15分钟使乙腈完全挥发；使用胰蛋白酶（25mM NH4HCO3,10ng/mLTrypsin）37℃倒置酶解16小时后加入约5倍胶粒体积的萃取液（50%乙腈，0.25%TFA），室温萃取1小时后，将液体吸出与CHCA基质1：1混匀，吸取2μL至标准点样板样品圈，风干后于4800Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer(Applied Biosystems/MDS SCIEX)质谱仪进行质谱分析。质谱仪操作利用配套的工作站软件GPS ExploreTM Workstation进行。数据采集阶段预设参数为：正离子模式；一级质谱激光电压为4000V，记录范围为500-4000Da；自动选取信号最强的10个峰(已经剔除胰酶自切峰和基质峰)进行二级质谱确认，二级质谱激光电压为8000V；在获得每个蛋白点的质谱信息后，继续利用GPS ExplorerTM Workstation结合最新的NCBI棉花EST数据库进行检库搜索，235个差异表达蛋白均得到成功鉴定，其中两个蛋白均鉴定为细胞质丙酮酸激酶。
四、细胞质丙酮酸激酶cDNA全长序列的获得
使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取陆地棉栽培种中棉所35号棉花纤维的总RNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。
采用RACE PCR的方法获取全长基因序列，具体步骤如下：
1、根据细胞质丙酮酸激酶对应的EST序列设计接头引物RACE-AP、AP1和AP2以及巢式PCR引物PK1-R1/2和PK1-F1/2，如表2所示。
2、3’RACE使用接头引物RACE-AP进行拟转录，反应条件为：将1μg RNA与0.5μL引物，10μL DEPC处理的水混匀，于70℃预变性10分钟，冰上冷却5分钟；加入2μL10×RT buffer，1.5μL dNTP，4μL MgCl2，0.3μL RNA酶抑制剂，0.5μL逆转录酶，混匀，置于PCR仪中进行逆转录反应，反应条件为：30℃，10分钟；42℃，90分钟；99℃，10分钟；4℃，10分钟。5’RACE先使用基因特异性引物5-PK1-R1进行逆转录，反应条件同上，接下来加入2μL10×buffer，1μL dATP和1μL末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase,TdT)在cDNA5’末端加上PolyA序列。
表2RACE PCR引物
Figure BDA0000436245420000061
Figure BDA0000436245420000071
3、以上述逆转录产物为模板，使用AP1和3-PK1-F1、AP2和3-PK1-F2为引物进行巢式PCR扩增获取3’cDNA端序列，以加接头后的逆转录产物为模板，使用RACE-AP和5-PK1-R1、AP2和5-PK1-R2为引物进行巢式PCR扩增获取5’cDNA端序列。
4、电泳，切胶回收PCR产物，连接北京全式金生物技术有限公司的pEASY-BluntSimple载体，得到连接产物，转入大肠杆菌DH5α中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序。
将两个序列的测序结果进行拼接，获得开放阅读框。开放阅读框编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GhPK1蛋白（由506个氨基酸残基组成），为棉花中首次发现的丙酮酸激酶基因。将编码GhPK1蛋白的基因命名为GhPK1基因，其cDNA全长序列（包括5’和3’UTR区）如序列表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5’末端第105-1625位核苷酸。
五、细胞质丙酮酸激酶GhPK1在棉花各组织中的表达模式
从上述种植的棉花材料采集不同组织（纤维、种子、根、茎、叶、花）的样品，液氮速冻，按上述方法分别提取总RNA和总蛋白，采用RT-PCR和western blot的方法检测GhPK1基因和GhPK1蛋白在各组织中的表达情况。RT-PCR所采用的引物如表2所示，采用Actin基因作为内参基因。western blot采用的内参蛋白为HSP70蛋白，所用的抗体为anti-GhPK1（华大蛋白）和anti-HSP70（华大蛋白）。实验重复三次，得到相似的结果。
表2RT-PCR引物
名称 序列（从5’至3’）
PK1-q-F CTTCCAGGGGTCGTTGTTG
PK1-q-R ACCTCGTGCCACCATAAAT
Actin-q-F AACAACTGCGGAGCGAGAA
Actin-q-R GGGGCAAGTGCAGTGATTT
RT-PCR结果如图1A所示：在纤维伸长过程中GhPK1基因的表达量均较高，5、10、15、20、25DPA时间点GhPK1基因的表达量的比值为1：1.23：1.33：1.32：1.28；在种子中GhPK1基因的表达量同样一直维持高表达，5、10、15、20、25DPA时间点GhPK1基因的表达量的比值为1：1.59：1.29：1.46：1.34；在根、茎、叶、花等组织中GhPK1基因的表达量较低，分别仅有5DPA的纤维中GhPK1基因表达量的48%、39%、25%和45%。这一结果表明GhPK1基因是一个在棉花纤维和种子中优势表达的基因。
Western blot结果如图1B所示：GhPK1蛋白在纤维和种子中呈高丰度表达，在根、茎、叶、花等组织中GhPK1蛋白的表达量较低；在5、10、15、20、25DPA时间点GhPK1蛋白的丰度比值为1：1.73：5.93：9.25：12.22，这点与RT-PCR的结果不同，暗示GhPK1蛋白的表达存在翻译后水平的调控。
六、细胞质丙酮酸激酶GhPK1的酶活性分析
1、提取陆地棉栽培种中棉所35号的棉花纤维的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板，使用PK1-F（GGATCCATGGAAATCAATAACCACCAT）和PK1-R（GAGCTCTCACTTTGCAGTCAAGATCTT）组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切载体pET-28a（+），回收约5300bp的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a-GhPK1。根据测序结果，对重组质粒pET-28a-GhPK1进行结构描述如下：在载体pET-28a（+）的BamHI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第105-1625位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，形成融合基因，表达N端具有6×His标签的GhPK1蛋白（His-GhPK1重组蛋白）。
5、将步骤4得到的重组质粒pET-28a-GhPK1导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，得到重组菌。
6、His-GhPK1重组蛋白的制备和纯化
将步骤5得到的重组菌接种于含100μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600nm=0.6时加入IPTG并使其浓度为1mM，20℃、180rpm振荡培养12h（从加入IPTG开始计时）；取培养体系，10000rpm离心10min，收集细胞沉淀；将细胞沉淀用pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎（超声频率为250w；30个循环，每个循环工作3s停6s），然后10000rpm离心10min，收集上清液；将上清液亲和层析。
亲和层析的填充物为Ni-NTA树脂，购自上海生工生物工程公司（产品目录号BSP033），装柱量为1mL。洗脱过程中的各个缓冲液如下(pH均为7.6)：NTA-0：含20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水；NTA-20：含20mmol/LTris-HCl，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水；NTA-40：含20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水；NTA-60：20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水；NTA-80：20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10g/100ml甘油，其它为水。洗脱过程(每次加5mL，完全流出柱子后再加5mL)：（1）柱子用水平衡20mL；（2）用NTA-0平衡20mL，上样5mL上清液；（3）用NTA-0洗脱25mL（去杂蛋白），然后依次用NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80进行洗脱，收集NTA-40至NTA-80洗脱的过柱后溶液，即为His-GhPK1重组蛋白溶液，冷冻干燥后得到His-GhPK1重组蛋白。
7、使用GhPK1蛋白进行酶活测定。
（1）PEP的最适浓度
1mL反应液加入1μg His-GhPK1重组蛋白，加入ADP并使其浓度为0.5mM，加入PEP并使其为不同浓度，立即混匀，置入比色皿中，使用分光光度计记录3分钟内340nm光吸收值的变化。
1mL反应液（pH6.9）：溶剂为50mM HEPES-KOH缓冲液，含25mM KCl、10mM MgCl2、1mM DTT、5g/100mL PEG8000、150μM NADH和4个单位的lactate dehydrogenase。
结果见图2A。1μg His-GhPK1重组蛋白在PEP浓度为1mM时具有最高的酶活，随着PEP浓度的继续增加，其酶活反而有所下降，说明高浓度的底物能够抑制其酶活。
（2）ADP的最适浓度
1mL反应液加入1μg His-GhPK1重组蛋白，加入PEP并使其浓度为1mM，加入ADP并使其为不同浓度，立即混匀，置入比色皿中，使用分光光度计记录3分钟内340nm光吸收值的变化。
1mL反应液的配方同步骤（1）。
结果见图2B。1μg His-GhPK1重组蛋白在ADP浓度为0.5mM时具有最高的酶活，随着ADP浓度的继续增加，其酶活反而有所下降，说明高浓度的底物能够抑制其酶活。
（3）最适pH
1mL反应液加入1μg His-GhPK1重组蛋白，加入PEP并使其浓度为1mM，加入ADP并使其浓度为0.5mM，立即混匀，置入比色皿中，使用分光光度计记录3分钟内340nm光吸收值的变化。
1mL反应液（采用不同pH）：溶剂为50mM PBS缓冲液，含25mM KCl、10mM MgCl2、1mM DTT、5g/100mL PEG8000、150μM NADH和4个单位的lactate dehydrogenase。
结果见图2C。His-GhPK1重组蛋白的最适反应pH约为6.8，pH降低或升高均能导致其酶活的下降。
结果表明，GhPK1蛋白具有典型的丙酮酸激酶活性。
实施例2、过表达植物的获得及其生长特征分析
一、过表达植物的获得
1、提取陆地棉栽培种中棉所35号的棉花纤维的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板，使用PK1-F（GGATCCATGGAAATCAATAACCACCAT）和PK1-R（GAGCTCTCACTTTGCAGTCAAGATCTT）组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切载体pBE2113，回收约13500bp的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pBE2113-GhPK1。根据测序结果，对重组质粒pBE2113-GhPK1进行结构描述如下：在载体pBE2113的BamHI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第105-1625位核苷酸所示的双链DNA分子。
5、将步骤4得到的重组质粒pBE2113-GhPK1导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
6、用含5g/100mL蔗糖和0.02g/100mL Silwet L-77的液体1/2MS培养基悬浮步骤5得到的重组农杆菌，得到OD600nm约为1.0的菌液。
7、取在光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）中生长约1个月的哥伦比亚生态型拟南芥植株，剪去果荚和已开的花，然后将花盆倒置，使其花蕾浸泡在步骤6得到的菌液中约30秒；然后将花盆斜置于黑暗潮湿的环境下过夜；然后将花盆正置，继续在相同条件下培养，直至种子成熟，收取种子（T0代种子）。
8、取T0代种子，表面消毒后均匀铺于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后移至光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养约2周，用镊子小心将长出绿色真叶的阳性幼苗转移到花盆中，培养至种子成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗），分株收取种子（T1代种子）。
9、取T1代种子，表面消毒后均匀铺于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板，4℃春化2天，然后移至光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）培养约2周，用镊子小心将长出绿色真叶的阳性幼苗转移到花盆中，培养至种子成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗），分株收取种子（T2代种子）。
T0代种子长成的植株为T0代植株，其产生的种子为T1代种子；T1代种子长成的植株为T1代植株，其产生的种子为T2代种子。对于某一T0代植株来说，如果其T1代种子在步骤9抗性筛选中均显示为阳性植株，该T0代植株为纯合的过表达植株，该植株及其自交后代为1个纯合的过表达株系。
二、转空载体植物的获得
用载体pBE2113代替重组质粒pBE2113-GhPK1，依次进行步骤一的5至9，得到转空载体株系。
三、蛋白表达量鉴定与蛋白活性鉴定
1、分别将过表达株系（随机取三个株系，依次为12＃株系、13＃株系和17＃株系）的T2代植株、转空载体株系的T2代植株和哥伦比亚生态型拟南芥植株进行如下鉴定：从植株上取等湿重的叶片，提取总蛋白，采用anti-GhPK1进行western blot分析。结果见图3A，相比哥伦比亚生态型拟南芥，三个转基因株系中GhPK1蛋白的含量均有至少5倍的提高（哥伦比亚生态型拟南芥中具有GhPK1蛋白的同源蛋白，因此western blot可以检测到本底表达）。转空载体株系中GhPK1蛋白的含量与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。
2、分别将转基因株系（12＃株系、13＃株系和17＃株系）的T2代植株、转空载体株系的T2代植株和哥伦比亚生态型拟南芥植株进行如下鉴定：取植株，液氮研磨，得到粉末；1mL反应液加入10mg粉末，充分溶解后4℃、10000g离心10分钟后取上清液，测定其蛋白浓度后加入ADP并使其浓度为0.5mM同时加入PEP并使其浓度为1mM，立即混匀，置入比色皿中，使用分光光度计记录3分钟内340nm光吸收值的变化。NAD/NADH在340nm光吸收值的摩尔消光系数ε为6.22μM/min/cm2，所使用的比色皿孔径为1cm×1cm×1cm，1mL反应液加入其中后其光吸收面积正好为1cm2，反应液中NADH浓度为150μM，反应时间为3min,因此相应的酶活数值即为ΔA340/6.22*150*3，这一数值再除以蛋白浓度(mg/ml)即为每mg蛋白的酶活。
1mL反应液（pH6.9）：溶剂为50mM HEPES-KOH缓冲液，含25mM KCl、10mM MgCl2、1mM DTT、5g/100mL PEG8000、150μM NADH和4个单位的lactate dehydrogenase。
设置6次重复试验，每次重复试验中每一个株系取3株植株。
丙酮酸激酶活性见图3B（纵坐标中，分母“mg”指的是蛋白的量）。三个转基因株系的GhPK1蛋白酶活相比哥伦比亚生态型拟南芥分别增加了28%、81%和91%。转空载体株系中GhPK1蛋白酶活与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。
四、过表达植物的生长特征分析
分别将转基因株系（12＃株系、13＃株系和17＃株系）的T2代种子、转空载体株系的T2代种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子进行如下操作：
第一组：将种子平铺于1/2MS培养基平板，先4℃春化2天，然后将平板竖直摆放培养1周（22℃，16小时光照/8小时黑暗），拍照并记录幼苗根的生长情况（测量根长）；
第二组：将种子平铺于1/2MS培养基平板，先4℃春化2天，然后将平板水平摆放培养1周（22℃，16小时光照/8小时黑暗），然后用镊子小心将长出四片绿色真叶的幼苗转移到花盆中并继续培养1周（22℃，16小时光照/8小时黑暗），拍照并记录植株叶片的生长情况（测量叶湿重）；
第三组：将种子平铺于1/2MS培养基平板，先4℃春化2天，然后将平板水平摆放培养1周（22℃，16小时光照/8小时黑暗），然后用镊子小心将长出四片绿色真叶的幼苗转移到花盆中并继续培养4周（22℃，16小时光照/8小时黑暗），拍照并记录植株茎的生长情况（测量茎长，又称株高）；
设置6次重复试验，每次重复试验中每一个株系取3粒种子。
表型照片见图4A（自上至下，依次为第一组、第二组和第三组），与哥伦比亚生态型拟南芥相比，各个转基因株系的根、叶和茎的生长均受到显著抑制。定量统计结果见图4B，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，三个转基因株系的根长分别缩短了40%、42%和47%（即第一组的结果），转基因株系的叶片湿重分别减轻了24%、33%和45%（即第二组的结果），转基因株系的株高分别缩短了22%、34%和53%（即第三组的结果）。转空载体株系的根长、叶片湿重和株高均与哥伦比亚生态型拟南芥没有显著差异。上述结果表明，过表达GhPK1基因能够获得营养生长受到抑制的拟南芥植株。
实施例3、培育GhPK1基因沉默的棉花植株并进行纤维长度分析
一、GhPK1基因沉默的棉花植株的获得和鉴定
1、以实施例1制备的重组质粒pET-28a-GhPK1为模板，采用PK1-VIGS-F和PK1-VIGS-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PK1-VIGS-F：GAATTCATGGAAATCAATAACCACCA。
PK1-VIGS-R：GGATCCAGATAAGACTGTAAAAGAGA。
2、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切pTRV2质粒，回收约9640bp的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pTRV2-GhPK1。根据测序结果，对重组质粒pTRV2-GhPK1进行结构描述如下：在pTRV2质粒的EcoRI和BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第105-554位核苷酸所示的双链DNA分子。
5、将步骤4得到的重组质粒pTRV2-GhPK1导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌，用重悬缓冲液（溶剂为水，含10mM MgCl2、10mM MES和100μM乙酰丁香酮）悬浮重组农杆菌，得到OD600nm约为1.0的菌液。
6、将pTRV1质粒导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌，用重悬缓冲液悬浮重组农杆菌，得到OD600nm约为1.0的菌液。
7、将步骤5得到菌液和步骤6得到的菌液混合并室温静置3小时，然后用显微注射器注射入陆地棉栽培种中棉所35号棉花植株（棉花植株在22℃，16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，进行注射的时间为发芽后第10天）的第一片真叶和第二片真叶中，每片真叶注射1mL，然后继续培养至棉铃成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗）。
8、将pTRV2质粒导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌，用重悬缓冲液悬浮重组农杆菌，得到OD600nm约为1.0的菌液。
9、将步骤6得到菌液和步骤8得到的菌液混合并室温静置3小时，然后用显微注射器注射入的棉花植株（棉花植株在22℃，16小时光照/8小时黑暗的条件下培养，进行注射的时间为发芽后第10天）的第一片真叶和第二片真叶中，每片真叶注射1mL，然后继续培养至棉铃成熟（22℃，16小时光照/8小时黑暗）。
步骤7和步骤9中，取完成注射2周后的植株叶片（与第二片真叶相隔2片叶片），提取总蛋白并采用anti-GhPK1进行western blot，同时参照实施例2的方法检测丙酮酸激酶的活性。
western blot结果见图5A。相比陆地棉栽培种中棉所35号的叶片（泳道1）和步骤9的植株的叶片（泳道2），步骤7的植株的叶片（泳道3）中GhPK1蛋白的表达完全得到了沉默。
丙酮酸激酶的活性的检测结果见图5B，1代表陆地棉栽培种中棉所35号的叶片，2代表步骤9的植株的叶片，3代表步骤7的植株的叶片。陆地棉栽培种中棉所35号的叶片和步骤9的植株的叶片的丙酮酸激酶的活性没有显著差异。与陆地棉栽培种中棉所35号的叶片相比，步骤7的植株的叶片的丙酮酸激酶的活性降低了24%。
结果表明，成功获得了GhPK1基因沉默的棉花植株。
二、GhPK1基因沉默的棉花植株的棉纤维长度检测
收取步骤一得到的棉铃，用镊子取出单个棉花种子，用小梳子将种子表面的纤维分别梳至种子两端，对纤维长度进行拍照记录（照片见图6A）。通过和标尺进行比较，分析算出不同植株棉纤维长度数值，见图6B（1代表陆地棉栽培种中棉所35号得到棉铃，2代表步骤9的植株得到的棉铃，3代表步骤7得到的棉铃）。
如图6所示，GhPK1基因沉默的棉花（步骤一的7得到）的棉纤维长度相比空白对照棉花（陆地棉栽培种中棉所35号）有所增加（增加了约8%），而空载对照棉花（步骤一的9得到）与空白对照棉花的棉纤维长度没有显著差异。结果表明，GhPK1基因沉默的棉花植株能够生产纤维长度增加的棉纤维。
Figure IDA0000436245500000011
Figure IDA0000436245500000021
Figure IDA0000436245500000031
Figure IDA0000436245500000041

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物营养生长相关的由序列1衍生的蛋白质；
（c）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与棉纤维长度相关的由序列1衍生的蛋白质；
（d）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）或（8）所述的DNA分子：
（1）编码区如序列表中序列2自5’末端第105-1625位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码植物营养生长相关蛋白的DNA分子；
（4）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码植物营养生长相关蛋白的DNA分子；
（5）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码棉纤维长度相关蛋白的DNA分子；
（6）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码棉纤维长度相关蛋白的DNA分子；
（7）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA分子杂交且编码丙酮酸激酶的DNA分子；
（8）与（1）或（2）限定的DNA分子至少具有90%同源性且编码丙酮酸激酶的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求2或3所述基因导入目的植物，得到营养生长水平低于所述目的植物的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
7.一种培育转基因棉花的方法，为将抑制权利要求2或3所述基因表达的物质导入出发棉花植株，得到棉纤维长度高于所述出发棉花植株的转基因棉花植株。
8.权利要求5至7中任一所述的方法在植物育种中的应用。
9.权利要求1所述蛋白质作为丙酮酸激酶的应用或权利要求1所述蛋白质在制备丙酮酸激酶中的应用。
10.权利要求1所述蛋白质在调节植物的营养生长中的应用或权利要求1所述蛋白质在调节棉花的棉纤维长度中的应用。
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