CN103664639A - 胺类化合物及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胺类化合物及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用。胺类化合物，其结构如式（Ⅰ）所示。本发明首次鉴定出两个新骨架M2离子通道抑制剂，其结构完全不同于以往的金刚烷胺和金刚乙胺，可能通过新的作用机理抑制和阻断流感病毒，克服金刚烷胺和金刚乙胺的缺陷，如对B型流感病毒无效、明显副作用以及交叉耐药等，从而为临床抗流感提供更多的药物选择。

Description

胺类化合物及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域：

本发明属于医药生物领域，具体涉及胺类化合物及其制备方法和在制备抗流感病毒药物中的应用。

背景技术：

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病率高，容易引起暴发流行或大流行。据世界卫生组织公布的数据显示，全球每年流感会导致6-12亿人口感染，300-500万患者因此发生肺炎、心肌炎、呼吸衰竭等并发症，25-50万患者甚至因而丧命，尤其在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。

目前，注射流感疫苗仍然是预防流感的最主要方式。然而，由于流感病毒具有广泛的宿主和多个分段的基因组，在其感染和复制过程中容易发生基因突变或基因重组而产生变种，因此，我们很难获得对流感具有稳定、持久的免疫能力。流感疫苗现阶段对流感的预防效率仅达60%-70%，对老年人或伴发基础疾病者保护力仅为40%。临床上，仍然以药物治疗为主，尤其是在流感爆发期间。

流感药物治疗的主要手段是M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂（Beigel J,Bray M.Antiviral Res.2008,78(1):91-102.）。神经氨酸酶抑制剂类药物主要有扎那米韦（Zanamivir）和奥司他韦（Oseltamivir）两类。该类药物能够竞争性地与流感病毒神经氨酸酶的活性位点结合，从而干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，进而减少流感病毒的复制。然而，该类药物具有中枢神经系统等副作用的困扰，并且，该类药物的耐药株已经被分离出来。

M2离子通道抑制剂包括金刚烷胺（Amantadine）和金刚乙胺（rimantadine）。M2离子通道抑制剂类药物以流感病毒基质蛋白M2为作用靶点，通过阻断质子通道来抑制流感病毒的复制（Pinto LH,Lamb RA.J Biol Chem.2006,281(14):8997-9000.），抑制病毒的脱壳和核酸释放，从而起到抑制病毒复制和繁殖的作用，进而达到抗流感病毒的目的。目前市面上仅有的两个药物都是金刚烷胺衍生物，其中，金刚烷胺在1966年被FDA批准上市（束梅英,等.中国医药情报.2000,6,6:39-40.）,用于治疗A型流感病毒性感染。金刚乙胺由Roche公司研发，1987年被批准上市，其药效比金刚烷胺强4-6倍。这两个药物的主要优点是价格低廉，口服生物利用度高，可以明显减轻A型流感的症状，且金刚乙胺在儿童中的耐受性较好。但是该类药物存在明显的缺陷（Schnell JR,Chou JJ.Nature.2008,451(7178):591-595.）：（1）对B型流感病毒无效；（2）存在明显副作用，引起明显的胃肠道不良反应；产生中枢神经毒副作用，主要表现为失眠、注意力分散和神经质；（3）约有三分之一的患者产生了耐药现象；两种药物结构单一，已经存在两种药物交叉耐药的情况。这两个单一骨架的化合物在临床已经使用了几十年，并没有任何新型结构的药物出现，绝大多数正在研发的药物仍以金刚烷为骨架，因此，面对具有高突变率的流感病毒，和现有药物的毒副作用的困扰，开发新型结构、高效低毒的抗流感药物显得十分地紧迫和重要。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种新的具有抗流感病毒作用的胺类化合物。

本发明的胺类化合物，其结构如式（Ⅰ）所示：

本发明的第二个目的是提供如式（Ⅰ）所示的胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

其合成路线为：

具体步骤是：将盐酸羟胺溶于吡啶中，然后再加入葑酮进行反应，得到式（Ⅱ）所示的中间产物，将式（Ⅱ）所示的中间产物溶于四氢呋喃中，然后再将该混合物与氢化锂铝混合，反应完全后，得到式（Ⅰ）所示的胺类化合物。

本发明的第三个目的是提供如式（Ⅰ）和式（Ⅲ）所示的化合物在制备抗流感病毒药物中的应用，

本发明的第四个目的是提供一种抗流感病毒药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的如式（Ⅰ）或式（Ⅲ）所示的化合物，和药学上可以接受的载体，

本发明首次鉴定出两个新骨架M2离子通道抑制剂，其结构完全不同于以往的金刚烷胺和金刚乙胺，可能通过新的作用机理抑制和阻断流感病毒，克服金刚烷胺和金刚乙胺的缺陷，如对B型流感病毒无效、明显副作用以及交叉耐药等，从而为临床抗流感提供更多的药物选择。

附图说明：

图1是用病毒抑制实验检测化合物1和化合物2对病毒的抑制作用。

图2是化合物1和化合物2在100μmol/L的浓度下对M2离子通道电流的抑制作用。A、B和C的左边是加药前的M2离子通道电流，右边是孵育两分钟100μmol/L金刚烷胺、化合物1和化合物2后记录的M2离子通道电流。矩形框表示用pH5.0的外液诱导M2离子通道电流。Aman、Com1和Com2分别代表金刚烷胺、化合物1和化合物2。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：化合物1和2的通用合成步骤：

化合物1：

A合成路线：此化合物为已知化合物暨商品化合物，可在相关试剂公司购买，故毋需合成路线。购买网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/179604?lang=zh&region=CN。CAS#：7242-92-4。

B化学表征：毋需。

化合物2：

A合成路线：

B原料及缩写解释

C化学表征

1、中间产物

加入盐酸羟胺（5g,65.7mmol），吡啶20ml于100ml茄形瓶中，油浴80℃中搅拌5min至盐酸羟胺完全溶解且澄清。加入葑酮（2g,13.14mmol），加热回流，搅拌过夜。过夜后，停止反应，在冰浴中将反应液直接倒入水中，有大量白色不溶物析出，充分搅拌后过滤，得到中间产物为白色粉末状固体1.8g，产率90%，经结构鉴定其结构式如式（Ⅱ）所示。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),δ1.21(s,6H),δ1.27(s,3H),δ1.35-1.77(m,7H),δ2.6(s,1H)，¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆),δ22.2,23.6,26.1,34.9,44.2,45.1,45.5,164.6.，MS:calculated for C₁₀H₁₇NO(M+H+):167.25,found:168.1。

2、目标产物

加入中间产物1.8g于100ml茄形瓶中，并溶解于THF。在另一个茄形瓶中放入搅拌子，加入LiAlH4（1g，17.93mmol）并在冰浴下滴加THF至成悬浊液。将溶解完之后的中间产物缓缓滴加至悬浊液中，滴加完毕后，70℃油浴回流搅拌。反应完全后，将湿润的Na2SO4加入直至无气泡产生，过滤并用硅胶柱层析纯化，用HCL\CH3OH成盐后得到白色粉末状固体500mg，产率27.8%，该白色粉末经结构鉴定，其结构式如式（Ⅰ）所示（化合物2）。¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆),δ1.02(s,6H),δ1.09(s,3H),δ1.35-1.77(m,7H),δ2.56(s,1H)，5.17（d,2H），¹³CNMR(125MHz,DMSO-d₆),δ15.2,26.4,27.1,35.3,43.4,44.7,47.2,71.8.，MS:calculated for C₁₀H₁₉N(M+H+):153.26,found:154.1。

实施例2：流感病毒抑制实验

实验材料：MDCK狗肾细胞；H1N1型流感病毒A/PR/8/34（M2野生型）；培养液DMEM+10%FBS，维持液DMEM+2%FBS（DMEM，Hyclone;FBS,Gibco）；Hanks缓冲液；CCK-8（Donjindo,Japan）；金刚烷胺（Sigma Aldrich）。

实验方法

1、病毒毒力测定（病毒毒力TCID50为10^-5.5）

将MDCK细胞以5×10⁴/孔接种于96孔板，形成细胞单层铺满状态，加入100μl10倍系列稀释的6个浓度的病毒液（病毒原液来源于鸡胚增值，DMEM稀释）吸附1-2小时后，倾出病毒，Hanks液漂洗两次，加入维持液培养后每天用倒置显微镜观察细胞病变（CPE）、血凝效价测定和用MTT细胞实验观察细胞存活状态以及病毒扩增情况，用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量（TCID50），每浓度设8个复孔，重复三次实验确定毒力（病毒毒力TCID50为10^-5.5）。

2、抗病毒实验

待测化合物以100mmol/L溶于DMSO，分装，-20℃保存。临用前解冻，用DMEM稀释，从2mmol/L的最高浓度开始，3倍比稀释至1μmol/L。

将MDCK细胞以5×10⁴/孔接种于96孔板，形成细胞单层铺满状态。去掉培养基后Hanks缓冲液漂洗两次。各取50μl/孔稀释好的待测化合物加入细胞中，每个浓度8个复孔，孵育1h。保存病毒按100倍TCID50稀释于DMEM培养基中。每个浓度8个复孔中，四个孔加入50μl/孔病毒，另外四个孔加50μl/孔培养基作为化合物毒性试验孔。72h后加入CCK-8试剂5μl/孔（详细操作见说明书），3h后测OD450。数据用Sigmaplot软件分析，计算待测化合物抑制病毒的IC50值。

结果：化合物1的IC50值为13.94μmol/L，化合物2的IC50值为9.44μmol/L，金刚烷胺（Amantadine）的IC50值为11.89μmol/L（图1）。

实施例3：检测化合物对H1N1-M2离子通道的活性抑制

1.构建稳定表达野生型H1N1-M2离子通道的HEK293T-rex细胞系（Sun J,Li C,Xu W,Li Z,Liu J,Chen L.Chin J Biotech.2008,24(11):1902-1906.）。

2.膜片钳技术检测化合物对H1N1-M2离子通道阻断作用

表达H1N1-M2离子通道的HEK293T-rex细胞经过1μg/ml四环素诱导24-48h后，在室温下使用膜片钳记录加药前后的电流变化情况（Hu W,Zeng S,Li C,Jie Y,Li Z,Chen L.JMed Chem.2010,53(9):3831-3834.）。

结果：100μmol/L化合物1对H1N1-M2离子通道电流阻断76.8%，100μmol/L化合物2对电流阻断70.7%，而100μmol/L金刚烷胺（Amantadine）可以完全阻断电流（图2），由此可见化合物1和化合物2具有M2离子通道抑制活性。

Claims (4)

1.胺类化合物，其结构如式（Ⅰ）所示：

2.一种权利要求1所述的如式（Ⅰ）所示的胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

其合成路线为：

具体步骤是：将盐酸羟胺溶于吡啶中，然后再加入葑酮进行反应，得到式（Ⅱ）所示的中间产物，将式（Ⅱ）所示的中间产物溶于四氢呋喃中，然后再将该混合物与氢化锂铝混合，反应完全后，得到式（Ⅰ）所示的胺类化合物。

3.如式（Ⅰ）或式（Ⅲ）所示的化合物在制备抗流感病毒药物中的应用，

4.一种抗流感病毒药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的如式（Ⅰ）或式（Ⅲ）所示的化合物，和药学上可以接受的载体，

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