CN103649330A - 检测癌症疗法耐药性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其以5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列和紧接的SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。这种BIM多态性变体可以用缺少SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列表征。它可以用来在包含这种多态性的个体中检测慢性髓性白血病的BCR-ABL非依赖性TKI耐药(酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性)、胃肠道间质肿瘤(GIST)的c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药、非小细胞肺癌(NSCLC)的EGFR非依赖性TKI耐药或骨髓增生病的JAK2非依赖性TKI耐药。

Description

检测癌症疗法耐药性的方法

技术领域

本发明涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。

背景技术

慢性髓性白血病(CML)是造血干细胞癌症，并且因称作BCR-ABL的致癌融合基因的存在而引起，所述致癌融合基因存在于全部CML患者中。

BCR-ABL编码组成型活性酪氨酸激酶，所述酪氨酸激酶介导与其正常对应物相比时增加的CML细胞存活和增殖。CML的有效治疗以一类抑制BCR-ABL激酶活性的药物形式存在，它们常被称作酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。

然而，小比例的患者将显示针对TKI的原发耐药性并且无反应，而其他患者将具有初始反应，但是随时间推移，形成对这些药物的继发耐药性（一个经常与转变成原始细胞危象(BC)CML相关的事件）和存活较短。在约60%存在TKI耐药的患者中(参考文献A1)，发现BCR-ABL激酶活性通过BCR-ABL基因中致使TKI与BCR-ABL结合能力降低的突变或通过‘野生型’BCR-ABL基因或蛋白的扩增和过量表达而再激活。

在剩余40%的患者中，TKI耐药的原因未知。发现在BCR-AB再激活不存在情况下介导TKI耐药的机制(也称作BCR-ABL非依赖性TKI耐药)对于确定克服TKI耐药的策略和更好的管理CML患者至关重要。

因此，采用BCR-ABL抑制剂的疗法已经在大多数慢性期慢性髓性白血病(CML)患中取得很高的病情控制率。然而，仍有很大比例的患者不能获得最佳反应¹并且几乎全部患有晚期疾病的患者死于其疾病²。

利用临床推动的风险评分评估患者的临床结果的尝试取得的成功有限^3,4，这部分归因于这类评分不考虑促成临床结果的疾病的分子特征或患者特异性遗传因素。实际上，对预测慢性期CML的反应的宿主遗传因素几乎一无所知^5-7。

因此，当前在临床上推荐用相同初始剂量的伊马替尼治疗全部患者，以常规时间间距监测基准临床反应。这些包括外周血计数的标准化和三个月至六个月的间隔下细胞遗传学和分子反应的程度⁵。仅未能达到基准时才改变疗法。作为决策方向，选项包括增加伊马替尼剂量、转向更强力的酪氨酸激酶抑制剂，以及准备好大剂量化疗和移植。

理想地，将可能根据白血病和患者两者来调整疗法，从而实现最快的反应并避免出现耐药性或病情发展。出于这些原因，需要用于预测反应和指导治疗的可靠标记。最近的工作依赖基于阵列的表达概况分析，以深入了解与ML中耐药性和病情发展相关的遗传因素⁸。然而，这类方法受限于它们的内在偏差以及不能确定促成这些表达谱的基础性遗传事件。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供一种预测可能患有或患有癌症或骨髓增生病的个体是否可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性的方法。

该方法可以包括确定该个体是否具有BIM(BCL2L11)基因的多态性变体。所述多态性变体或多态性可以按5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所述的核苷酸序列和紧接的SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列。BIM(BCL2L11)基因的多态性变体可以缺少SEQ ID NO:6中所述的核苷酸序列。

该方法可以包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物的存在，所述扩增产物作为该个体具有这种BIM(BCL2L11)基因多态性变体的指示物。可选地或额外地，该方法可以包括检测包含SEQ ID NO:2中所述序列的核酸扩增产物的存在，所述扩增产物作为该个体缺少这种BIM(BCL2L11)基因多态性变体的指示物。

该方法可以包括核酸扩增。该方法可以利用如SEQ ID NO:3中所述的核苷酸序列。它可以利用SEQ ID NO:4中所述的核苷酸序列。它可以利用这类序列的组合。可以作为引物集合而包含在该组合中。

该方法可以是这样的，当确定该个体具有BIM(BCL2L11)基因的多态性变体时，所述个体可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性。可选地或额外地，该方法可以是这样的，当确定该个体不具有BIM(BCL2L11)基因的多态性变体时，所述个体较不可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性。

根据本发明的第二方面，提供一种为患有癌症或骨髓增生病的个体选择疗法的方法。该方法可以包括通过上述方法确定患者是否可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性。该方法可以是这样的，从而在确定该个体可能形成这类耐药性的情况下，选择疗法。

该疗法可以包括更频繁地监测患者。该疗法可以包括更频繁的血液检查。该疗法可以包括更频繁的骨髓检查。该疗法可以包括骨髓移植。该疗法可以包括施用更有力的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。所述酪氨酸激酶抑制剂可以包括尼洛替尼或达沙替尼，或这两者。该疗法可以包括施用BH3-模拟物。所述BH3-模拟物可以包括ABT-263。所述BH3-模拟物可以与TKI组合施用。该疗法可以包括增加酪氨酸激酶抑制剂的剂量。所述酪氨酸激酶抑制剂可以包括伊马替尼。所述剂量可以增加超过400mg/日的标准剂量至600mg/日或800mg/日。所述疗法可以包括用抑制BCL2组蛋白质的促存活作用的药物治疗。

根据本发明的第三方面，提供一种确定特定疗法在患有癌症或骨髓增生病的个体上取得成功的可能性的方法。这种方法可以包括将所述疗法与由上述方法确定的疗法比较。

癌症或骨髓增生病可以包括慢性髓性白血病(CML)。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括BCR-ABL非依赖性TKI耐药性。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括酪氨酸激酶抑制剂耐药性。这种酪氨酸激酶抑制剂可以包括伊马替尼。

癌症或骨髓增生病可以包括胃肠道间质肿瘤(GIST)。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括伊马替尼耐药性。

癌症或骨髓增生病可以包括非小细胞肺癌(NSCLC)。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括EGFR非依赖性TKI耐药。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括针对厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、尼洛替尼和索拉非尼中任一种或多种或其组合的耐药性。

癌症或骨髓增生病可以包括如选自真性红细胞增多症(polycythaemiavera)、原发性血小板增多症(essential thrombocythaemia)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis)的骨髓增生病。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括JAK2非依赖性TKI耐药。酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性可以包括JAK抑制剂耐药性。

癌症或骨髓增生病可以选自：血液学恶性病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、实体瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤和神经母细胞瘤。

根据本发明的第四方面，提供一种BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其以5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所述的核苷酸序列和紧接的SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列。

根据本发明的第五方面，提供BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其特征在于缺少SEQ ID NO:6中所述的核苷酸序列。

在第六方面，本发明提供SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所述的核苷酸序列。这种核苷酸序列可以从上述的BIM多态性变体获得。它可以是通过核酸扩增可获得。

BIM(BCL2L11)基因的多态性变体或上述核苷酸序列可以与BCR-ABL再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓性白血病的耐药性(BCR-ABL非依赖性TKI耐药)相关。它们可能与c-KIT/PDGFR再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂治疗胃肠道间质肿瘤(GIST)的耐药性(c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药)相关。它们可能与EGFR再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的耐药性(EGFR非依赖性TKI耐药)相关。它们可能与JAK2再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂治疗骨髓增生病的耐药性(JAK2非依赖性TKI耐药)相关。

在本发明的第七方面，提供SEQ ID NO:3中所述的核苷酸序列。我们还提供SEQ ID NO:4中所述的核苷酸序列。我们也提供所述核苷酸序列的组合。这种组合可以作为引物集合提供。

根据本发明的第八方面，提供一种检测上述BIM(BCL2L11)多态性在个体中存在或不存在的方法。该方法可以包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物。该方法可以包括检测SEQ ID NO:2中所述的序列。这种检测可以利用上述的引物集合。

根据本发明的第九方面，提供一种治疗患有癌症或骨髓增生病的患者的方法。该方法可以包括确定所述癌症或骨髓增生病是否为BCR-ABL非依赖性TKI耐药性CML癌症。该方法可以包括确定所述癌症或骨髓增生病是否为c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药性GIST癌症。该方法可以包括确定所述癌症或骨髓增生病是否为EGFR非依赖性TKI耐药性NSCLC癌症。该方法可以包括确定所述癌症或骨髓增生病是否为JAK2非依赖性TKI耐药性骨髓增生病。该方法可以如上述。该方法还可以包括通过执行选自本发明第二方面所述的(a)至(g)的步骤治疗患者。

这种方法可以包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物。这可以通过使用如上文所述的引物集合进行。

除非另外说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。此类技术在文献中有解释。见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人,(1995和定期增补；CurrentProtocols in Molecular Biology,第9,13和16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNA Isolation和Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNAStructure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods inEnzymology,Academic Press；Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I by Edward Harlow,David Lane,Ed Harlow(1999,ColdSpring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow(编者),David Lane(编者)编著(1988,Cold SpringHarbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of DrugScreening,Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes编著(2001,NewYork,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref:A Handbook ofRecipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,JaneRoskams和Linda Rodgers编著,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3。这些通用教材的每一部通过引用的方式并入本文。

附图说明

图1显示UCSC基因(上部)和RefSeq基因(GeneBank，下部)的人类基因组(hg18)chr2:111,593,210-111,644,581的UCSC基因组浏览器视图。将BIM基因和表征多态性的缺失标出。

图2显示六个CML基因组的DNA-PET分析。

图2A汇总用于DNA-PET分析的患者样品和CML细胞系的门诊-病理特征。

图2B显示六个CML基因组的核基因组图，所述图是使用Circos由DNA-PET数据生成的²⁹并且绘制为环形图。滤除与32个正常基因组至少之一中所鉴定的那些SV匹配的SV(这些SV对应于表E4中的那些)。将不同类别的结构性变异(SV)以同心层方式如图注中所示那样排布。星号(*)表示存在BCR-ABL1/ABL1-BCR易位。

图3显示与急变(blast)转化相关的体细胞结构性变异。

图3A显示在P098中EVI1基因座内的新型重排的基因组浏览器视图。已知位于这个基因座内的基因[加利福尼亚州立大学圣克鲁兹分(UCSC)](Rhead等人,2010)以红色和蓝色显示(顶部)。红色迹线反映一致PET的片段覆盖范围(coverage)。暗红色和粉红色水平箭头代表表示存在插入的不一致PET的定位区域(锚定区)。

图3B显示如通过定量实时PCR测量的EVI1的表达水平。显示2份急变期样品(P022和P098)和4份慢性期样品(P308、P355、P490和P500)的EVI1水平，其针对β-肌动蛋白的表达归一化。

图3C显示使用如图3A中所示的针对染色体3(RP11-137H17，绿色)和染色体8(RP11-828L6，红色；RP11-159N7，黄色)的定制探针时EVI1重排的荧光原位杂交分析结果。EVI1重排不存在于正常对照中，但是可以在P098样品中作为红-绿-黄色融合信号见到。

图4显示在BIM的内含子2中的多态性2903bp缺失均存在于全部三份耐药样品中。

图4A显示通过DNA-PET在来自存在酪氨酸激酶抑制剂耐药的患者的全部三份样品(P308、P022和P098)均检测到BIM缺失，但是在来自酪氨酸激酶抑制剂敏感的患者或细胞系的样品(P145、P440和K562)中没有检测到。在基因组浏览器中显示5份临床CML样品和K562的Chr2:111580000..111650000DNA-PET数据。由绿线连接的暗红色和粉红色水平箭头代表表示存在缺失的不一致PET的定位区域(锚定区)。垂直短划线表示缺失的区域。

图4B显示通过针对缺失(chr2:111,599,666..111,602,568)的UCSC基因组浏览器′28-Way Cons′Track证明，该区域在哺乳动物中保守，y-轴上为保守程度。

图4C显示使用来自5位患者和K562细胞的基因组DNA样品，通过PCR证实该缺失。大小为4.2Kb的PCR产物对应于未缺失的等位基因，而大小为1.3Kb的PCR产物对应于缺失等位基因。M，1Kb标记(Fermentas)。

图4D描述全部三份含缺失的样品中通过PCR产物的Sanger测序找到的相同断点。缺失的序列以蓝色显示。

图5显示BIM多态性的功能效应。

图5A描述BIM的基因组构造，其显示主要BIM同工型(包括BIMEL、BIML和BIMS)的外显子以及BIMγ(已知含有外显子3的唯一同工型)的外显子^30-32。外显子2和外显子3之间的多态性缺失以红线突出显示。也突出显示了含有起始密码子(起始)、动力蛋白结合结构域(DBD)、BH3结构域(BH3)和终止密码子/多聚腺苷化信号序列(Stop/PolyA)的外显子。该图未按比例绘制。

图5B显示通过定量实时PCR在23份CML患者样品[无缺失的样品数n=11(WT)和带缺失的样品数n=12(携带者)]中测量的BIM的外显子特异性转录物的表达水平。含有外显子E2A、E3或E4的各种转录物的水平表示为相对于外显子2A或β-肌动蛋白的归一化比率。均数和均数标准误由红线和标度表示。统计显著性(p)由Wilcoxon秩和检验计算。

图5C显示使用实施例2中描述的方法，来自东亚人和非东亚人CML细胞系的收集物中的PCR反应产物，其中进行所示PCR检测缺失。

图5D显示在具有或不具有缺失的CML细胞系中含有外显子3的转录物与含有外显子4的转录物的比率。

图5E是显示细胞裂解物中BIMEL水平的蛋白质印迹，其中所述细胞裂解物是在用1μM伊马替尼处理具有或不具有缺失的细胞系24小时后获得的。

图5F显示用1μM伊马替尼一起培养的具有或不具有缺失的CML细胞系的生长曲线。

图5G显示伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)和ABT-737针对KCL22和KYO-1细胞的凋亡活性。细胞用2μM伊马替尼、50nM达沙替尼或2.5μM ABT-737处理48小时，并且通过流式细胞术测定死细胞百分数。

图6显示BIM多态性与酪氨酸激酶抑制剂临床耐药性的相关性。根据通过欧洲白血病网络标准确定的对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感性或耐药性以及BCR-ABL中已知引起耐药性的突变存在与否，将两个东南亚转诊中心处所见到的慢期或加速期CML患者分组。然后确定BIM多态性在这些组中每一个组内的发生率。使用双尾Fisher精确检验计算P值。

图6A显示具有TKI耐药和BCR-ABL突变的患者和具有TKI耐药而不存在BCR-ABL突变的患者中BIM缺失的频率。

图6B显示患有TKI敏感性疾病的患者和具有TKI耐药而不存在BCR-ABL突变的患者中BIM缺失的频率。

图6C显示患有TKI敏感性疾病的患者和存在TKI耐药的全部患者中BIM缺失的频率。

图7显示从cPET标签计数推断的拷贝数信息。染色体在水平轴上以交替绿色和蓝色排列，如底部上所示。拷贝数值在Y-轴上用红色显示的平滑化窗口值显示。样品ID在图的左上角中显示。注意K562的y-轴尺度不同。

图8显示东亚人中BIM缺失的基因组背景。

图8A.74位HapMap I期东亚个体针对BIM中的内含子缺失进行基因分型，并且使用HaploView软件，使缺失基因型与SNP基因型相关(Barrett等人,2005)。基于LD的单倍型域用SNP以基因组顺序从左至右显示。单倍型频率在右侧以灰色显示。标记#49代表BIM缺失，其中A=无缺失，C=缺失。这种缺失以蓝色单倍型为背景，其与和最频繁的红色单倍型相同的缺失分开。单倍型标记的SNP以箭头标记。

图8B.A(#)中的加标签SNP的ID(名称)用它们的杂合性频率(ObsHET)、微小等位基因频率(MAF)和等位基因显示。

图9.DNA配对末端标签(PET)测序法。将基因组DNA经液压剪切，将EcoP15I识别位点甲基化并且EcoP15I CAP衔接子(adaptor)连接至DNA片段的末端。甲基化的DNA构建体在琼脂糖凝胶上分离并且选择9Kb大小的片段用于连接，产生环化产物，其中这些9Kb片段的5′末端(R3，暗红色)和3′末端(F3，粉红色)由具有两个侧翼非甲基化EcoP15I CAP衔接子的内部生物素酰化衔接子连接。通过甲基化敏感性EcoP15I消化构建体以释放5′和3′PET构建体。将测序衔接子连接至PET构建体，所述PET构建体随后由PCR扩增并且通过Applied Biosystems SOLiD系统测序。所产生的PET相对于人类参考序列hg18定位。

图10.通过dPET聚类(cluster)鉴定结构性变异(SV)。‘解读′显示经测序的基因组的基因组结构，其从相对于人类参考序列的PET聚类的定位图(‘相对于参考定位′)推断得出。暗红色箭头代表5′锚定区，粉红色箭头代表3′锚定区。灰色、蓝色和红色水平线代表染色体区段。红箭头指示染色体区段的取向。

图11.细胞遗传预测的异染色体17q的重构。大小为2的DNA-PET聚类连接染色体17位置17,595,066负链与染色体17位置28,282,853正链。顶部，显示染色体17带图，断点位置由红色垂线显示。暗红色和粉红色箭头表示PET的定位位置和取向。中部，显示对应于顶部上红线的断点区域的基因组浏览器视图。红色迹线代表一致定位PET的覆盖范围；基因以绿色显示；暗红色和粉红色箭头表示PET的定位位置(mapping position)和取向(orientation)。底部，基于DNA-PET数据的异染色体17q的重构。箭头指示渐增的基因组坐标的方向。

图12.与急变转化相关的体细胞结构变异。

图12A显示BCR和ABL1基因的基因组结构和易位断点的位置。外显子由框指示，内含子由指示转录方向的羽化线表示(+链，从左到右)。断点的位置由具有相应样品ID的红色垂线指示。

图12B关联BCR与ABL1的配对末端读数(对覆盖范围归一化的聚类尺度)次数相对于关联事件(reciprocal event)的比率与病情进展相关。在水平轴上显示染色体22上的BCR和染色体9上的ABL1的基因组区域，基因以绿色和蓝色显示。拷贝数估计值由紫色迹线表示。粉红色和暗红色箭头显示BCR和ABL1之间的关联性。BCR-ABL1易位和ABL1-BCR易位的PET的数目分别以蓝色和灰色显示。垂直短划线指示断点的位置。

图12C显示由DNA-PET鉴定的BCR-ABL1易位的FISH验证结果。

图13.BIM的外显子特异性转录物的表达水平。通过定量实时PCR在7个细胞系中测量表达水平，所述细胞系生成自未患CML的正常个体[不带缺失的个体数n=3(WT)，带有缺失的个体数n=4(携带者)]。含有外显子E2A、E3或E4的各种转录物的水平表述为相对于外显子2A或β-肌动蛋白的归一化比率。鉴定的一位纯合携带者的表达以绿色突出显示。统计显著性(p)由双尾Wilcoxon秩和检验以及双尾t-检验(黑色)计算。

图14A至图14D是显示在TKI耐药CML患者样品中存在的BIM的内含子2内2903bp缺失多态性的简图。

图14A.显示了来自5份临床CML样品和K562细胞的包含Chr2:111,580.000..111,650.000的DNA-PET数据的基因组浏览器视图。通过DNA-PET在来自存在伊马替尼耐药的患者的全部三份样品(P308、P022和P098)中均检测到BIM缺失，但是在来自伊马替尼敏感的患者或细胞系的样品(P145、P440和K562)中没有检测到。红色迹线代表定位至该区域的经测序的一致PET的数目(覆盖范围)。由绿线连接的紫红色和粉红色水平箭头代表不一致PET的定位区域并且表示存在缺失。垂直短划线表示缺失的区域。

图14B．描述内含子性BIM缺失多态性和侧翼序列的示意图。通过PCR产物的Sanger测序鉴定的断点。缺失的序列以蓝色突出显示。人类参考序列坐标基于NCBI Build36。

图14C.显示使用在缺失旁侧分布的引物时来自5份患者样品和K562细胞的PCR产物的琼脂糖凝胶。大小4,226bp和1,323bp的PCR产物分别对应于无缺失和缺失的等位基因。4,226bp和1,323bp产物的存在表示该个体对这种缺失多态性为杂合。

图14D.显示缺失多态性在不同人种群体中频率的表。将样品通过PCR进行基因分型并且在琼脂糖凝胶上分析，如a中所示。

图15A至图15J是显示缺失多态性对BIM基因功能的影响的简图。

图15A.BIM的基因组构造，显示了主要BIM同工型(包括BIMEL、BIML和BIMS)以及BIMγ(缺少BH3结构域)¹⁶的外显子。外显子2和外显子3之间的删除多态性以红线突出显示。也突出显示了含有起始密码子(起始)、动力蛋白结合结构域(DBD)、BH3结构域(BH3)和终止密码子/多聚腺苷化信号序列(终止/PolyA)的外显子。该图未按比例绘制。

图15B.两个微型构建体的示意图，所述微基因构建体被转染至K562或KCL22CML细胞中并且用作计量针对外显子3/4的剪接作用的解读。使用针对U-E3和U-E4转录物的特异性引物，通过Q-PCR获得外显子3/4比率，针对腺病毒特异性外显子序列(U)归一化。

图15C.与K562细胞(左侧图)中和KCL22细胞(右侧图)中的缺失微基因构建体相比，无缺失的微基因构建体中增加的E3转录物对E4转录物比率的柱状图(均数+/-均数标准误，**p=0.0002，**p=0.012)。

图15D.通过定量实时PCR(Q-PCR)在23份CML患者样品[无缺失的样品数n=11(WT)和带缺失的样品数n=12(携带者)]中测量的BIM的外显子特异性转录物的表达水平。含有外显子E2A、E3或E4的各种转录物的水平表述为相对于E2A(对于E3和E4)或β-肌动蛋白(对于E2A[总BIM转录物])的归一化比率。均数和均数标准误由红线和标度表示。一位纯合携带者的表述水平以绿色突出显示。使用Wilcoxon秩和检验确定统计显著性。

图15E.使用图14中所述的方法的PCR产物的琼脂糖凝胶，鉴定东亚人和非东亚人CML细胞系的收集物中的多态性。

图15F.具有缺失多态性的CML细胞系(KCL22)和不具有缺失多态性的CML细胞系(K562和KYO-1)中含有E3的转录物对含有E4的转录物的比率(均数+/-均数标准误，*p=0.016，**p=0.011)。

图15G.在1μM伊马替尼处理24小时后，具有和不具有缺失多态性的细胞系中通过Q-PCR测量BIM外显子4特异性转录物的表达水平(针对β-肌动蛋白归一化)(均数+/-均数标准误，对于伊马替尼处理的KCL22细胞，*p<0.01，**p=0.004)。

图15H.显示BIMEL(含有外显子4和BH3结构域)和CrkL在细胞裂解物中水平的蛋白质印迹，所述细胞裂解物来自如图15G中处理的细胞系。在全部三细胞系中，伊马替尼暴露导致CrkL的去磷酸化，表示对BCR-ABL激酶活性的抑制。

图15I.显示如图15G中所述处理的细胞中胱天蛋白酶(caspase)3裂解作用的蛋白质印迹。

图15J.分析在具有或没有ABT-737的情况下用伊马替尼处理的细胞系的胱天蛋白酶3裂解作用的蛋白质印迹。

图16A至16H是显示携带BIM缺失多态性的CML细胞系的从头生成和分析的简图。

图16A使用锌指核酸酶(ZFN)向K562CML细胞系的基因组引入BIM缺失多态性的策略的示意图。

图16B.使用图16A中所述的引物来检测基因组编辑的K562细胞系中多态性的PCR产物，以KCL22细胞作为对照。分离对缺失多态性呈阴性(K562-BIM^内含子+/+)以及杂合(K562-BIM^内含子+/-)和纯合(K562-BIM^内含子-/-)的克隆。

图16C.K562-BIM^内含子+/+、K562-BIM^内含子+/-和K562-BIM^内含子-/-细胞中通过Q-PCR测量的外显子3/外显子4转录物比率(均数+/-均数标准误，*p=0.002，**p=0.0001)。

图16D.K562-BIM^内含子+/+、K562-BIM^内含子+/-和K562-BIM^内含子-/-细胞中伊马替尼暴露后含有E4的转录物的表达(均数+/-均数标准误，*p=0.015，**p=0.001)。

图16E.用渐增浓度的伊马替尼处理后，来自K562-BIM^内含子+/+、K562-BIM^内含子/-和K562-BIM^内含子-/-细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹。蛋白质印迹用针对BIMEL、切割的胱天蛋白酶3、PARP、CrkL和β-肌动蛋白的抗体探测。

图16F.e中BIMEL(**p=0.0086，***p=0.00016)和切割的PARP(*P=0.018，**P=0.0084)的研究结果的光密度测定柱状图，所述研究结果分别针对β-肌动蛋白和未切割的PARP归一化(均数+/-均数标准误)。

图16G.使用基于ELISA的测定法来检测凋亡细胞的胞质部分中的单核小体和寡核小体的相对凋亡性细胞死亡(均数+/-均数标准误，**p=0.006，***p=0.00021)。

图16H.蛋白质印迹，其显示添加BH3模拟物药物ABT-737至伊马替尼对K562-BIM^内含子+/+、K562-BIM^内含子+/+和K562-BIM^内含子-/-细胞中凋亡信号传导的影响。

图17.DNA配对末端标签(PET)测序方法.将基因组DNA经液压剪切，将EcoP15I识别位点甲基化并且EcoP15I CAP衔接子连接至DNA片段的末端。甲基化的DNA构建体在琼脂糖凝胶上分离并且分别选择5、7和9Kb大小的片段用于连接，产生环化产物，其中这些5、7或9Kb片段的5′末端(R3，暗红色)和3′末端(F3，粉红色)通过具有两个侧翼非甲基化EcoP15I CAP衔接子的内部生物素酰化衔接子连接。通过甲基化敏感性EcoP15I消化构建体以释放5′和3′PET构建体。将测序衔接子连接至PET构建体，所述PET构建体随后由PCR扩增并且通过Applied Biosystems SOLiD系统测序。所产生的PET相对于人类参考序列NCBI build36定位(图改编自)¹。

图18.六个CML基因组的DNA-PET分析。六个CML基因组的核基因组图，所述图使用Circos从DNA-PET数据生成并且绘制为环形图¹⁸。滤除与31个正常基因组至少之一中所鉴定的那些SV匹配的SV(表H3至H5)。将不同类别的结构变异(SV)以同心层方式如图注中所示那样排列布。星号(*)表示存在BCR-ABL/ABL-BCR易位。染色体9/22易位在P098中因der9上相互ABL/BCR融合的3Mb缺失而丧失其均衡特征，在K562中因复杂重排而丧失其均衡特征。在P440中找到的易位可能是插入，并且也在来自相同患者(P145)的配对样品中借助PCR而不是DNA-PET而找到(见表H5的脚注)。

图19A至19C.六个CML基因组中的BCR-ABL重排。

图19A显示BCR和ABL1基因的基因组结构以及易位断点的位置。外显子由黑色框指示，而内含子由指示转录方向的羽化线表示(+链，从左到右)。断点的位置由红色垂线连同相应样品的ID指示。

图19B显示使BCR与ABL1关联的配对末端读数(聚类尺度)次数(蓝色)以及使ABL1与BCR关联的关联事件(灰色)的比率与疾病阶段相关。在水平轴上显示染色体22上的BCR和染色体9上的ABL1的基因组区域，BCR和ABL1以绿色显示。拷贝数估计值由紫色迹线表示。粉红色和紫红色箭头显示BCR和ABL1之间的关联性。BCR-ABL易位和ABL-BCR易位的针对样品特异性测序深度修正的DNA-PET信号(覆盖范围；见表H1)分别以蓝色和灰色显示。垂直短划线指示断点的位置。‘MMR′=主要分子缓解。

图19C显示由DNA-PET鉴定的BCR-ABL1易位的FISH验证结果。用于BCR和ABL1的FISH探针分别标记为绿色和红色。根据DNA-PET结果，P145显示均衡的易位事件(二个融合物)和每一者的一个正常副本(1G1R)，P440不显示BCR基因座和ABL1基因座之间的易位事件(2R2G)，P022显示均衡易位和与BCR-ABL的额外副本相对应的一个额外融合物(三个融合物)以及每一者的一个正常副本(1G1R)，P098显示BCR-ABL之间的融合物(一个融合物)和与染色体9上ABL1缺失相对应的BCR探针剩余信号(1G)以及每一者的一个正常副本(1G1R)。

图20.BIM的外显子3含有终止密码子和多聚腺苷化信号。BIMγ的核苷酸序列和衍生氨基酸序列用右侧上所示的残基编号和碱基编号显示。外显子3的核苷酸序列以蓝色突出显示，并且外显子3内部的终止密码子(TGA)以红色突出显示。外显子3中的多聚腺苷化信号(AATAAA)加下划线显示。

图21.与BIMγ相比，BIML和BIMS是更有力的凋亡诱导物。将BIML、BIMS和BIMγcDNA克隆至pcDNA3-FLAG3质粒中(Koji Itahana的慷慨馈赠)。5μg质粒被核转染至KCL22细胞中并且核转染24小时后，使用膜联蛋白V-FITC/7-AAD染色法测量凋亡细胞的量。显示的全部数据均是三次独立实验的均值(+/-均数标准误)。

图22A至22C。siRNA介导的BIMγ敲减不使KCL22细胞对伊马替尼敏感。

图22A显示伊马替尼在BIMγ敲减后对KCL22细胞的凋亡性活性。细胞用siRNA转染24小时(U=未转染的对照)，并且用2μM伊马替尼处理另外48小时，并且凋亡细胞百分数由流式细胞术测定。

图22B显示BIM的含有E3的转录物在用对照或E3特异性siRNA转染的KCL22细胞中的表达水平，其通过定量实时PCR测量。统计显著性由Student t-检验确定。

图22C显示与K562和KYO1相比，用对照或E3特异性siRNA转染的KCL22细胞中含有E3的转录物和含有E4的转录物的比率。显示的全部数据均是三次独立实验的均值(+/-均数标准误)。

图23.BIM缺失多态性对淋巴母细胞样细胞系中BIM基因剪接的功能性影响。通过定量实时PCR(Q-PCR)在来自7位正常HapMap个体的淋巴母细胞样细胞系[3位不带缺失(WT)和4位带缺失(携带者)]中测量的BIM的外显子特异性转录物的表达水平。含有外显子E2A、E3或E4的各种转录物的水平表述为相对于E2A(对于E3和E4)或β-肌动蛋白(对于E2A)的归一化比率。这些携带者之一是纯合的(绿色菱形)。

图24.比较通过DNA-PET在慢性期期间和缓解后从相同患者获得的样品中鉴定到的dPET聚类。在患者样品P145和P440之间比较‘低置信度聚类排除’合格的dPET聚类。聚类划分成两个组：在两份样品中均鉴定到的聚类(共享聚类)和仅在两份样品之一中鉴定到的聚类(独特聚类)。在这些分组内部，显示尺度2至50的聚类部分(fraction)。

图25A至25F是显示HCC2279(一种携带BIM缺失多态性的NSCLC细胞系)对吉非替尼的内在耐受性的简图。

图25A.使用前述方法鉴定HCC2279细胞中多态性的PCR产物的琼脂糖凝胶¹³。

图25B.具有缺失多态性(HCC2279)和不具有缺失多态性(PC9)的NSCLC细胞系中含有E3的转录物对含有E4的转录物的比率(均数+/-均数标准误)。

图25C.在对照(DMSO)或0.5μM吉非替尼处理24小时后，PC9和HCC2279中通过Q-PCR测量的含有外显子4的BIM转录物的表达水平(针对β-肌动蛋白归一化)(均数+/-均数标准误，对于吉非替尼处理的PC9细胞，*p=0.0025)。

图25D.显示BIMEL(含有外显子4和BH3结构域)和PARP在细胞裂解物中水平的蛋白质印迹，所述细胞裂解物来自对照(DMSO)或0.5μM吉非替尼处理24小时的细胞系。

图25E.显示用0.5μM吉非替尼、2.5μM ABT-737或这两者处理24小时的细胞中磷酸-EGFR(p-EGFR)、PARP和胱天蛋白酶3裂解的水平的蛋白质印迹。

图25F.用0.5μM吉非替尼、2.5μM ABT-737或这两者处理48小时的PC9和HCC2279细胞的生存力。细胞生存力由台盼蓝拒染法测定并且以无药物对照的百分数作图。(均数+/-均数标准误，对于吉非替尼处理和ABT-737处理的PC9细胞，*p=0.00004)。

图26是显示BIM缺失多态性预测采用EGFR TKI疗法治疗的EGFR-突变性非小细胞肺癌患者具有较差的无进展生存期的简图。确来自新加坡和日本的141位NSCLC患者中BIM缺失多态性的存在与否，其中所述患者已知在EGFR中具有激活的突变并且接受了TKI疗法。使用Kaplan-Meier方法估计每个组的无进展生存期。

序列表

SEQ ID NO:1是使用BIM_del_F和BIM_del_R引物从具有所述缺失的BIM基因扩增的PCR片段的序列(长度1,323bp)。

SEQ ID NO:2是使用BIM_del_F和BIM_del_R引物从具有所述缺失的BIM野生型基因扩增的PCR片段的序列(长度4,226bp)。

SEQ ID NO:3是Bim_del_F正向引物(+chr2:111,599,051..111,599,070，hg18)的序列。

SEQ ID NO:4是Bim_del_R反向引物(-chr2:111,603,257..111,603,276，hg18)的序列。

SEQ ID NO:5是BIM:chr2:111,599,666-111,602,568(hg18)中所述的缺失:chr2:111,598,666-111,599,665上游的1000bp侧翼序列的序列。

SEQ ID NO:6是在BIM:chr2:111,599,666-111,602,568(hg18)中缺失的序列。

SEQ ID NO:7是BIM:chr2:111,599,666-111,602,568(hg18)中所述的缺失:chr2:111,602,569-111,603,568下游的1000bp侧翼序列的序列。

发明详述

本发明描述了我们在东亚人群体中发现的BIM基因内的一种新的多态性。这种多态性是与慢性髓性白血病(CML)患者中耐药性的形成相关。

患有CML并携带这种多态性的患者比不是这种情况的患者更可能对CML的标准疗法形成耐药性。对这种多态性的检测可用作生物标记用于预测耐药性和早期鉴定可能从替代性疗法和/或更激进疗法中获益的患者。另外，因为BIM基因在其他癌类型中是一种疗法诱导细胞死亡的重要介体，所以我们的发明也可能对东亚人群中广泛类型的人类癌症有意义。

为了发现TKI耐药机制，我们应用了一项称作基因组配对末端双标签或DNA-PET的新技术(参考文献A2、参考文献A3)，其与高通量测序串联以探查来自具有或没有耐药性的患者的CML细胞的基因组。在此过程中，我们发现了与BCR-ABL非依赖性TKI耐药形成相关的BIM基因中一个先前未知的缺失。具有这种缺失的患者具有BCR-ABL非依赖性TKI耐药可能性是没有这种缺失的患者的4至5倍(17.4%对3.9%)(p=0.04，双尾Fisher精确检验)。此外，我们也已经能够使BIM缺失的存在与否与来自患者的CML细胞系中的BCR-ABL非依赖性TKI耐药关联，这提示了BIM缺失在TKI耐药中的直接机制性地位。由于已知TKI-介导的CML细胞死亡需要BIM蛋白的促凋亡同工型的上调(参考文献A4-A7)，所以我们假设BIM缺失破坏了促凋亡BIM的表达。

BIM多态性

我们描述了包含一个或多个BIM多态性核酸分子的分离的多核苷酸。这些多核苷酸以及相应多肽在本文中各异地描述为“BIM(BCL2L11)基因的多态性变体”或简单地为“BIM多态性”。

这种分离的多核苷酸可以在多种诊断方法中使用。如本文中所述的分离的多态性BIM核酸分子可以在一种或多种以下方法中使用：a)筛查分析法；b)预测医学(例如，诊断性测定、预后性测定、监测性临床试验和药物遗传学)；和c)治疗方法(例如，治疗性和预防性方法)。

BIM基因是是本领域已知的，如本文献中其他地方所述。BIM基因的来源可以是任何哺乳动物BIM基因。通常，对于诊断测定，BIM基因的动物来源将是与正在测试其核酸的动物的相同种类。

分离的多态性BIM核酸分子包含一个或多个BIM多态性。例如，BIM多态性可以按5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所述的核苷酸序列，和紧接SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列。这种BIM多态性变体可以以缺少SEQ IDNO:6中所述的核苷酸序列为特征。

对于一些用途，例如，在筛查性分析中，BIM多态性核酸分子将具有至少约15个核苷酸(nt)，至少约18个nt，至少约20个nt，或至少约25个nt长度，并且经常至少约50个nt。这类小DNA片段可用作聚合酶链反应(PCR)、杂交筛查等的引物。较大多核苷酸片段，例如、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约300nt、至少约500nt、至少约1000nt、至少约1500nt、多达完整编码区，或多达完整编码区外加距BIM基因多达约1000nt的5′侧翼序列和/或多达约1000nt3′侧翼序列可用于产生编码的多肽、启动子基序等。为了用于扩增反应如PCR中，将使用一对引物。引物序列的确切组成不重要，但是对于大部分应用，所述引物将与主题序列在本领域已知的严格条件下杂交。

当用作探针时，分离的多态性BIM核酸分子可以包含非BIM核苷酸序列，只要额外的非BIM核苷酸序列不干扰检测试验。探针可以包含分离的多态性BIM序列，和任何数目的非BIM核苷酸序列，例如，约1bp至约1kb或更多。

出于筛查目的时，多态性序列的杂交探针可以在两种形式均存在的情况下使用，或者在独立的反应中，在固相基质上空间分离，或经标记从而它们可以彼此区分。测定可以利用与一个或多个所述多态性杂交的核酸。

本文所述的分离的多态性BIM核酸分子可以直接或间接地(例如，经接头分子)与固态基体偶联(例如，化学缀合)。固体基体可以是本领域已知的任一种，包括但不限于珠，例如，聚苯乙烯珠；芯片，例如玻璃、二氧化硅等；塑料表面，例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯塑料多孔板等。

分离的多态性BIM核酸分子可以通过化学合成或生物化学合成、通过重组DNA技术、或通过从生物来源分离核酸或前述方式之任意组合获得。例如，可以使用本领域已知的固相合成技术合成核酸。Edge等人,(1981)Nature292:756；Duckworth等人,(1981)Nucleic Acids Res.9:1691和Beaucage和Caruthers(1981)Tet.Letters22:1859也描述了寡核苷酸合成。在制备核酸后，则将核酸连接于表达系统的其他元件，以产生包含与转录起始区和终止区可操作组合的编码主题产物的核酸的表达盒或系统，所述表达盒或系统使所述核酸在合适条件下表达成主题多肽产物。

可以使用本领域已知的多种方法，包括但不限于SSCP、变性HPLC和测序的任一种鉴定额外的BIM基因多态性。SSCP可以用来鉴定额外的BIM基因多态性。通常，选择PCR引物和限制性酶，从而产生尺度范围为约25bp至约500bp、或约100bp至约250bp、或其中任何中间或重叠范围的产物。

多态性BIM多肽

我们进一步描述了分离的多态性BIM多肽。分离的多态性BIM多肽可用于筛查调节BIM多肽的生物活性的药物的试验中。

术语“多态性BIM多肽”包括由已知BIM多核苷酸的开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列，包括全长天然多肽及其片段，尤其是生物活性片段和/或与功能性结构域相对应的片段，例如具有生物活性的区域或结构域等；其抗原性片段，并且包括主题多肽与其他蛋白质或其部分的融合物。BIM多肽的氨基酸序列已经公开。见，例如上文的Moore等人。BIM多肽中的多态性通常相对于一种参考序列定义。

如本文所用，“多态性BIM多肽”指具有以下对象的氨基酸序列的重组或非重组多肽的氨基酸序列：i)天然多态性BIM多肽，ii)多态性BIM多肽的片段，iii)多态性BIM多肽的多肽类似物，iv)多态性BIM多肽的变体；v)多态性BIM多肽的免疫活性片段；和vi)包含多态性BIM多肽的融合蛋白。多态性BIM多肽可以从生物样品获得，或来自任何来源，无论其是否为天然、合成的、半合成或重组的。

术语“多态性BIM多肽”包括了包含多态性BIM多肽的至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约75个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约200个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约400个氨基酸或多达整个多肽的多肽。在一些实施方案中，多态性BIM多肽显示生物活性，例如，这种多肽在体外测定中引起B细胞增殖和免疫球蛋白的产生。BIM生物活性的其他测定是本领域已知的并且可以用来测定一种多态性BIM多肽是否显示生物活性并且如果需要，则用来定量BIM生物活性。BIM生物学测定在各种出版物中描述，例如上文的Moore等人。

多态性BIM多肽可以是融合蛋白的部分。合适的融合配对体(partner)(例如，非BIM多肽，或“异源多肽”)包括但不限于提供免疫识别的异源多肽，例如，表位标签；提供可检测信号的异源多肽，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶等；提供催化功能的异源多肽；和促进进入细胞的异源多肽。使用合成多肽的标准方法或使用重组方法，可以将这种融合配对体与多态性BIM多肽的N末端、C-末端或两端符合可读框地偶联。

多态性BIM多肽可以通过任何已知的方法，或这类方法的组合获得，包括从天然来源分离中；通过化学合成产生；和通过标准重组技术产生。

可以使用亲和层析，例如，使用对BIM多肽特异的固定在固相支持物上的抗体，从生物学来源分离多态性BIM多肽。取决于表达目的，这些多肽可以根据常规方式在原核生物或真核生物中表达。为了大规模生产这种蛋白质，可以使用单细胞生物，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、与杆状病毒载体组合的昆虫细胞或高等生物如脊椎动物、尤其哺乳动物的细胞，例如COS7细胞s、CHO细胞、HEK293细胞等作为表达宿主细胞。在一些情况下，想要在真核细胞中表达该基因，其中这种蛋白质将得益于天然折叠过程和翻译后修饰。多肽随后可以使用亲和层析方法或阴离子交换体积排阻色谱方法从细胞培养上清液或从细胞裂解物分离，如上文所述。

随着通过使用表达宿主可大量获得蛋白质或其片段，可以根据常规方式分离和纯化蛋白质。可以制备表达宿主的裂解物并且使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化裂解物。

BIM多态性的检测

通过采用多种不同方法分析DNA的多态性或突变，例如，本文所述的BIM多态性。

因此，可以通过本领域已知的任何手段实现在源自个体的多核苷酸样品中检测BIM多态性，所述手段包括但不限于，用特异性引物扩增序列；测定多核苷酸样品的核苷酸序列；杂交分析；单链构象多态性分析；变性梯度凝胶电泳；错配切割检测等。也可以通过以下方式实现对BIM多态性的检测：检测BIM基因的mRNA转录物水平的改变；BIM基因的异常修饰，例如，异常甲基化谱图；BIM mRNA非野生型剪接样式的存在；BIM多肽水平的改变；和/或BIM多肽生物活性的改变。

样品

源自(例如，获自)个体的多核苷酸样品从取自该个体的生物样品获得。包含来自所述个体的多核苷酸的任何生物样品都适合使用。可以加工生物样品，从而分离多核苷酸。可选地，可以在不分离其中所含多核苷酸的情况下使用完整细胞或其他生物样品。

核酸扩增

可以按众多方式通过分析多核苷酸样品检测BIM多态性。测试核酸样品可以用扩增已知包含BIM多态性的序列区域的引物扩增。可以直接使用基因组DNA或mRNA。可选地，可以将目的区域克隆至合适的载体中并且培育至足以分析的量。

核酸可以由常规技术如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)等扩增，以提供足以用于分析的量。聚合酶链式反应的用途在多种出版物中均有描述，所述出版物包括例如，″PCR Protocols(Methods in MolecularBiology)″(2000)J.M.S.Bartlett和D.Stirling编著,Humana Press；和″PCRApplications:Protocols for Functional Genomics″(1999)Innis,Gelfand和Sninsky编著,Academic Press。

可以在扩增反应中包含可检测的标记物。合适的标记物包括荧光物质，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、放射性标记物，例如³²P、³⁵S、³H等。标记物可以是一种两阶段体系，其中扩增的DNA与具有高亲和力结合配偶物的生物素、半抗原等(例如抗生物素蛋白avidin)、特异性抗体等缀合，其中所述结合配偶物与可检测标记物缀合。标记物可以与引物之一或两种引物缀合。可选地，标记在扩增中所用的核苷酸汇集物，从将标记物掺入扩增产物中。

一旦包含BIM多态性的区域已经扩增，则可以通过核苷酸测序、通过SSCP分析，或本领域已知的任何其他方法检测PCR产物中的BIM多态性。

核酸测序

最确定的方法是将DNA或转录的mRNA测序(如果适用)以确定实际碱基序列(Maxam和Gilbert，1977；Sanger等人,1977)。

样品核酸可以由双脱氧链终止方法或其他熟知方法测序。可以直接使用基因组DNA或mRNA。如果使用mRNA，可以首先产生cDNA副本。如果需要，可以使用PCR扩增样品核酸。本领域已知的多种测序反应均可以用来直接将其中已知出现具体多态性的BIM基因或其部分进行测序，并且通过将样品核酸的序列与含有BIM多态性的参考多核苷酸进行比较来检测多态性。可以使用多种自动化测序方法的任一种。见，例如WO94/16101；Cohen等人,(1996)Adv.Chromatography36:127-162。

虽然这种方法是最确定的，但是它也是最昂贵和最费时的方法。

限制性作图分析(RFLP分析)

个体中的特定DNA序列，例如，编码BIM基因的多态性变体(BCL2L11)的基因，可以发生许多不同变化，如DNA序列的缺失、插入重复的序列、序列倒位、或单个核苷酸转变成另一种。可以通过使用识别4-6个核苷酸的特定DNA序列的限制性酶，追踪特定DNA序列的变化。

限制性作图分析可以因此也用于分析DNA的多态性。如果正在搜寻某位点处将改变限制性酶的识别位点的已知多态性，则可以简单地用这种限制性酶消化DNA并在凝胶上分析片段或采用DNA印迹法测定在所述多态性的存在与否。这种类型的分析也可用于确定巨大插入或缺失的存在与否。用等位基因特异性寡核苷酸杂交是用于测定已知多态性的存在的又一种方法。

限制性酶在它们的特异性识别序列处切割(消化)DNA，产生百万个左右的小片。当存在使限制性酶识别的序列变成不识别序列的差异时，因切割这个区域所产生的DNA小片具有不同的大小。来自给定区域的各种可能片段大小因此取决于该区域内精确的DNA序列。

所产生的片段的变异称作“限制性片段长度多态性”(RFLP)。反映不同变异DNA序列的不同大小的片段可以通过将消化的DNA根据其大小分离进行可视化。可以通过各种手段进行分级，如凝胶或毛细管电泳，尤其是丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。

例如，DNA片段可以在琼脂糖凝胶上电泳并通过与放射性标记的DNA“探针”复性而使各个片段可视化。每位个体均可以携带两种不同形式的具体序列。当两种同源物携带相同形式的多态性时，见到一条带。对于特定的DNA标记，多于两种形式的多态性可能在群体中存，但是在一个家族中，仅可能是4种形式；来自每位亲本的各两种形式。每个子体从每位亲本继承一种形式的多态性。因此，可以追踪每个染色体区域的来源(母系来源或父系来源)。

前述技术是本领域熟知的。这些技术的详细描述可以在多种出版物中找到，例如包括″Laboratory Methods for the Detection of Mutations andPolymorphisms in DNA″(1997)G.R.Taylor编著,CRC Press和其中引用的参考文献。

逆转翻译聚合酶链式反应(RT-PCR)

可选地或额外地，可以实施RT-PCR。通过使用对某种多态性特异的引物，PCR因此也可以用来确定这种多态性是否存在。

这类方法可以包括以下步骤：从个体采集包含个体遗传物质的生物样品作为模板，任选地从所述生物样品分离模板核酸(基因组DNA、mRNA或这两者)，使模板核酸样品与一个或多个引物接触，所述引物与BIM多态性核酸分子特异性杂交，杂交条件使得产生样品中模板核酸分子的杂交和扩增，并且相对于对照样品，检测扩增产物的存在、不存在和/或相对量并且比较长度。观察到预期大小的扩增产物表示BIM多态性引物内部所包含的BIM多态性存在于测试核酸样品中。

可以选择多项参数，如杂交条件、BIM多态性引物长度和多态性在BIM多态性引物内部的位置，从而使得除非引物中存在的多态性存也存在于样品核酸中，否则杂交将不发生。本领域普通技术人员完全知晓怎样选择和改变这类参数。见，例如Saiki等人,(1986)Nature324:163；和Saiki等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6230.

杂交分析

与变异序列的杂交也可以用来确定BIM多态性的存在。

杂交分析可以按众多不同方式实施，包括但不限于DNA印迹、RNA印迹、斑点印迹、微阵列等。如美国专利号5,445,934中或WO95/35505中所述，对照变异序列与固定于固相支持物上的寡核苷酸探针阵列的杂交谱图也可以用作检测变异序列存在的手段。

可以通过使样品和对照核酸与含有数百或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列杂交，鉴定核酸样品中的多态性。Cronin等人,(1996)Human Mutation7:244-255；和Kozal等人,(1996)Nature Med.2:753-759。

质谱法

美国专利号5,869,242中公开了质谱法测定已知基因内部存在多态性的用途。

寡核苷酸连接

可选地，利用寡核苷酸连接作为检测多态性的手段的各种方法是本领域已知的。见，例如Riley等人,(1990)Nucleic Acids Res.18:2887-2890；和Delahunty等人,(1996)Am.J Hum.Genet.58:1239-1246。

单链构象多态性(SSCP)分析

单链构象多态性(SSCP)分析是一种用于检测多态性的快速且有效的方法(Dean等人,Cell61:863,1990；Glavac和Dean,Hum.Mutation2:404,1993；Poduslo等人,Am.J.Hum.Genet.49:106,1992)。在SSCP中，凝胶上的异常链迁移率与基因中的突变事件相关。

凝胶基质中的变性梯度凝胶电泳(DGGE)、错配切割检测和杂双链体分析也可以用来检测多态性。

限制性核酸内切酶指纹分析(REF)

也可以实施限制性核酸内切酶指纹分析(REF)，任选地在实施RT-PCR后进行。REF是单链构象多态性(SSCP)方法的改良形式，并且使高效检测多达2kb长度的DNA片段中的序列改变成为可能(Liu和Sommer,1995)。

多态性的遗传分析在美国专利号5,552,28、5,654,13、5,670,33、5,807,67、5,858,66、5,691,15、5,922,57、5,972,60、6,136,53和5,955,26连同其他专利中均有详细公开。

等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析

另一种用于检测具体基因上多态性的方法是以下的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析(Conner,B.J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,80,278-282(1983))。这种方法可以通过以下方式进行：使DNA片段进行斑点印迹分析，所述DNA片段能够与寡核苷酸探针杂交，所述寡核苷酸探针特异于使用经设计从而夹住靶多态性的正向引物和反向引物的PCR扩增的基因片段的等位基因特异。以这种方式，可以检测到这类DNA片段上的多态性。

多肽分析

当多态性涉及氨基酸变化时，使用待分析基因的表达产物分析多态性是可能的。在这种情况下，可以使用部分蛋白质或部分肽作为用于分析的样品，只要它含有与多态性位点相对应的氨基酸。在这种情况下，可以使用直接分析多态性位点处氨基酸的方法或免疫学方法。已知的氨基酸序列分析方法如Edman方法可以在前者中使用，而使用对基因表达产物具有特异结合活性的单克隆或多克隆抗体的方法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA方法)、放射免疫测定法、免疫沉淀方法或免疫扩散方法，可以在后者中使用。

如上文所述获得的关于多态性的信息可以统计地汇总并且用于诊断疾病、检测和区分病情的相对风险并选择治疗法。

表达分析

众多方法均可用于确定特定样品中多态性BIM核酸分子(例如，多态性BIM mRNA)或多态性BIM多肽的表达水平。可以通过确定患者样品中不存在或存在正常或异常BIM mRNA或其改变的量的众多方法实施诊断。例如，检测可以利用标记抗体对细胞或组织学切片的染色，所述染色按常规方法进行。使细胞透化以着染胞质分子。将目的抗体添加至细胞样品，并孵育足以允许与表位结合的一段时间，通常至少约10分钟。所述抗体可以用放射性同位素、酶、荧光剂、化学发光剂或用于直接检测的其他标记物标记。可选地，第二阶段抗体或试剂用来扩大信号。这类试剂是本领域熟知的。例如，第一抗体可以与生物素缀合，添加辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白作为第二阶段试剂。可选地，第二抗体与荧光化合物，例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等缀合。最终的检测使用在过氧化物酶存在时发生颜色变化的底物。可以通过各种方法，包括解离细胞的流式细胞术、显微术、放射线照相术、闪烁计数等，确定是否存在抗体结合作用。也可以按普通技术人员已知的任何方式检测和/或定量多态性BIM多肽的存在和/或其水平。

此外，测试可以包括计算BIM mRNA的表达。可以进行生物化学研究以确定BIM编码区或控制区中的序列多态性是否与疾病相关。疾病相关的多态性可以包括基因的缺失或截短，改变表达水平，影响蛋白质活性的突变等。

启动子或增强子序列中可能影响BIM表达水平的变化可以通过各种本领域已知的方法与正常等位基因的表达水平比较。用于确定启动子或增强子强度的方法包括量化表达的天然蛋白质；插入变异控制元件至具有提供便利定量的报道基因如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶等的载体中等。

筛查多态性BIM多肽中的突变可以基于蛋白质的功能特征或抗原性特征。蛋白质截短测定法可用于检测可能影响蛋白质生物活性的缺失。可以在筛查中使用设计成检测多态性BIM多肽中多态性的各种免疫测定法。在许多不同遗传突变导致特定疾病表型的情况下，已经证明功能性蛋白质测定法是有效筛查工具。可以通过与缺少特定多态性的参考BIM多肽比较，确定编码的多态性BIM多肽的活性。

其中的BIM基因表达水平特别值得关注的诊断方法一般包括将目的样品的BIM核酸丰度与对照值比较以确定任何相对差异，其中所述差异可以定性地和/或定量地度量，所述差异随后与异常BIM基因表达谱图的存在与否相关。用于确定样品中核酸丰度的多种不同方法是本领域技术人员已知的，其中感兴趣的具体方法包括以下参考文献中描述的那些：Pietu等人,GenomeRes.(1996年6月)6:492-503；Zhao等人,Gene(1995年4月24日)156:207-213；Soares,Curr.Opin.Biotechnol.(1997年10月)8:542-546；Raval,J.PharmacolToxicol Methods(1994年11月)32:125-127；Chalifour等人,Anal.Biochem(1994年2月1日)216:299-304；Stolz和Tuan,Mol.Biotechnol.(1996年12月)6:225-230；Hong等人,Bioscience Reports(1982)2:907；和McGraw,Anal.Biochem.(1984)143:298。还值得关注的是WO97/27317中公开的方法，所述专利的公开内容通过引用的方式并入本文。

BIM(BCL2L11)

BIM是也称作BAM；BIM；BOD；BimL；BimEL；BIM-β6；BIM-β7；BIM-α6；BCL2L11。

BIM基因和多肽的GenBank登录号和UCSC基因ID如下：

GeneBank登录号：

UCSC基因ID：

以下转录物描述对应于上文所列的Gene Bank登录号和UCSC基因ID。

NCBI GeneBank(RefSeq)

NM_207002.2

智人(Homo sapiens)BCL2-样11(凋亡易化因子)(BCL2L11)，转录物变体9，mRNA。

NM_138621.3

智人BCL2-样11(凋亡易化因子)(BCL2L11)，转录物变体1，mRNA。

NM_006538.3

智人BCL2-样11(凋亡易化因子)(BCL2L11)，转录物变体6，mRNA。

UCSC基因

bim-α1(uc002tgw.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

bim-α1(uc002tgx.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

bim-α1(uc010fkd.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

bim-α1(uc002tgy.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

bim-α1(uc002tgz.1)

BCL2-样11转录物变体9。

RefSeq(NM_006538)

bim-α1(uc010fke.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

BCL2L11(uc002tha.1)

BCL2-样11同工型9

RefSeq(NM_138621)：

bim-α1(uc002thb.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

bim-α1(uc002thc.1)

Bim-α1，完整编码区。

RefSeq(NM_006538)：

BCL2L11(uc002thd.1)

BCL2-样11同工型9

RefSeq(NM_006538)：

UCSC基因组浏览器数据库/数据的文献

Rhead B、Karolchik D、Kuhn RM、Hinrichs AS、Zweig AS、Fujita P、Diekhans M、Smith KE、Rosenbloom KR、Raney BJ、Pohl A、Pheasant M、Meyer L、Hsu F、Hillman-Jackson J、Harte RA、Giardine B、Dreszer T、Clawson H、Barber GP、Haussler D、Kent WJ。UCSC基因组浏览器数据库：更新2010.Nucleic Acids Res.2010Jan；38(数据库发布)：D613-9。电子出版2009年11月11日。

由这个基因编码的蛋白质属于BCL-2蛋白家族。BCL-2家族成员形成异二聚体或同型二聚体并且充当参与多种细胞活动的抗凋亡或促凋亡调节物。由这个基因编码的蛋白质含有Bcl-2同源性结构域3(BH3)。已经证实它与BCL-2蛋白家族的其他成员(包括BCL2、BCL2L1/BCL-X(L)和MCL1)相互作用并充当凋亡激活物。这个基因的表达可以受神经生长因子(NGF)以及受叉头转录因子FKHR-L1诱导，这提示该基因在神经元凋亡和淋巴细胞凋亡中具有作用。小鼠对应物的转基因研究表明这个基因作为胸腺细胞阴性选择中重要的凋亡引发物而发挥作用。已经鉴定出该基因的几种可选的剪接转录物变体[由RefSeq提供]

预测慢性髓性白血病(CML)中的酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性

我们的发现可以在如下环境中具有临床用途。

带有BIM缺失的患者可以从更频繁地监测其状况中获益。这可以允许较早使用替代性和/或更激进疗法，例如骨髓移植，并且可以潜在地导致更好的临床结果。

BIM缺失可能充当治疗指导。例如，具有这种缺失的患者可代表可能对称作BH3-模拟物的一类药物特别敏感的TKI耐药性患者亚组(参考文献A8-A12)。这类药物如ABT-263(目前处于早期临床试验)选择性地靶向BCL2蛋白家族的促存活成员，并且所述促存活成员正常情况下将被BIM蛋白促死亡家族对抗。

CML是造血干细胞癌症，并且因称作BCR-ABL的致癌融合基因的存在引起，其中认为所述致癌融合基因是本病的原因。BCR-ABL编码组成型活性的酪氨酸激酶，所述酪氨酸激酶引起CML细胞比其正常对应物相比时增加的存活和增殖。

CML的有效治疗以一类抑制BCR-ABL激酶活性的药物形式存在，它们常称作酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。然而，随时间推移，一定比例的患者将对这些药物形成耐药，这是一个通常与原始细胞危象(BC)CML的转变以及存活较短相关的事件。

在约60%患者中，TKI耐药与BCR-ABL的重新激活有关，而BCR-ABL的重新激活则是由于BCR-ABL基因中使TKI更不能够与BCR-ABL结合的突变或使‘野生型′BCR-ABL基因或蛋白过量表达而引起的。在这两种情况下，BCR-ABL激酶活性均在TKI存在的情况下恢复，因此被称作BCR-ABL依赖性TKI耐药。在剩余的40%病例中，TKI耐药在BCR-ABL重新激活不存在的情况下发生并且被称作BCR-ABL非依赖性TKI耐药。

迄今，BCR-ABL非依赖性TKI耐药的原因还未知晓，并且对介导这种形式耐药性的机制理解的增加将对确定策略以克服TKI耐药至关重要。因为TKI耐药可能由形成TKI耐药的患者与不形成TKI耐药的患者之间获得性或继承性遗传差异而介导，我们推理这类差异的鉴定将是发现有望揭示TKI耐药机制。

因此，我们应用一项称作基因组配对末端双标签或DNA-PET的新技术，其与高通量测序串联以探查来自具有或没有耐药性并且具有或不具有BCR-ABL激酶结构域突变的患者的原代CML细胞的基因组。

在本公开中，我们描述了以下由我们的团队作出的新发现。

通过使用DNA-PET，我们已经发现了BIM基因中与BCR-ABL非依赖性TKI耐药形成相关的一个先前未知的缺失。使用有临床注释的一组CML患者样品，我们发现带有这种缺失的患者具有BCR-ABL非依赖性TKI耐药的可能性是没有这种缺失的患者的4至5倍(p=0.04，双侧Fisher精确检验)。

其次，我们已经发现，BIM缺失在患者CML细胞系中的存在与BCR-ABL非依赖性TKI耐药高度相关。一组源自7位患者的CML细胞系，我们发现了一个具有这种缺失的细胞系。重要地，仅含有这种BIM缺失的细胞系显示BCR-ABL非依赖性TKI耐药。这些结果显示了BIM缺失在BCR-ABL非依赖性TKI耐药中的直接机制性地位。由于已知TKI-介导的CML细胞死亡需要BIM蛋白的上调，所以我们假设BIM缺失破坏了BIM促凋亡同工型的表达。

进一步分析BIM缺失(使用如图4C中所示序列No.3和No.4所描述的引物，通过实施例2中所述的PCR测定法、SNP分析和HapMap数据)已经揭示这种缺失实际上是一种正常的多态性，它在东亚人后裔的个体中具有大约10%的频率。基于对60份高加索人种HapMap样品和446位德国人血液供体的筛查，这种缺失多态性可能不存于高加索人种中，或基于对60份约鲁巴HapMap样品的筛查(表E6)，它可能不存在于非洲(约鲁巴人)群体中。与BIM缺失的人种隔离一致，已经发现在b中描述的带有这种缺失的细胞系源自患有CML的日本个体(参考文献A31)。

表E6缺失多态性在HapMap和德国人个体中的基因型和等位基因频率。

这项研究结果具有以下部分中描述的几种意义和潜在临床用途。

本发明可以如下使用：

目前不可能预测哪些CML患者将形成TKI耐药。通过鉴定与增加的TKI耐药性形成风险相关的遗传因子，现在可能在东亚人群中鉴定这类个体。带有BIM缺失的患者随后将由其医师密切随访，并且可能建议所述患者对其疾病状态进行比目前推荐更频繁的监测。这些将包括更频繁的血液检查和骨髓检查。

此外，BIM缺失的存在可以预测对特定替代性治疗策略的敏感性。这些治疗策略包括增加伊马替尼剂量超过400mg/日标准剂量至600mg/日或800mg/日。可选地，这类患者可能用抑制(BIM蛋白质正常情况下是对抗的)BCL2组蛋白质的促存活作用的新型药物进行治疗。后一种可能性目前正在我们的实验室中探索。

重要地，因为TKI和其他靶向疗法费用十分昂贵，医师可针对发现具有BIM缺失的患者利用这项研究结果作为向其患者和/或第三付费方解释与使用更高药物剂量相关的成本增加或改变疗法或在缺失不存在的情况下避免这些策略的依据。

其他疾病

在患有其他癌症的患者中，BIM缺失的存在也可以作为形成耐药性的预测物以及替代疗法的指导。

这将类似于对CML所述的情况，并且可以包括其他血液学恶性病(慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病和多发性骨髓瘤)、骨髓增生病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、以及最常见的实体瘤(非小细胞和小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤和神经母细胞瘤)和胃肠道间质肿瘤(GIST)。

因此，本文公开的BIM多态性也可以用来在其他疾病如EGFR-驱动的非小细胞肺癌(NSCLC)和胃肠道间质肿瘤中检测针对激酶抑制剂治疗的耐药性(GIST、Gordon和Fisher，2010)。

因此，患有这类癌症和肿瘤并携带本文公开的BIM多态性的患者更可能对靶向它们各自的致癌激酶的疗法产生抗性。

此外，可参考Will等人,Apoptosis induced by JAK2inhibition ismediated by Bim and enhanced by the BH3mimetic ABT-737in JAK2mutanthuman erythroid cells(JAK2突变的人红细胞样细胞中因抑制JAK2诱导的凋亡由Bim介导并且由BH3模拟物ABT-737增强).Blood 2010年4月8日第115卷，第14期。该文献描述了以JAK2激活性突变为特征的骨髓增生病。该论文为JAK抑制剂也需要BIM表达从而产生敏感性提供了证据。

因此，本文公开的BIM多态性还可以用来在骨髓增生病如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化中检测针对激酶抑制剂治疗的耐药性。患有骨髓增生病(如携带本文公开的BIM多态性的那些骨髓增生病)的患者更可能对靶向它们各自的致癌激酶的疗法产生抗性。

我们公开了BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，所述多态性变体在包含这种多态性的个体中，与患有EGFR驱动型非小细胞肺癌(NSCLC)、c-KIT/PDGFR驱动型胃肠道间质肿瘤(GIST)或JAK2驱动型骨髓增生病的个体内激酶抑制剂治疗耐药性相关。

用来治疗EGFR驱动型非小细胞肺癌(NSCLC)的激酶抑制剂的例子包括吉非替尼和厄洛替尼，而用来治疗胃肠道间质肿瘤(GIST)的激酶抑制剂的例子是伊马替尼。骨髓增生病可以用针对其病因性激酶的激酶抑制剂，例如针对JAK2的抑制剂治疗。

BIM多态性可以包括BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其以5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所述的核苷酸序列，和紧接的SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列。这种BIM多态性变体(BCL2L11)可以以缺少SEQ ID NO:6中所述的核苷酸序列为特征。

我们公开了一种预测患有非小细胞肺癌(NSCLC)的个体是否可能对激酶抑制剂治疗形成耐药性的方法，所述方法包括确定该个体是否具有所述的BIM(BCL2L11)多态性。这种耐药性可以是EGFR再激活非依赖性的。这种非小细胞肺癌(NSCLC)可以包括与EGFR激活相关或由其引起的非小细胞肺癌(NSCLC)，如EGFR驱动型非小细胞肺癌(NSCLC)。

我们还公开了一种预测患有胃肠道间质肿瘤(GIST)的个体是否可能对激酶抑制剂治疗形成耐药性的方法，所述方法包括确定该个体是否具有如所述BIM(BCL2L11)多态性。这种耐药性可以是c-KIT/PDGFR再激活非依赖性的。这种胃肠道间质肿瘤(GIST)可以包括与c-KIT/PDGFR激活相关或由其引起的胃肠道间质肿瘤(GIST)，如c-KIT/PDGFR驱动型胃肠道间质肿瘤(GIST)。

我们又公开了一种预测患有骨髓增生病的个体是否可能对激酶抑制剂治疗形成耐药性的方法，所述方法包括确定该个体是否具有所述BIM(BCL2L11)多态性。这种耐药性可以是JAK2再激活非依赖性的。这种骨髓增生病可以包括JAK2激活相关或由其引起的骨髓增生病，如JAK2驱动型骨髓增生病。

我们公开了一种方法，包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物的存在，例如通过使用包含SEQ ID NO:3中所述核苷酸序列和SEQ ID NO:4中所述核苷酸序列的引物集合，其中如果测定该个体具有BIM(BCL2L11)多态性，则所述个体可能对用激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌(NSCLC)形成耐药性。

我们进一步公开了这样一种方法，其中如果确定该个体具有BIM(BCL2L11)多态性，则所述个体可能对用激酶抑制剂治疗胃肠道间质肿瘤(GIST)形成抵抗。

我们还公开了这样一种方法，其中如果确定该个体具BIM(BCL2L11)多态性，则所述个体可能对用激酶抑制剂治疗骨髓增生病形成耐药性。

相反，如果确定该个体不具BIM(BCL2L11)多态性(例如，如果检测到存在包含SEQ ID NO:2中所述序列的核酸扩增产物)，则所述个体较不可能对用激酶抑制剂治疗非小细胞肺癌(NSCLC)形成耐药性。

类似地，在这种方法中，如果确定该个体不具有BIM(BCL2L11)多态性，则所述个体较不可能对用激酶抑制剂治疗胃肠道间质肿瘤(GIST)形成耐药性。

另外，在这种方法中，如果确定该个体不具有BIM(BCL2L11)多态性，则所述个体较不可能对用激酶抑制剂治疗骨髓增生病形成耐药性。

我们描述了一种确定特定疗法在患有非小细胞肺癌(NSCLC)或胃肠道间质肿瘤(GIST)或骨髓增生病或以上疾病任意组合的个体上取得成功的可能性的方法，所述方法包括将所述疗法与通过上述方法确定的疗法比较。

我们还描述了一种在个体中诊断激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括在个体中检测上文所述的BIM(BCL2L11)多态性的存在。我们还描述了一种在个体中诊断激酶抑制剂耐药的胃肠道间质肿瘤(GIST)的方法，所述方法包括在个体中检测上文所述BIM(BCL2L11)多态性的存在。我们描述了一种在个体中诊断激酶抑制剂耐药的骨髓增生病的方法，所述方法包括在个体中检测上文所述的BIM(BCL2L11)多态性的存在。

我们还提供了用于治疗患有非小细胞肺癌(NSCLC)和/或胃肠道间质肿瘤(GIST)和/或骨髓增生病的患者的方法，所述方法包括通过上文描述的方确定所述癌症是否为激酶耐药性癌症并治疗该患者。

实施例

实施例1.筛查Bim-α1中存在缺失的实验

用于DNA提取的标准操作方案/试剂盒

用于从血液提取DNA的Qiagen血液及细胞培养物DNA微量试剂盒(目录编号13343)(详见QIAGEN_Genomic_DNA_Handbook.pdf)。

或

用于从口颊拭子提取DNA的MasterAmp^TM颊拭子DNA提取试剂盒。

也可以使用Qiagen Allprep DNA/RNA微量试剂盒(目录编号No80204)。Qiagen Inc,Valencia，加利福尼亚州，美国。

实施例2.使用基因组DNA检测Bim缺失的PCR实验

PCR程序

步骤1：96℃持续30秒

步骤2：94℃持续15秒

步骤3：64℃持续30秒

步骤4：68℃持续5分钟

步骤5：重复步骤2-4x11

步骤6：94℃C持续15秒

步骤7：60℃持续30秒

步骤8：68℃持续5分钟

步骤9：重复步骤6-8x17

步骤10：68℃持续20分钟

16℃一直持续

引物

Bim_del_F AATACCACAGAGGCCCACAG(+chr2:111,599,051..111,599,070)Bim_del_R GCCTGAAGGTGCTGAGAAAG(-chr2:111,603,257..111,603,276)

PCR产物在含有溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶上电泳，并且在UV屏上使无缺失的4,226b、缺失的1,323bp大小的产物可视化。

实施例3.材料与方法：患者和样品

根据IRB批准的方案，从新加坡中央医院和马来亚大学观察到的患者取得临床样品。

通过Ficoll离心分离单核细胞，并且根据制造商的说明书，使用AllPrepDNA/RNA微量试剂盒(Qiagen)提取DNA/RNA。

实施例4.材料与方法：DNA-PET分析和验证

将基因组DNA经液压剪切成5、7和9Kb片段用于构建测序文库，并且使用大规模平行SOLiD测序仪测序(见下表E1和以下描述)。

表E1：SOLiD平台上大规模平行PET的统计结果

¹⁾非冗余

²⁾一致PET

³⁾物理覆盖率

⁴⁾不一致PET

⁵⁾基于计算机聚类大小概率的过滤聚类

如图9中所示，构建了配对末端(Applied Biosystems术语：接合配对)文库。简言之，使用EcoP15I生成2x25bp双标签构建体，其对应于5-9KbDNA片段的末端。根据制造商的推荐在SOLiD测序仪上(AppliedBiosystems)进行2x25bp文库的高通量测序。使用允许每个标签具有2个颜色编码错配的SOLiD System Analysis Pipeline工具CoronaLite(AppliedBiosystems)，将序列标签相对于人类参考序列(NCBI Build36，hg18)定位和配对。处于文库插入分布内部的配对末端标签(PET)划归为一致PET(cPET)。被PET标准拒绝的PET划归为不一致PET(dPET)。将这些构建体进一步分成5个不同分类：(i)两个标签定位在不同染色体上，(ii)两个标签定位在相同染色体上，但是定位在不同链上，(iii)两个标签定位在相同染色体上，但是排序错误(5′在3′下游)，(iv)两个标签定位在相同染色体、相同链上，正确排序，但是间隔距离大于1.1x最大文库尺寸，(v)两个标签定位在相同染色体、相同链上，正确排序，但是间隔距离小于最小文库尺寸。分类(v)已经从进一步分析排除。将其序列标签定位在相同基因组区域10Kb范围内的两侧的dPET聚类在一起。根据最外标签坐标，将第一标签左侧和右侧的10Kb检索窗延长至10Kb。将左侧标签(5′)和右侧标签(3′)定位的区域称作锚定区(anchorregion)。保留大小为3和更高的聚类用于SV鉴定。如果5′定位锚定区远离3′定位锚定区，则单个dPET聚类可鉴定具有一个重排点(如缺失)的SV，如果定位顺序是3′至5而非正常的5′至3′，则可鉴定串联重复，如果定位取向反转(在不同的链上)，则可鉴定非配对的倒位，如果5′和3′锚定定位于不同染色体，则可鉴定孤立(isolated)的染色体间易位。如图10中所述，两个紧密定位的PET聚类可用来推导具有两个重排点如倒位、插入和均衡易位的SV。

基于两侧均延长10Kb的5′和3′锚定区的重叠，进行不同基因组的聚类比较。如果第二文库的聚类的5′锚定区与第一文库的聚类的5′延长锚定区重叠，并且3′锚定区也是如此，则将这两个聚类归并成组，并且根据最外起始和终止锚定区坐标调节锚定区的10Kb延长。基因注释基于使用文库特异性断点，2009年5月14日从UCSC(http://genome.ucsc.edu/；Rhead等人,2010)下载的RefSeq Genes。基于32为正常个体的SV和如本文献中他处所述的DNA-PET质量标准描述，过滤所鉴定的SV。

一些基因座显示PET聚类积累。在这些基因座处，可能误导致将特定SV分配至dPET聚类(例如，如果串联重复的断点被缺失和/或易位包围，则可能不会将这种重排解读为串联重复)。因此，建立了基于断点的互联网络以便将复杂区域内的断点与分离的、较不复杂的SV分开。为确定断点的相邻区域，将每个dPET聚类锚定区的起点和终点延长相应基因组文库的最大插入尺寸，作为检索窗。如果相邻聚类的窗彼此重叠，则将这些dPET聚类归并成一个超聚类。这种方法允许聚类A经聚类B与聚类C间接关联。可以联合成一个超聚类的dPET聚类的数目由所述超聚类的大小表示。在大于3个dPET聚类互联的情况下，将断点对划归为‘复杂′(染色体内和染色体间)。

荧光原位杂交(FISH)如下进行。通过用0.75M KC在37°C处理细胞20分钟，收获细胞核。然后，在少许固定后，将细胞核滴加在用于FISH的载玻片上。将EVI1探针(克隆RP11-137H17)以绿色标记，并且将插入物chr8:127,950,637至130,664,919(分别为克隆RP11-828L6和RP11-159N7)分别以红色和黄色标记。为制备fosmid探针，在生物素-16-dUTP存在的情况下使用Nick翻译系统(Invitrogen)，通过切刻翻译标记DNA。在1μg/μl的Cot1DNA存在下，将DNA粘粒克隆以5ng/μl浓度重悬于杂交缓冲液中(2SSC，10%硫酸葡聚糖，1XPBS，50%甲酰胺)。在杂交之前，将细胞核载玻片用0.01%胃蛋白酶在37°C处理5分钟，随后1XPBS洗涤，1%甲醛处理10分钟，1XPBS洗涤(5分钟)和经乙醇系列液(70%、80%和100%)脱水。将变性的探针施加至这些预处理的载玻片并且在75°C共变性5分钟并在37°C杂交过夜。在45°C于2SSC/50%甲酰胺中进行两次杂交后洗涤，每次7分钟，然后是在45°C于2SSC中洗涤2次，每次7分钟。在封闭后，载玻片用抗生物素蛋白缀合的异硫氰酸荧光素(FITC)(Vector Laboratories)显现。在洗涤后，将载玻片用封装Vectashield并且在落射荧光显微镜下观察。使用Metasystem软件进行图像分析。

为验证所预测的SV，使用分布于所预测的断点旁侧的PCR引物扩增重排区域，用于后续的Sanger测序。

对于实时PCR实验，使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)，根据制造商说明书提取总细胞RNA。使用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen)逆转录RNA，并且使用iQ5多色实时检测系统(Bio-Rad)定量评估25ul总反应体积时。引物在59℃退火20秒，扩增子在72℃延长30秒。定量的循环总数是40。使用β-肌动蛋白或BIM外显子2A的转录水平使样品之间归一化。所使用的引物如下：BIM外显子2A(正向：ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG；反向：GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT)，BIM外显子3(正向：CAATGGTAGTCATCCTAGAGG；反向：GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG)，BIM外显子4(正向：TTCCATGAGGCAGGCTGAAC；反向：CCTCCTTGCATAGTAAGCGTT)，β-肌动蛋白(正向：GGACTTCGAGCAAGAGATGG；反向：AGCACTGTGTTGGCGTACAG)和EVI1(正向：ACCCACTCCTTTCTTTATGGACC；反向：TGATCAGGCAGTTGGAATTGTG)。

实施例5.材料与方法：细胞系和组织培养

CML系从ATCC(MEG-01和KU812)、JCRB(NCO2)和DSMZ(KCL22、K562、KYO1、JK1、BV173和NALM1)获得。细胞在补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培育，在增湿培养箱中于37°C伴以5%CO₂下孵育。

实施例6.结果：CML患者样品

我们选择了4个费城(Ph)染色体阳性CML患者样品和一个CML细胞系用于DNA-PET分析(图2A)。

这些样品代表了临床上显示酪氨酸激酶抑制剂敏感性或耐药性的患者，并且各自包括处于慢性期和髓样急变期的两位患者。慢性期患者中的一位和两位急变期患者均对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性，而急变期样品之一除Ph染色体之外还显示额外核型异常。

我们还包括K562CML细胞系和来自治疗敏感性患者的缓解样品，分别作为Ph染色体的阳性对照和阴性对照。

实施例7.结果：CML基因组的DNA-PET分析

我们生成了源自大于2.78亿个非冗余PET的72.1Gb可定位DNA序列并且平均实现每个基因组109倍的物理(片段)覆盖(上表E1)。85.4%的PET相对于参考基因组一致地定位，而14.6%的PET并非如此。将后者划归为不一致PET(dPET)。连接相同两个基因组区域的多个dPET的聚类使我们鉴定出3,408个不同的结构性变异(SV)，并且限定每种dPET的SV的类型(见下文图10、表E2和表E3)。

表E2.5份患者样品和K562中由DNA-PET预测的SV

¹⁾因衍生性染色体9的缺失而存在BCR-ABL1易位，但不存在关联ABL1-BCR。

²⁾因衍生性染色体9的丢失和/或复杂重排而存在BCR-ABL1易位，但不存在关联ABL1-BCR。

表E3.过滤5份患者样品和K562中由DNA-PET预测的SV

1)SV统计结果由dPET聚类(倒位、插入和均衡易位由两个dPET聚类/事件组成)的数目反映

2)不同基因组中的相同SV计数一次。

3)在通过DNA-PET过滤数据后，22位正常个体的23个正常文库的信息和正常样品的已发表的配对末端测序数据(Kidd等人,2006；Korbel等人,2007)。

4)过滤以下dPET聚类，其具有大于100的超聚类大小或大于2000的BLAST得分，或BLAST比对EC型，或聚类大小为2(见方法)

表E4.在质量过滤后，5份患者样品和K562中由DNA-PET预测的CML特异性SV

¹⁾因衍生性染色体9的缺失而出现BCR-ABL易位，但不出现ABL1-BCR。

²⁾因衍生性染色体9的丢失和/或复杂重排而出现BCR-ABL易位，但不出现ABL1-BCR。

为了排除正常群体中存在的额外SV以及降低假阳性比例，SV进一步通过获自32位正常的不相关个体的额外DNA-PET数据以及通过生物信息学定义的以下质量标准过滤。如果出现以下情况，则排除聚类：(i)它们与100或更多个其他聚类互联，由大于100的超聚类大小所示；(ii)它们在两个连接的断点区域之间具有高度序列相似性，由两个锚定区(包括它们朝所述断点延长15Kb)之间大于2000的BLAST得分所示；(iii)它们显示两个锚定区/延长区之间大于300的BLAST得分，其中所述序列相似性在一侧位于锚定区内并且在另一侧位于延长区内部(EC类型)，(iv)它们的聚类大小为2。这产生459个CML特异性SV(表E3和表E4)以及拷贝数信息(图7)，并且使我们为每个基因组生成一个核基因组图(图2B)。

重要地，使用DNA-PET，我们能够鉴定除缓解样品之外的全部样品中的BCR-ABL易位。这个数据集然后用来鉴定以疾病或耐药性标记的SV。

实施例8.结果：急性变化的DNA-PET分析

认为急变期发现的额外染色体异常和分子畸变归因于临床行为。然而，综合评估这些事件的次数或结构本质颇具技术难度，尤其对于检测呈拷贝数中性的SV而言。因此，我们的注意力转向分析急变期形成时出现的SV。这里，如表E4中所述，我们发现急变期中SV的数目不断增加，这与核型分析和FISH分析良好相关(表E7、图3D和图11)。我们然后将SV的性质归类，并且发现在两位急变期患者中，缺失是最优势的SV类别(P098和P022，n=81[占全部SV的58.7%])，随后是非配对倒位(n=24[17.4%])、孤立易位(isolated translocation)(n=12[8.7%])和串联重复(n=9[6.5%]),其他SV类别每种均小于5%(图2A)。如预期，与急变期患者样品相比，急变期细胞系K562显示更多重排(分别是237对63和75)。在K562中，串联重复是最优势的类别(n=104[43.9%])，随后是缺失(n=71[30%])、非配对倒位(n=26[11%])和复杂的染色体内重排(n=14[5.9%])。有趣地，除BCR-ABL1之外，在两份急变期样品和K562细胞系中没有观察到均衡易位。

表E7通过DNA-PET验证细胞遗传核型

我们接下来通过用下载自UCSC基因组生物信息学主页(http://genome.ucsc.edu/)的RefSeq基因关联急变期特异性SV，探索哪种单独的体细胞SV可能在生物学上有助于急变期(Rhead等人,2010)，并且鉴定到据预测直接影响基因功能的205个候选SV。在该组内部，我们观察到BCR-ABL1自身的扩增，这由于dPET聚类大小的增加而可预期，并且是认可的转化特征(图12)^6,10。我们还观察到代表关联ABL1-BCR易位(reciprocalABL1-BCR translocation)的聚类大小和阶段之间的反相关性(图12)。注意到，DNA-PET检测到样品P098中ABL1-BCR完全丢失，这与FISH法检测到的der9中缺失一致(图12)。我们鉴定出的另一个候选物是插入染色体3上MECOM的内含子1中的染色体8的2.7Mb插入物(先前称作EVI1和MDS1)(图3A)，我们通过FISH法验证这一点(图3C)。EVI-1是一种锌指转录因子并且在正常造血干细胞(HSC)的增殖和维持中发挥重要作用^11-13，并且在HSC中过量表达时导致骨髓过度增生和髓样分化阻断。就我们所知，未曾报道过在EVI1内部或上游的相当插入，并且分析插入位点表明，染色体8的所述插入物可能改变较短转录物的转录水平，我们通过RT-PCR验证了这一点(图3B)。

总之，我们的DNA-PET分析已经能够鉴定急变期进展的已特征和新特征，并且提供了对人癌症模型中出现的结构变化的数目和性质的首份评估。

实施例9.结果：伊马替尼耐药性样品中的东亚人BIM多态性

我们接下来研究了耐药性相关的SV，并且发现在全部三份耐药样品中出现的两种缺失和在至少三分之二耐药样品中出现的六种SV。一种缺失，大小2.5Kb，位于ZNF385D(仍没有与CML关联的基因)的内含子1中。有趣地，在全部三份耐药样品中观察到的另一种缺失位于促凋亡基因BCL2L11(也称作BOD、BIML、BIMEL或BIM)的内含子2中(图4A)。重要地，其他人已经报道，伊马替尼对BIM的上调是该药物诱导凋亡所需要的，因为阻止BIM上调造成CML对伊马替尼产生耐药^14-16。我们通过PCR和测序证实了这种缺失，并且在全部3份样品中找到了相同的2,903bp缺失(图4C和图4D)，表明这种缺失是种系性的并因此构成一种多态性。因此，我们筛查了来自国际HapMap计划的74份正常东亚人样品¹⁷，并且测定BIM缺失携带者的频率是17.6%(12个杂合个体和1个纯合个体；等位基因频率9.5%)。虽然这种BIM缺失经证明是结构多态性，而非复发性体细胞事件，但是我们对以下事实感到迷惑：全部三位耐药患者均是所述BIM(伊马替尼敏感性所需要的基因)缺失的携带者^14-16。

实施例10.结果：BIM多态性的功能效应

分析BIM基因结构表明，这种缺失可能导致外显子3和4以相互不容方式的可选剪接。提示具有这种可能性的是，该缺失靠近(107bp)外显子3的内含子-外显子交界的5′末端，并且外显子3自身内部存在终止密码子(图5A)。为检验这种假设，我们获得了带有(n=12)和不带有(n=11)这种缺失的原发CML样品，并且测量了含有外显子3的转录物和含有外显子4的转录物以及含有外显子2的转录物的表达水平，作为BIM总体转录的读数(因为外显子2在全部BIM同工型中均存在)¹⁸。如图5B中所示，我们发现这种缺失与含有外显子3的转录物增加以及含有外显子4的转录物的减少相关，而BIM总体转录不受影响。这些结果在来自正常个体的淋巴母细胞样细胞系中反映，表明这种缺失的影响是非谱系依赖性的(图13)。

因为BIM的促凋亡性能位于仅在外显子4中存在的BH3结构域内(图5A)^18,19，我们的问题是含有外显子4的转录物的下降是否可能与伊马替尼耐药性相关。幸运地，我们能够鉴定到一个携带这种缺失的CML细胞系KCL22，并且使用这些细胞解决了这个问题(图5C)。值得注意地，这种细胞系最初从一位日本患者获得并且与多数其他CML系相反，从开始就显示伊马替尼耐药性^20-22。我们证实了这种细胞表现出增加的外显子3/外显子4转录物比率(图5D)并且这与和不带这种缺失的细胞系相比，伊马替尼暴露之前和之后KCL22细胞系中含有外显子4的主要BIM同工型BIMEL的蛋白质表达减少相关(图5E)。我们还证实了KCL22细胞对伊马替尼以及更强力的第二代酪氨酸激酶抑制剂产生耐药(图5F)。

这些结果导致我们产生疑问：处于早期临床试验的BH3模拟物²³是否可能使KCL22细胞对伊马替尼敏感。如图5G中所示，我们发现这的确如此，并且伊马替尼或达沙替尼(dasatinib)和ABT-737的组合发挥协同作用以在KCL22细胞中诱导凋亡，而不在KYO-1细胞中诱导凋亡。

实施例11.结果：BIM多态性与慢性髓性白血病中的BCR-ABL非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性

我们接下来测定了这种多态性在较大的东亚人CML患者队列中的频率，并且发现它以12%存在(19/158)。我们还检验了这种多态性可预测临床耐药性的假设。在这个分析中，以KCL22细胞为例，我们推理这种多态性的存在可能足以赋予酪氨酸激酶抑制剂耐药性，而在其不存在的情况下，耐药性则需要携带赋予耐药性的BCR-ABL突变的克隆出现²⁴。

因此，我们将来自具有耐药性的全部患者的样品划分成具有或不具有BCR-ABL突变的组，并且发现在这两个组之间这种多态性的频率具有显著差异：2/42(4.8%)具有BCR-ABL突变而13/55(23.6%)不具有这种突变(p=0.01)(图6A)。

当我们在BCR-ABL突变不存在的情况下患有敏感性疾病与患有耐药性疾病的患者中测定这种多态性的频率时，差异也是显著的：伊马替尼敏感性患者中频率为4/61，而伊马替尼耐药性患者中频率为13/55(p=0.02)(图6B)。然而，在伊马替尼敏感性患者(4/61)和全部伊马替尼耐药性患者(15/97)之间不存在这种多态性的显著差异(p=0.13)(图6C)。

鉴于本文的统计显著性将取决于总体CML群体中BIM多态性的频率，这个结果是可能预期的。

实施例12.讨论

我们报道一种在BIM基因的内含子2中的新型多态性，这种多态性与体外和体内的临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性均相关。正常东亚人群体中的缺失携带者频率是17.6%，在两个东南亚人转诊中心处观察到的CML患者中是12.0%。在这个队列中，这种多态性占BCR-ABL突变不存在下耐药病例的四分之一(13/55或23.6%)。考虑到世界范围的CML事件中缺少地理变异²⁵，我们认为不太可能是病因学作用。

我们还证明，这种多态性的存在导致BIM基因的含有外显子3的转录物相比于含有外显子4的转录物的表达增加，并且找到了临床耐药性形成和这种多态性存在之间的显著相关性，具有这种缺失的个体形成耐药性的相对风险是没有这种缺失的个体的1.34倍(杂合基因型相对风险；95%置信区间0.94-1.59)。此外，通过确定耐药性与BCR-ABL抑制作用无关，我们能够预测，与不具有这种缺失的患者相比，具这种缺失的耐药性患者在BCR-ABL中携带具有赋予耐药性的突变的CML克隆的可能性较低。这项研究结果与这类克隆仅在疗法的选择性压力下并在其他致耐药机制不存在时出现的理论一致²⁴。

一旦耐药性形成，则当前的临床指南或者倡导增加酪氨酸激酶抑制剂剂量或换用更强力的酪氨酸激酶抑制剂⁵。因此，值得关注的是，在具有BIM多态性相关性耐药并且遵循这些指南且后续数据可获得的4位患者中，无人产生应答。尽管无根据，但这个观察结果与我们的研究结果，即BIM缺失相关性耐药是BCR-ABL非依赖性的相一致。然而，我们的体外观察结果还表明，这种环境下的耐药性可以通过酪氨酸激酶抑制剂与BH3模拟物组合予以克服。因此，所述BIM多态性可以用作酪氨酸激酶抑制剂耐药性和BH3模拟物应答的预测物。这种多态性的筛查可以因此用于东亚CML患者的管理中。我们的研究结果适用于其中的药物敏感性依赖于BIM介导凋亡的其他癌症，这为其研究提供了保障^26-28。

实施例13和14.BIM多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)中的EGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性

先前已经证明，突变EGFR驱动型NSCLC需要BIM表达以便TKI能够杀死NSCLC细胞系(Cragg等人,PLOS Medicine,2007；Costa等人,PLOSMedicine,2007)。

因此，我们预测携带BIM多态性的细胞系并且扩展到携带BIM多态性的患者，将耐受靶向突变EGFR的药物。

此外，我们预测耐药细胞系将对BH3模拟物药物(例如ABT-737和ABT-263)和抗EGFR药物的组合敏感。

实施例13.BIM多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)中的EGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性-体外相关性

将鉴定在EGFR中具有激活性突变的NSCLC细胞系。

然后将通过如先前所描述的PCR分析，分析细胞系中BIM多态性的存在与否。

将使用用于细胞生长、增殖和凋亡的标准细胞测定法测定各种细胞系针对抗EGFR药物的敏感性和/或耐药性。

还将测试细胞系对作为单一药物或与靶向EGFR的药物组合时的BH3模拟物的敏感性。

然后将这种多态性的存在与否与NSCLC细胞系对正在测试的药物的敏感程度关联。

我们期望在BIM多态性的存在和耐药性之间将存在正相关。

具体而言，我们预测携带BIM多态性的在EGFR中具有激活性突变的NSCLC细胞系将比不携带BIM多态性的细胞系更耐受抗EGFR药物。

另外，我们期望具有BIM多态性并耐受靶向EGFR的药物的细胞系将对BH3模拟物药物(例如ABT-737和ABT-263)和抗EGFR药物的组合敏感。

实施例14.BIM多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)中的EGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性-患者相关性

将鉴定在EGFR中具有激活性突变的NSCLC患者。

将通过如先前所描述的PCR分析，分析来自患者和/或其肿瘤的DNA中BIM多态性的存在与否。

使用临床标准确定患者对于抗EGFR疗法的反应。这些数据将包括临床参数如肿瘤大小、进展时间、无进展生存期、总生存期和体能状态。

然后将这种多态性的存在与否上文提到的临床参数关联。

我们期望与不具有这种多态性的患者相比，在BIM多态性的存在和抗EGFR疗法的低劣反应之间将存在正相关。这通过肿瘤尺寸未能缩减而看出。

此外，这类患者可以具有较短的进展时间、无进展生存期、和/或总生存期。

实施例15和16.BIM多态性与胃肠道间质肿瘤(GIST)中c-KIT/PDGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性-体外相关性

先前已经证明，c-KIT/PDGFR驱动型GIST需要BIM表达以便TKI能够杀死GIST细胞系(Gordon等人,JBC,2010)。

因此，我们预测携带BIM多态性的细胞系并且扩展到携带BIM多态性的患者，将对靶向突变c-KIT的药物产生耐药性。

此外，我们还预测耐药细胞系将对BH3模拟物药物(例如ABT-737和ABT-263)和抗c-KIT药物的组合敏感。

实施例15.BIM多态性与胃肠道间质肿瘤(GIST)中c-KIT/PDGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性-体外相关性

将鉴定在c-KIT中具有激活性突变的c-KIT驱动型GIST细胞系。

然后将通过如先前所描述的PCR分析，分析细胞系中BIM多态性的存在与否。

将使用用于细胞生长、增殖和凋亡的标准细胞测定法确定各种细胞系针对抗c-KIT药物的敏感性和/或耐药性。

还将测试细胞系对作为单一药物或与靶向c-KIT的药物组合时的BH3模拟物的敏感性。

然后将这种多态性的存在与否与GIST细胞系对正在测试的药物的敏感程度关联。

我们期望在BIM多态性的存在和耐药性之间将存在正相关。

具体而言，我们预测携带BIM多态性的在c-KIT中具有激活性突变的GIST细胞系将比不携带BIM多态性的细胞系更耐受抗c-KIT药物。

另外，我们还预测具有BIM多态性并耐受靶向c-KIT的药物的细胞系将将对BH3模拟物药物(例如ABT-737和ABT-263)和抗c-KIT药物的组合敏感。

实施例16．BIM多态性与胃肠道间质肿瘤(GIST)中c-KIT/PDGFR非依赖性临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性的相关性-患者相关性

将鉴定在c-KIT中具有激活性突变的GIST患者。

将通过如先前所描述的PCR分析，分析来自患者和/或其肿瘤的DNA中BIM多态性的存在与否。

使用标准临床标准确定患者对于抗c-KIT疗法的反应。这些数据将包括临床参数如肿瘤大小、进展时间(time to progression)、无进展生存期、总生存期和体能状态。

然后将这种多态性的存在与否与上文提到的临床参数关联。

我们预期与不具有这种多态性的患者相比，在BIM多态性的存在和抗c-KIT疗法的低劣反应之间将存在正相关。这可以通过肿瘤尺寸未能缩减而观察。此外，这类患者可以具有较短的进展时间、无进展生存期、和/或总生存期。

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实施例H1至H8

实施例H1至H8证明，BIM基因中的常见缺失多态性有助于慢性髓性白血病中针对伊马替尼的内在耐药性。

实施例H1.材料与方法

伦理委员会批准

从新加坡中央医院、Akita大学医院、马来亚大学医学中心和新加坡国立大学癌症研究所观察到的患者取得临床CML样品。在波恩大学医院从血液供体获得德国人对照样品。马来人、中国人和印度人对照样品源自最近的本地群体研究^4,5。在参与机构处从获得为这项研究贡献样品的全部患者和正常个体的书面知情同意书和机构审查委员会批准。

序列标签定位

使用SOLiD系统分析Pipeline工具Corona Lite(Applied Biosystems)，在允许每个标签2色编码错配的颜色空间中，将配对的标签相对于参考序列(NCBI build 36)各自定位。将未解析位置(随机_chr)的参考序列与可选的MHC单倍型的重叠片段组(contigs)从用于定位的参考中排除。各自定位的标签由CoronaLite配对。在一个或两个标签具有多个定位位置的情况下，一种称作‘挽救′的方法有利于产生一致的PET(两种标签均在相同染色体、相同链中、处于相同取向、处于正确的5′→3′顺序并且彼此具有预期的距离)。

不一致PET(dPET)的聚类

配对末端双标签(PET)被归类为一致PET(cPET)，其中两种标签均定位于相同的染色体、相同的链、处于正确的5′至3′顺序并且处于预期跨距范围内。如Hillmer等人中所述，基于跨距分布的梯度确定这种跨距范围¹。由PET标准拒绝的PET划归为不一致PET(dPET)。为了聚类跨越相同融合点的不同dPET，应用以下方法：将给定dPET的5′标签和3′标签的定位位置在两个方向上延长各自基因组文库的最大插入物尺寸，产生5′窗和3′窗。如果第二dPET的5′标签和3′标签定位于第一dPET的5′窗和3′窗内部，将这两个PET定义为大小为2的聚类并且调整5′窗和3′窗，从而使它们含有第二dPET的标签延长区(最大文库尺寸)。随后，用其5′和3′标签分别定为于5′窗和3′窗内部的dPET被分配至这个聚类，并且如果需要，调节所述窗。在融合点周围簇集在一起的dPET的数目由聚类大小代表。由聚类的5′标签覆盖的基因组区域定义为5′锚定区并且由聚类的3′标签覆盖的基因组区域定义为3′锚定区。具有小于500bp锚定区的dPET聚类排除在进一步分析之外。

稍早已经描述了K562的DNA-PET测序¹。相同的K562dPET聚类已经用于本研究中，但是未排除着丝粒区(与在先前研究中进行的相同)，排除具有小于500bp锚定区的dPET聚类(先前小于1000bp)，并且应用了新的排除/过滤方法(见下文)。

低置信度聚类的排除

我们使用一系列统计检验将低置信度聚类排除在进一步分析之外。这些检验确定了可能从嵌合序列构建体或局部插入物大小变异中产生的PET聚类的文库特异性阈值。具体而言，由于显示短缺失的dPET聚类可以作为非均匀跨距分布的人工品(artifacts)出现，故我们对“延展”dPET(不一致仅因为末端相隔大于最大文库尺寸)在基因组上的分布(离散成最大文库尺寸的二进制(bin))使用二项模型，以估计最小聚类尺寸阈值，从而预期假阳性平均小于1(p-值通过基因组二进制的数目进行Bonferroni校正)。具体而言，将阈值(仅适用于其末端相隔比最大文库大小小两倍的聚类)计算为：

$\underset{k}{\min }b*f(k;\mathrm{nN},\frac{1}{b})<1$

其中N是延展的dPET的数目，b是二进制的数目并且f(k；n，p)是在k时针对n次独立试验的二项密度函数，成功概率p。

产生在文库制备中环化步骤的嵌合PET构建体预期分散遍及整个基因组并且因此较小可能形成dPET聚类。然而，归因于庞大序列容积，少数几个这类聚类的确出现，并且我们采用了与之前相似的二项模型以设定文库特异性最小聚类大小阈值(预期平均假阳性小于1)：

$\underset{k}{\min }{b}^2*f(k;D,\frac{1}{b^2})<1$

其中D是dPET的数目。注意，尽管延展dPET聚类可以由单个二进制定义(至第一近似值)，总体上，必需选择两个二进制定义PET聚类，并且这解释了以上等式中的二次因子。由于嵌合PET聚类较不可能出现，从而末端彼此紧邻，上述阈值不适用于其末端比以下靠近的聚类：

$\underset{t}{\min }\frac{G}{t}b{\left(t\right)}^{2}f(2;D,\frac{1}{b{\left(t\right)}^2})<1$

其中G是基因组的大小并且b(t)是大小为t的区域中二进制的数目。表H12中显示了由这种方法定义的聚类大小阈值。

超聚类

一些基因座显示PET聚类积累。在这些基因座处，可能误导的是，将特定SV分配至dPET聚类，并且我们建立了基于断点的互联网络(超聚类1)以便将复杂区域内的断点与孤立、较不复杂的SV分开。为确定断点的相邻区域，将每个dPET聚类锚定区的起点和终点延长各基因组文库的最大插入物尺寸，作为检索窗。如果相邻聚类的窗彼此重叠，则将这些dPET聚类归并成一个超聚类。这种方法允许聚类A经聚类B与聚类C间接关联。可以联合成一个超聚类的dPET聚类的数目由所述超聚类的大小表示。在大于3个dPET聚类互联的情况下，断点对划归为‘复杂′(染色体内和染色体间)。这种互联网络在排除低置信度聚类后(见上文)但是在DNA-PET数据存管(datacuration)(见下文)之前建立。

DNA-PET数据存管

原始DNA-PET数据预测到在六个CML样品中的3,408不同SV(表H4)。

我们基于以下质量标准过滤数据：i)我们比较成对慢性期/缓解样品(P145和P440)的PET聚类的聚类大小并将聚类分成两个组：a)在两份样品中均鉴定到的聚类和b)仅在二者之一样品中观察到的聚类。这种分级表明，大小为2至4的聚类富含人为假象(图24)。为了保守，我们从SV判定中排除了大小为2-5的全部dPET聚类。ii)定位人为假象可以在序列相似性高的区域之间产生dPET聚类。虽然一种称作SOLiD配对途径(pipeline)‘挽救′的方法通过有利于两个标签的一致配对而强烈地减少这类人为假象，但是区域之间的序列相似性仍可以产生人为假象。然而，排除序列相似性高的全部dPET聚类带来了问题，因为序列相似性可以通过非等位基因同源重组触发重排。为评价断点之间的序列相似性，我们将左锚定区和右锚定区朝断点延长15Kb并且通过BLAST程序(bl2seq)⁶比对这两个区域。两个区域的比对结果通常产生多重比对结果，其中我们使用得分最高的一个结果(表H6中定义为“Blast评分1”)。

在BLAST得分大于2,000的情况下，通常不可能设计特异性PCR引物用于验证，我们因此排除了具有这类高BLAST评分的dPET聚类。iii)具体而言，两个预测的配对断点的在一侧上的锚定区和另一侧上的锚定区延长之间的序列相似性指示定位人为假象(‘延长区-聚类’的EC比对类型)。这基于以下假设：锚定区标签相对于与之共有序列特征的另一个锚定区延长的的正确定位将产生cPET。我们排除BLAST评分大于300的dPET聚类和EC比对类型，iv)。一些基因组区域倾向于积累定位人为假象，并且我们排除了超聚类大小大于100的全部dPET聚类。我们仅在细胞系中观察到具有这类复杂性的真实重排，但是在临床样品中没有观察到¹(和未公开数据)。这种过滤方法在CML样品中产生1,349种不同的预测SV(表H4)。

交叉基因组比较

基于两侧上均延长10Kb的5′和3′锚定区的重叠，在不同基因组之间进行聚类比较。如果第二文库的聚类的5′锚定区与第一文库的聚类的5′延长锚定区重叠，并且3′锚定区也是如此，则将这两个聚类归并成组并且根据最外起始和终止锚定区坐标，调节锚定区的10Kb延长区。使用断点位置将鉴定的SV与基于无癌个体的配对末端测序研究的公开SV进行比较^7,8。通过相对于较大事件的重叠百分比，计算与已公开SV重叠的预测SV的部分。基因注释基于2009年5月14日从UCSC(http://genome.ucsc.edu/；9)下载的RefSeq基因。

在交叉基因组比较中包括21位正常个体的DNA-PET数据，所述21位正常个体由9位中国人、6位欧洲人、3位非洲人、2位墨西哥人和1位印度人(22个文库，未公开数据)组成。将匹配这21份正常样品中一个或多个样品的SV的CML患者的全部SV划归为种系SV并且排除在进一步分析之外。此外，将与已经通过配对末端测序方案在10位无癌个体中鉴定的SV重叠80%或更多的SV划归为种系SV并予以排除，其中所述10位无癌个体包括5位非洲人、3位欧洲人、1位日本人和1位中国人^7,8。这种使用31份正常样品的‘种系过滤方法’在CML样品中产生309种不同的预测SV(表H4至H6)。为了在CML基因组中验证预测的SV，利用分布于预测断点旁侧的PCR引物来扩增重排区域，用于后续续Sanger测序。

急变期重排的表征

转变成急变期方面的一致分子研究结果是，BCR-ABL蛋白质本身的水平增加^3,10,11。这因几种机制出现，包括BCR-ABL基因扩增和Ph染色体重复^3,10,11。因此，我们能够检测到与两份慢性期样品(P145和P308)相比，急变期样品(P022、P098、K562)中BCR-ABL的DNA-PET信号增加，我们将这种增加与FISH关联(图19B和图19C)。我们还观察到，代表关联ABL-BCR易位的DNA-PET信号和分期之间的反相关性(图19B)。描述了der9上ABL-BCR重排点的缺失¹²并且我们检测到急变期样品P098和K562中ABL-BCR完全丢失，提示了这种反相关性(图19B和19C)。

我们将急变期样品中潜在体细胞性SV的性质归类，并且发现在两位急变期患者中缺失是最优势的SV类别(P098和P022，n=79[占全部SV的79%])，随后是串联重复(n=6[6%])、孤立易位(n=5[5%])和小于5%的其他每种SV类别(表H5)。

表H5.5份患者样品和K562细胞系中由DNA-PET预测的CML-特异性SV¹⁾

¹⁾SV统计结果由dPET聚类(倒位、插入和均衡易位由两个dPET聚类/事件组成)的数目反映

²⁾由于衍生性染色体9的缺失，出现BCR-ABL易位但没有交联ABL-BCR。

³⁾由于衍生性染色体9的丢失或复杂重排，出现BCR-ABL易位因但没有ABL-BCR。

⁴⁾慢性期患者样品P145中的4个预测SV未在相同患者的缓解样品(P440)(不存在缓解)中预测到，并且在P440中预测到在P145内无DNA-PET指示的7个SV(不存在于慢性期)。在‘不存在于缓解’类别中，两个重排点是BCR-ABL和ABL-BCR，并且两个5Kb缺失已经在P440消失但是通过PCR在两种样品中均鉴定到。在‘不存在于慢性期’类别中，不能通过PCR证实缺失和孤立易位并且已经将其从列表中排除，5个剩余的差异性SV可以通过PCR在两种样品-慢性期样品和缓解样品中检测到，并且已经在慢性期样品中由DNA-PET而丢失。

如预期，与急变期患者样品相比，急变期细胞系K562显示更多重排(分别是153对40和60)。在K562中，缺失也是K562中的最优势的类别(n=70[46%])，随后是串联重复(n=39[25%])、非配对倒位(n=20[13%])、孤立易位(n=11[7%])和复杂染色体内重排(n=11[7%])。有趣地，除BCR-ABL之外，在两份急变期样品和K562细胞系中没有观察到均衡易位。

细胞系和细胞培养条件

CML系从ATCC(MEG-01和KU812)、日本研究用生物资源保藏中心(NCO2)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(KCL22、K562、KYO-1、JK1、BV173和NALM1)获得。将细胞在补充有青霉素/链霉素、谷氨酰胺和10%FBS的RPMI1640培养基中培育，并且在增湿培养箱中于37°C、5%CO₂孵育。

荧光原位杂交(FISH)

通过用0.75M KC在37°C处理细胞15分钟，收获细胞核。在固定后，将细胞核滴加在用于FISH的载玻片上。通过Vysis LSI(基因座特异性识别码)BCR/ABL1双融合物易位探针(Abbott Molecular)检测BCR-ABL融合物。LSI BCR探针用光谱绿(SpectrumGreen)标记，LSI ABL1探针用光谱橙(SpectrumOrange)标记。根据制造商的说明书，略加调整，使用LSI BCR/ABL1双色双融合物易位探针(Abbott Molecular)的FISH测定法在固定的细胞上进行。简而言之，载玻片在醇系列中脱水并且在75°C实施共变性3分钟，随后在37°C过夜杂交。使用荧光显微镜(Olympus BX60)在1000X放大率下进行FISH信号的评价。对于每种情况，对约200个间期细胞核评价信号图谱。

实时RT-PCR

使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)，根据制造商说明书提取总细胞RNA。RNA使用ingSuperscript III第一链合成系统(Invitrogen)逆转录，并且使用iQ5多色实时检测系统(Bio-Rad)以25μl总反应体积进行定量评估。引物在59℃退火20秒，扩增子在72℃延长30秒。定量的循环总数是40。使用β-肌动蛋白或BIM外显子2A的转录物水平使样品之间归一化。使用以下引物：BIM外显子2A(正向：ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG；反向：GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT)，BIM外显子3(正向：CAATGGTAGTCATCCTAGAGG；反向：GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG)，BIM外显子4(正向：TTCCATGAGGCAGGCTGAAC；反向：CCTCCTTGCATAGTAAGCGTT)和β-肌动蛋白(正向：GGACTTCGAGCAAGAGATGG；反向：AGCACTGTGTTGGCGTAC-AG)。

蛋白质印迹

使用针对人BIM、CrkL、pCrkL、胱天蛋白酶3、切割的胱天蛋白酶3、PARP(均来自Cell Signaling Technology)和β-肌动蛋白(Sigma)的抗体进行蛋白质印迹。用对兔(Sigma)或小鼠IgG(SantaCruz)特异的HRP缀合的第二抗体进行检测。使用Western Lightning化学发光试剂(Perkin Elmer)使膜可视化。

通过膜联蛋白V染色检测细胞死亡

根据制造商的说明书使用膜联蛋白V-FITC/7-AAD试剂盒(BeckmanCoulter)测量凋亡。简而言之，将处理和未处理的细胞在1X结合缓冲液中在室温用膜联蛋白V-FITC-和7-AAD染色15分钟，然后通过流式细胞术分析。

含有E3的BIM转录物的siRNA敲减

针对含有E3的BIM转录物的小干扰性RNA(siRNA)(BIMγsiRNA1：CCACCAUAGUCAAGAUACA；BIMγsiRNA2：CAGAACAACUCAACCACAA)和阴性对照siRNA(ON-TARGET加非靶向性siRNA#1)购自Dharmacon Inc.。在siRNA存在的情况下使用Nucleofector溶液V(Lonza)，对KCL22细胞进行核转染法。

筛查BIM中的缺失

我们使用从HapMap¹³主页(http://snp.cshl.org/)下载的Affymetrix基因组范围人类SNP阵列6.0强度数据来推断BIM中缺失多态性的拷贝数。两个基因分型的单核苷酸位置位于该缺失内部：SNP_A-4195083和CN_173550。使用与Korn和同事提出的算法相似的高斯(Gaussian)混合模型，将这两个标记的原始强度用来判定拷贝数变异事件¹⁴。使用这种方法，我们预测了拷贝数并且因而预测了这种缺失在欧洲人(n=60)、约鲁巴人(n=60)和中国人/日本人(n=90)来源的不相关HapMap样品中的存在与否。我们然后将我们拥有其DNA样品(n=74)的中国人/日本人中的这种缺失通过PCR进行基因分型，所述PCR使用引物Bim_del_FAATACCACAGAGGCCCACAG和Bim_del_RGCCTGAAGGTGCTGAGAAAG和JumpStart RedAccuTaq LADNA聚合酶(Sigma)，采用以下热循环条件：96℃30秒，(94℃15秒、64℃30秒、68℃5分钟)x12，(94℃15秒、60℃30秒、68℃5分钟)x18，68℃20分钟。在1%琼脂糖凝胶上分析带有缺失(1,323bp)和不带缺失(4,226bp)的所得PCR产物。我们使用基于PCR的基因型来改进欧洲人和约鲁巴人样品中基因型鉴定的单核苷酸强度临界值(single nucleotide intensity cutoffs)，并且仅使用经PCR证实的东亚人样品基因型用于频率评估。

为了进一步研究欧洲群体中这种缺失是否处于中度频率但是已经在HapMap样品中偶尔丢失，并且为了更精确地确定这种缺失在亚洲人种的频率，我们通过PCR测定法将595份德国人、600份马来人、608份中国人和605份印度人样品进行基因分型。

计算BIM缺失的促成分数

为计算东亚患者的治疗耐药性的群体促成分数，我们使用PAF=(f(OR-1))/(f(OR-1)+1)，其中f为患者当中缺失携带者的频率(f=0.135)，OR是抵抗TKI治疗的患者和对TKI治疗敏感的患者之间缺失携带者的比值比(OR=3.19)。

微型基因质粒构建

pI-12剪接构建体作为慷慨馈赠从Mariano Garcia-Blanco获得。使用标准克隆技术，构建两种其他微型构建体pI-12-WT和pI-12-MUT。简而言之，使用作为正向引物的5′-GCCGCTCGAGTCTCTCCATGTGGTGTTTG-3′和作为反向引物的5′-GCCGAAGCTTCCTCCTTGCATAGTAAGCGTT-3′，从KCL22基因组DNA扩增BIM外显子4连同外显子4上游的659bp序列。PCR产物用XhoI和HindIII消化并克隆入pI-12质粒中的XhoI和HindIII位点内。使用作为正向引物的5′-GCCGGATATCATGGAAGGAACTGACCTGGTG-3′和作为反向引物的5′-GCCGATCGATGTAGGAAACTGGGTGAATGGC-3′，从KCL22基因组DNA扩增BIM外显子3和具有和不具有缺失多态性的上游区域。获得大小为4500bp和1597bp的两种PCR产物并且将它们进行凝胶纯化，用EcoRV和ClaI消化并克隆至质粒中的EcoRV位点和ClaI位点，以获得不含缺失多态性的pI-12-WT构建体和含有缺失多态性的pI-12-MUT构建体。

用来基因组编辑BIM缺失多态性的锌指核酸酶(ZFN)

ZFN从Sigma-Aldrich CompoZr TM ZFN Technology(美国)定制。这种ZFN在距对应于缺失多态性的区域的5′末端下游551bp的位点处切割(图14B)。修复模板仅含有2个侧翼同源臂，但是不含有BIM缺失多态性区域(图16A)。通过PCR构建修复模板，所述PCR使用KCL22基因组DNA作为模板并使用以下引物：5′CATAAATACCACAGAGGCCCACAGC3′(这种正向引物位于BIM缺失多态性区域的5′末端上游619bp)、5′CCCTCGAAGACACCTCTATTGGGAGGC3′(这种反向引物位于BIM缺失多态性区域的3′末端下游743bp)。

我们分离了长1362bp的PCR产物并将其克隆至DNA载体pCR

-BluntII-TOPO(Invitrogen，美国)中。我们已经将修复模板测序并且证实获得了正确的序列。通过使用先前提到的操作方案，将修复模板和编码ZFN的质粒转染至K562细胞中¹⁵。开发了基于PCR的检测测定法以在转染的K562细胞群体当中检测具有BIM缺失多态性的克隆的存在。在基于PCR的测定法中所用的引物与修复模板外部发现的BIM内含子区域退火(图16A)。结果，这种测定法没有检测到修复模板(数据未显示)。所用引物的序列是：5′GGCCTTCAACCACTATCTCAGTGCAATGG3′(这种正向引物位于BIM缺失多态性区域的5′末端上游1507bp)、5′GGTTTCAGAGACAGAGCTGGGACTCC3′(这种反向引物位于BIM缺失多态性区域的3′末端下游767bp)。

通过稀释克隆法分离具有BIM缺失多态性的基因组编辑的K562克隆。将转染的K562细胞稀释至2.5个细胞/ml的密度。然后通过使用96孔板样式，将每个孔用200ul稀释的转染K562细胞接种。收获从每个孔成功扩增的克隆，并且使用Qiagen DNEasy试剂盒分离基因组DNA。

对基因组编辑的K562克隆的伊马替尼和ABT-737实验

将野生型和基因组编辑的K562克隆在补充有青霉素/链霉素、谷氨酰胺和20%FBS的RPMI1640培养基中培育，并且在增湿培养箱中于37℃、5%CO₂孵育。在6孔平板中，将1×10⁶个细胞以2×10⁵个细胞/ml的密度接种至每个孔中。与适宜药物孵育48小时后，收获细胞用于蛋白质印迹分析(图16)。

对于凋亡测定法，将4×10⁵个细胞以2×10⁵个细胞/ml的密度接种至12孔平板的每个孔中。通过使用细胞死亡检测ELISA(Roche)并遵循制造商说明书检测到凋亡细胞中存在单核小体和寡聚核小体。

表H1.用于DNA-PET分析的患者和CML细胞系(K562)的门诊病理学特征

¹⁾处于发作(P145)和处于缓解(P440)的相同个体。

²⁾46,XY,+8,t(9;22)(q34;q11.2),i(17)(q10)[cp2]/48,idem,+der(22)t(9;22)[7]/48,idem,+19[cp4]/48,idem,t(12;17)(p13;q11.2),+19[cp3]/49,idem,+8,+19[2]/46,XY[3]。

表H2.SOLiD平台上大规模平行PET的统计结果

¹⁾已经测序的25bp标签的数目

²⁾已经相对于人参考基因组(NCBI build36)定位的25bp标签的数目

³⁾已经在对定位的25bp标签配对后产生的配对末端标签(PET)的数目

⁴⁾非冗余PET；已经基于以下假定排除对两种配对标签均具有相同起点的PET：它们源自相同PCR产物(非独立性生物学信息)

⁵⁾一致PET

⁶⁾非冗余cPET(见4)

⁷⁾cPET的物理覆盖范围；跨过染色体位置的cPET连接的平均数目

⁸⁾非冗余不一致PET(见4)

⁹⁾在相同潜在重排点周围“低置信度聚类排除”合格的dPET的聚类

表H3.5份患者样品和K562细胞系中由DNA-PET预测的SV¹⁾

¹⁾SV统计结果由dPET聚类(倒位、插入和均衡易位由两个dPET聚类/事件组成)的数目反映

²⁾因衍生性染色体9的缺失而出现BCR-ABL易位，但不出现关联ABL-BCR。

³⁾因衍生性染色体9的丢失或复杂重排而出现BCR-ABL易位，但不出现关联ABL-BCR。

表H4. 5份患者样品和K562细胞系中由DNA-PET预测的SV的过滤

1)SV统计结果由dPET聚类(倒位、插入和均衡易位由两个dPET聚类/事件组成)的数目反映

2)不同基因组中的相同SV计为一次。

3)过滤以下dPET聚类，其具有大于100的超聚类大小或大于2000的BLAST得分，或BLAST比对EC型，或2-5的聚类大小(见上文)

4)在通过DNA-PET过滤后数据，21位正常个体的22个正常文库的信息和10份正常样品的已发表的配对末端测序数据7,8。

表H5. 5份患者样品和K562细胞系中由DNA-PET预测的CML-特异性SV¹⁾

¹⁾SV统计结果由dPET聚类(倒位、插入和均衡易位由两个dPET聚类/事件组成)的数目反映

²⁾因衍生性染色体9的缺失而出现BCR-ABL易位，但不出现ABL-BCR。

³⁾因衍生性染色体9的丢失或复杂重排而出现BCR-ABL易位，但不出现ABL-BCR。

⁴⁾慢性期患者样品P145中的4个预期SV未在相同患者的缓解样品(P440)(不存在于缓解)中预测到，并且在P440中预测到在P145内无DNA-PET指示的7个SV(不存在于慢性期)。在‘不存在于缓解’类别中，两个重排点是BCR-ABL和ABL-BCR，两个5Kb缺失已经在P440中消失但是通过PCR在两种样品中均鉴定到。在‘不存在于慢性期’类别中，通过PCR不能证实缺失和孤立易位并且已经将其从列表中排除，5个剩余的差异性SV均可以通过PCR在两种样品-慢性期样品和缓解样品中检测到，并且已经在慢性期样品中由DNA-PET而丢失。

表H7.PCR验证的重排点

¹⁾在两个断点处相同的序列的微同源性以粗体显示并且分配至左侧断点；两个基因组断点之间的插入序列以粗体和下划线指示。

表H8.早期慢性期中针对一线伊马替尼的总体反应的欧洲白血病网络(ELN)标准¹⁶

CHR=完整血液学反应，PCyR=部分细胞遗传学反应，CCyR=完全细胞遗传学反应，CCA=克隆性染色体异常。

表H9.BIM缺失多态性与基线特征的相关性。

新加坡人/马来西亚人队列

使用t-检验*、Wilcoxon秩和^和Fisher精确检验**对单个队列表实施BIM多态性和基线特征之间相关性的统计分析检验。对合并队列数据的对数回归分析显示，BIM多态性组(BIM、无BIM)之间平均年龄的显著差异(p=0.020)和队列之间的非显著差异(p=0.984)。BIM多态性和临床酪氨酸激酶抑制剂耐药性之间的相关性是统计显著的(p=0.022)。对于主要论文中的表1，由于两个队列中所示的组年龄差异的可比较幅度(大约7年)和新加坡人/马来西亚人队列中年龄差异接近统计显著性的事实(p=0.055)，认为调节年龄差异是适宜的。

表H10具有BIM缺失多态性的患者的临床特征

伊马替尼失败

伊马替尼次佳反应

伊马替尼最佳反应

缩写：IFN，干扰素；IM，伊马替尼；TKI，酪氨酸激酶抑制剂；ELN，欧洲白血病网络；CP，慢性期；AP，加速期；BC，原始细胞危象；H，高；L，低；UNK，未知；CHR，完全血液学反应；PCyR，部分细胞遗传学反应；CCyR，完全细胞遗传学反应；MMR，主要分子反应；CMR，完全分子反应。

表H11.在BCR-ABL激酶结构域突变不存在的情况下，BIM缺失多态性与伊马替尼耐药性的相关性

表1中的两个患者队列各自进一步分成三个组：耐药不伴有BCR-ABL突变(组I)，耐药伴有BCR-ABL突变(组II)和敏感(组III)。因此，使用对数回归分析这些数据。在新加坡人/马来西亚人和日本人队列之间不存在显著差异(p=0.31)，但是在各组之间存在显著差异，如Fisher精确检验所示(p=0.03)。比值比上的配对95%置信区间证明了在组I与组III之间、以及组I与组II和III之间的显著差异，但是在组I与组II(比值比=2.03，(95%CI为0.68-7.58)之间以及组II与组III之间(比值比=1.66，95%CI为0.41-5.89)不显示显著差异。比较组I与组III产生比值比3.37(95%CI为1.35-9.23)，并且比较组I与组II和III产比值比1.90((95%CI为2.08-4.35)。全部计算均使用SASV9.2进行¹⁷。

表H12.由‘低置信度聚类排除’限定的阈值

¹⁾(缺失)聚类的最小PET聚类大小，其中左侧锚定区起点距离右侧锚定区起点小于2X最大文库大小。

²⁾全部dPET聚类的最小dPET聚类大小，除了‘伸展至多达2X文库大小’并且处于‘近似阈值’范围内的那些之外。

³⁾如果两种锚定区均处于所示距离范围内(除‘伸展的PET’法则外)，则允许大小为2的dPET聚类。

通过上文所提及阈值的dPET聚类是超聚类的基础(见下文)。

表H13.膜联蛋白V染色法所测定的伊马替尼处理的KCL22、KYO-1和NCO2细胞系的IC50。

实施例H2.实施例H1的参考文献

以下是实施例H1的参考文献材料

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实施例H3.简介

患有慢性髓样白血病(CML)的大部分患者对BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗作出反应¹。然而，15-20%患者并不最佳地对TKI作出反应²，并且具有TKI耐药性。目前没有可靠生物标记用于预测针对替代疗法的临床耐药性或敏感性。这里，我们鉴定出了一种由BIM基因中2.9Kb缺失多态性介导的内在TKI耐药性的新机制。这种缺失使剪接作用偏离含有促死亡BH3结构域的BIM同工型，并损害TKI上调含有BH3的转录物的能力。这导致迟钝的凋亡反应和内在TKI耐药性(一种可能用BH3模拟药物克服的耐药性)。有趣地，这种多态性限于东亚个体(12.3%携带率)并且不存在于非洲人和高加索人种(0%)中。东亚CML患者(n=203)显示这种多态性的存在与低劣TKI反应之间的强相关性(p=0.02)。我们的结果显示，一种缺失多态性怎样可以影响针对TKI(一类具有经证明的对抗广泛类型激酶驱动型癌症的功效的药物)的临床反应。重要地，通过阐明这种多态性对BIM功能的影响，我们证明了BH3-模拟物可以克服这种形式的TKI耐药性。

BIM是仅含BH3域蛋白的家族成员，所述含BH3域蛋白通过对抗BCL2家族的促存活成员(BCL2、BCL-XL、MCL1和A1)或直接结合细胞死亡远端效应子BAX和BAK激活细胞死亡³。BCR-ABL1维持CML细胞的存活优势，这部分地通过抑制BIM转录以及借助ERK依赖性磷酸化将BIM蛋白引向蛋白酶体降解而实现^4-6。重要地，TKI通过上调BIM转录在CML细胞中诱导凋亡，同时阻止BIM表达足以引起体外TKI耐药性^4-6。临床TKI耐药性最常见地与BCR-ABL1的激酶结构域中获得的体细胞突变相关，所述体细胞突变降低TKI结合并抑制BCR-ABL1的能力⁷。然而，这类突变不能在如临床标准所定义的完全无反应或具有次佳TKI反应的大部分患者中找到²。另外，患者对TKI反应的可变性提出以下可能性：种系变体或多态性也有助于CML中的耐药性^2,8。

实施例H4.TKI敏感性CML中BIM基因的内含子2的结构性变体

为了鉴定CML中的新TKI耐药性机制，我们使用了配对末端双标签的大规模平行DNA测序^9,10(图14)以探查5份CML样品的基因组，所述CML样品从对TKI敏感或耐药的患者获得(表H1)。

我们在全部CML样品中但是没有在对照中鉴定到BCR-ABL1易位以及几种新结构性变异(SV)(图18和图19，和表H2至H7)。

在全部耐药性样品共有的SV中，一种SV尤其吸引我们的注意力，因为它出现在BIM基因的内含子2内(图14A)。这种SV包含相同的2,903bp缺失(图14A、图14B和图14C)，表明它是种系和多态性的。实际上，当筛查2465位正常个体时，我们发现这种缺失多态性在东亚个体中常出现(12.3-14.3%携带者频率)，但是在非洲人和欧洲群体中不存在(0%)(图14D)。

实施例H5.BIM基因的剪接

研究BIM基因结构表明，这种缺失多态性将导致外显子3和外显子4以互斥方式剪接，提示这种可能性的是所述缺失靠近(107bp)外显子3的内含子-外显子交界的5′末端，以及外显子3自身内部存在终止密码子和多聚腺苷化信号(图15A和图20)¹¹。为证实这种多态性对BIM表达的影响，我们构建了微型基因，以便在这种缺失存在或不存在下测量外显子3对外显子4剪接作用(图15B)¹²，并且发现这种缺失促进对外显子3剪接，超过对外显子4剪接至少5倍(图15C)。重要地，来自患者的原发性CML细胞显示相同现象，因为相对于含有外显子4的转录物，含有多态性的样品表达更高水平的含有外显子3的转录物，而总体BIM转录不受影响(图15D)。在从正常HapMap个体获得的淋巴母细胞样细胞系中观察到相似结果，这表明一种细胞系非依赖性效应(图23)。因为促凋亡性BH3结构域仅存在于外显子4中(图14A)，并且是BIM凋亡功能所需要的^13,14，我们的观察结果提出一种TKI耐药性新机制。在这个模型中，当TKI暴露时，相对于含有外显子4的转录物，含有多态性的CML细胞将有助于表达含有外显子3的转录物，减少含有BH3的BIM同工型的表达并且因此损害BH3结构域依赖性凋亡。为促进这些研究，我们鉴定了一个含有这种缺失的日本CML细胞系KCL22¹⁵(图15E)，并且证实与不含缺失的细胞相比，它们表现出增加的外显子3/外显子4转录物比率(图15F)。在TKI暴露后，KCL22细胞还证明了对含有外显子4的转录物的诱导降低(图15G)以及较低水平的BIMEL蛋白(一种含有BH3的主要BIM同工型)(图15H)¹⁶。与先前报道一致^15,17,18，KCL22细胞对伊马替尼耐药，尽管是有效的BCR-ABL抑制(图15H和表H13)，并且证明了暴露于伊马替尼时受损的凋亡性信号传导(图15I)。

KCL22细胞还对含有外显子4/BH3(但是不含外显子3)的BIM同工型的表达增加极度敏感(图21)，而siRNA介导的含有外显子3的转录物敲减并不使KCL22细胞对伊马替尼敏感(图22)，这表明可能通过添加BH3模拟物药物恢复受损的伊马替尼诱导性凋亡¹⁹。如图14J中所示，我们发现这的确如此。

实施例H6.基因打靶以再现缺失多态性

我们接下来使用锌指核酸酶辅助的基因打靶以在伊马替尼敏感性K562CML细胞的BIM基因中精确重现这种缺失多态性(图15A)。我们随后分析了这些细胞在BIM剪接和表达以及TKI诱导的凋亡方面的变化。我们产生了对这种缺失多态性杂合(K562-BIM^内含子+/-)或纯合(K562-BIM^内含子-/-)的亚克隆(图16B)，并且在这些细胞中证实了以多态性剂量依赖性方式增加的外显子3/外显子4转录物比率(图16C)。含有缺失多态性的细胞还显示在伊马替尼暴露后含有外显子4的转录物的诱导作用降低(图16D)、BIMEL蛋白上调受损以及凋亡信号传导和细胞死亡均减弱(图16E、图16F和图16G)。如同KCL22细胞中，添加ABT-737至伊马替尼增强了后者在含有多态性的细胞中激活凋亡的能力(图16H)。总之，我们的研究证实，这种多态性通过使剪接作用偏离含有促死亡BH3结构域的BIM同工型，损害伊马替尼的凋亡反应，并且足以使得CML细胞内在抵抗伊马替尼。重要地，我们还证明，可以在含有多态性的细胞中通过BH3模拟物药物恢复伊马替尼的凋亡反应。

实施例H7.回顾性分析

接下来，我们就这种多态性对东亚CML患者中TKI反应的影响进行回顾性分析。使用一组来新诊断的自两个独立东亚人(新加坡/马来西亚和日本)队列的慢性期CML患者(n=203)，我们在具有和不具有这种缺失多态性的个体之间比较了采用标准剂量伊马替尼(400mg/日)的一线疗法的临床反应。临床反应根据欧洲白血病网络(ELN)标准(表H8)分类²，并且将耐药性患者按ELN标准定义为‘次佳应答个体’或‘失败’，而敏感患者对应于ELN定义的‘最佳反应个体’。

在两个地理队列中，相比于对照，具有这种缺失多态性的患者患有耐药性疾病的可能性比患有敏感性疾病的可能性高(表1)。当一起分析时，相对于没有这种缺失多态性的患者，在具有这种缺失多态性的患者当中对耐药性疾病的总体比值比是2.94(p=0.02，95%CI为1.17-7.43)。通过比较，我们发现在其他潜在预后性或混淆因素，包括从诊断至启用伊马替尼的中位数时间、诊断时Sokal评分或先前使用干扰素方面，两个组之间无显著差异(表H9)。

尽管是零星事例，我们还注意到，具有这种多态性的大部分耐药性患者随后不能对第二代TKI疗法作出反应(表H10)，这是一项与我们在细胞系中观察的内在耐药性相符的研究结果。

TKI耐药性最常见地与BCR-ABL激酶结构域中体细胞突变的获得相关⁷。然而，因为这种缺失多态性与内在TKI耐药性相关(图16)，我们预测这类患者将在激酶结构域突变不存在的情况下耐药。因此，我们将患者划分成以下三个临床组：耐药不伴有BCR-ABL突变(组I)，耐药伴有BCR-ABL突变(组II)或敏感(组III)。我们发现，与不具有这种多态性的患者相比，相对于合并的组II和组III，具有这种多态性的患者更可能位于组I中(比值比=1.90，(95%CI为2.08-4.35)。(表H11)。这些数据为我们的假设提供了第二临床验证。

实施例H8.讨论(实施例H1至H6)

总之，我们的研究结果证明以下原理：尽管癌症应当根据其以体细胞方式获得的‘驱动’突变来分类，但是种系多态性可以直接调节这类癌症对‘靶向’疗法的反应并影响临床结果。重要地，我们证明了一种BIM缺失多态性怎样可以(部分地)解释在统一定义并治疗的CML患者组中所见到的不均一反应。令人震惊地，这种多态性仅存在于东亚国家的个体中，而已经报道了在东亚国家中针对伊马替尼的不完全细胞遗传学反应的比率(26%)高于欧洲和北美洲(约50%)⁸。为评估这种缺失多态性对这些人种差异的相对贡献，我们估计这种多态性成为约23%东亚人病例(群体归因分数)中耐药性的基础。这可能部分解释在这两个世界群体之间所观察到的完全细胞遗传学反应率的差异。

通过阐明这种缺失多态性对BIM功能的影响，我们还描述了一种新剪接机制，借助所述机制，所述多态性有助于CML中的耐药性。因此，在证明这种耐药性归因于含有BH3的BIM同工型的表达受损时，我们能够证实BIM功能的药理学恢复可能克服这种特殊形式的TKI耐药性。我们注意到，尽管这种缺失多态性的存在与临床TKI耐药性强烈相关，但是其他的获得性和遗传性遗传因素将可能决定CML患者对TKI疗法的最终反应。然而，这种多态性的筛查可以用于管理祖先为东亚人的CML患者，以预测TKI耐药性。

因为BIM表达是广泛类型的人类癌症中TKI敏感性所需要的^20-23，所以我们也研究了BIM缺失多态性在表皮生长因子受体(EGFR)驱动非小细胞肺癌(NSCLC)中的影响。如所附论文中描述，我们发现，这种缺失多态性在NSCLC细胞系中导致针对EGFR抑制剂的内在耐药性以及预测已知具有激活性EGFR突变的NSCLC患者中对EGFR抑制剂显著较短的无进展生存期²⁴。总之，我们的数据清晰地证明，BIM缺失多态性是激酶驱动型人癌症体外和体内TKI耐药性的种系生物标记。

最后，尽管这种多态性的人种隔离本身令人感兴趣，但是我们研究结果的更大意义在于，它可能是仍待发现的解释不同世界范围群体中内在耐药的其他多态性的原型。

实施例H9.实施例H3至H8的参考文献

以下是实施例H3至实施例H8的参考文献。

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实施例N1至N4

实施例N1至N4证明了，EGFR驱动的非小细胞肺癌中与BIM缺失多态性相关的无进展生存期缩短。

实施例N1.材料与方法

伦理委员会批准

临床NSCLC样品从新加坡国家癌症中心(National Cancer Centre,Singapore)，日本东邦大学大森医学中心(Toho University Omori Medical Center,Japan)、日本爱知癌症中心(Aichi Cancer Center,Japan)以及国立大学健康系统国立大学癌症研究(the National University Cancer Institute,National University Health System,Singapore)所观察到的患者获得。在参与机构处获得为这项研究贡献样品的全部患者的书面知情同意书和机构审查委员会批准。

细胞培养物条件和试剂

将NSCLC细胞(PC9和HCC2279)在补充有青霉素/链霉素、谷氨酰胺和10%FBS的RPMI1640培养基中培育，并且在增湿培养箱中于37℃、5%CO₂孵育。将吉非替尼和ABT-737重悬于DMSO中并保持在-20℃。

实时RT-PCR(Q-PCR)

使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)，根据制造商说明书提取总细胞RNA。将RNA使用ingSuperscript III第一链合成系统(Invitrogen)逆转录，并且使用iQ5多色实时检测系统(Bio-Rad)以25μl总反应体积进行定量评估。引物在59℃退火20秒，扩增子在72℃延长30秒。定量的循环总数是40。使用β-肌动蛋白或BIM外显子2A的转录水平使样品之间归一化。使用以下引物：BIM外显子2A(正向：ATGGCAAAGCAACCTTCTGATG；反向：GGCTCTGTCTGTAGGGAGGT)，BIM外显子3(正向：CAATGGTAGTCATCCTAGAGG；反向：GACAAAATGCTCAAGGAAGAGG)，BIM外显子4(正向：TTCCATGAGGCAGGCTGAAC；反向：CCTCCTTGCATAGTAAGCGTT)和β-肌动蛋白(正向：GGACTTCGAGCAAGAGATGG；反向：AGCACTGTGTTGGCGTAC-AG)。

蛋白质印迹

使用针对人BIM、胱天蛋白酶3、切割的胱天蛋白酶3、PARP、磷酸-EGFR(Y1068)(均来自Cell Signaling Technology)和β-肌动蛋白(Sigma)的抗体进行蛋白质印迹。用对兔(Sigma)或小鼠IgG(SantaCruz)特异的HRP缀合的第二抗体进行检测。使用Western Lightning化学发光试剂(Perkin Elmer)使膜可视化。

台盼蓝生存力测定法

将PC9或HCC2279细胞以每孔5x10⁵或1.6x10个细胞一式三份接种于24孔平板中，并且用DMSO(无药物)、0.5μM吉非替尼，2.5μ MABT-737或吉非替尼和ABT-737的组合处理。处理后48小时进行台盼蓝染色以评估活细胞数目。

EGFR突变分析

将肺肿瘤的FFPE载玻片通过在二甲苯和无水乙醇中洗涤进行脱石蜡。从每张块载玻片刮下肺癌区域，转移至1.5ml管中，并且使用QIAGENQIAamp FFPE组织试剂盒提取基因组DNA。将EGFR外显子18至21测序。通过PCR在含有10μl GoTaq热启动Taq无色主混合物(M5133，Promega)的20ul反应体积中扩增50ng FFPE gDNA。PCR条件是：95℃5分种；DNA扩增35个循环，95℃50秒，58℃50秒，72℃60秒；并且在72℃终末延伸10分钟。使用的PCR引物是：外显子18(正向：TGGCACTGCTTTCCAGCATGG；反向：CTCCCCACCAGACCATGAGAGG)、外显子19(正向：ATCACTGGGCAGCATGTGGCA；反向：CCTGAGGTTCAGAGCCATGGAC)、外显子20(正向：CATGCGAAGCCACACTGACGTG；反向：GCATGTGAGGATCCTGGCTC)、外显子21(正向：GATCTGTCCCTCACAGCAGG；反向：GGTGTCAGGAAAATGCTGGCTG)。通过核酸外切酶I(M0293L,NewEngland Biolabs,Inc)-虾碱性磷酸酶(M8201，Promega)处理，纯化PCR产物。使用ABI PRISM BigDye终止循环测序即用型反应试剂盒(3版)在ABI PRISM3730遗传分析仪(Applied Biosystems，CA)上，将纯化的PCR产物以正方向和反方向测序。通过SeqScapeV2.5和人工评审，分析色谱图。

筛查BIM中的多态性缺失

从患者的血液样品提取或从福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)活组织检查样品载片/块回收DNA。对于来自血液的基因组DNA，通过单次PCR反应，我们将样品中的这种缺失进行基因分型，其中所述PCR使用了引物Bim_del_FAATACCACAGAGGCCCACAG和Bim_del_RGCCTGAAGGTGCTGAGAAAG和JumpStart RedAccuTaq LADNA聚合酶(Sigma)，采用以下热循环条件：96℃30秒，(94℃15秒，60℃60秒，68℃10分钟)x29，68℃20分钟。在1%琼脂糖凝胶上分析来自缺失等位基因(1,323bp)和野生型等位基因(4,226bp)的所得PCR产物。

对于从FFPE组织回收的DNA，独立地进行PCR反应以确定野生型和缺失等位基因的存在。使用引物BIM FFPE F5CCACCAATGGAAAAGGTTCA和BIM FFPE R1CTGTCATTTCTCCCCACCAC对野生型等位基因进行基因分型。使用引物BBIM FFPE F5CCACCAATGGAAAAGGTTCA和BIM Del FFPE R2GGCACAGCCTCTATGGAGAA对缺失等位基因进行基因分型。PCR反应使用GoTaq热启动聚合酶(promega)按以下热循环条件进行：95℃5分钟，(95℃50秒，58℃50秒，72℃1分钟)x39，72℃10分钟。在2%琼脂糖凝胶上分析来自缺失等位基因((284bp)和野生型等位基因(362bp)的所得PCR产物，并将它们测序以证实断点。

EGFR NSCLC患者数据分析

主要终点将检验BIM缺失多态性对来自东亚国家的经EGFR TKI治疗的EGFR突变性NSCLC患者的无进展生存期(PFS)的影响。从启动EGFR TKI疗法直至肿瘤进展或因任何原因死亡，计算PFS。如果TKI疗法因副作用终止，则审查观察结果。用Wilcoxon检验和对数秩检验计算出比较存活曲线的Kaplan-Meier检验的p-值。使用t-检验和Fisher精确检验来检验BIM缺失群体和野生型群体的临床特征之间的差异。

使用Cox比例风险回归分析，对以下因素生成单变量和多变量风险比：年龄、性别、组织学类型、吸烟史、由外显子和特定突变引起的EGFR突变的类型、分期、一线或二线TKI疗法、人种、TKI(吉非替尼或厄洛替尼(erlotinib))和ECOG状态。在逐步回归中引入变量的显著性水平是0.05。使用适于Windows的SAS系统9.2版PHREG方法执行计算。

表N1.根据BIM多态性状态的患者特征

实施例N2.简介

在表皮生长因子受体(EGFR)中具有激活性突变的许多但并非全部非小细胞肺癌(NSCLC)患者都对EGFR抑制剂作出反应。然而，对EGFR抑制剂的初始反应并不预示反应的持续期。我们报道，一种新型的BIM缺失多态性损害了细胞系中针对EGFR抑制剂的促凋亡BIM反应，并且预期患者具有大幅度缩短的无进展生存期。

EGFR中的激活性突变预示着NSCLC患者当中的高反应率^1,2。这类癌症东亚国家特别常见，在这些国家可以在多达50%的非小细胞肺癌中发现EGFR突变，并且有趣的是更常见于东亚女性不吸烟者^3-5。相比之下，激活性EGFR突变在西方仅见于约10%的肺癌中。然而，无论患者种族性如何，采用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)对携带激活性突变的肿瘤的疗法与较高缓解率关联^6-8，并且与细胞毒性化疗相比，显著延长无进展生存期⁹。然而，尽管总体反应率高，但是在应答(response)持续期(数周至数年)和肿瘤缩减程度(完全反应至病情稳定)方面存在巨大的不一致性^10-12。

这些临床观察结果表明，遗传或表观遗传调节物可能调节肿瘤对TKI疗法的反应，甚至在对潜在的‘驱动’突变，例如BCR-ABL或EGFR激酶具有有效抑制时也是如此。使用基因组级别的配对末端测序方案，我们最近在BIM基因中发现一种在慢性髓性白血病细胞系中导致内在伊马替尼耐药性和对伊马替尼的低劣临床反应的缺失多态性¹³。令人震惊地，这种多态性限于具有东亚血统的个体(12.3%携带率)¹³，如上文所述，这是一个有趣的人群，其富含具有致敏性EGFR的NSCLC患者。在机制上，这种缺失使剪接作用偏离含有外显子4(其编码促死亡BH3结构域)的BIM同工型，并因而损害TKI上调含有BH3的BIM蛋白同工型的能力。这转而导致TKI暴露后迟钝的凋亡反应和TKI的内在耐药性¹³。因为EGFR抑制剂还需要诱导含有BH3的BIM同工型来激活凋亡^14,1517,18并阻止BIM诱导导致EGFR突变的肺癌细胞对TKI耐药^16,17，所以我们想知道BIM缺失多态性是否也损害具有EGFR突变的NSCLC中的TKI反应。

实施例N3.HCC2779具有TKI致敏性EGFR突变但是对TKI耐药

为帮助回答这个问题，我们搜索了携带TKI致敏性EGFR突变但是令人难以理解地呈TKI耐药(以缺少任何已知的赋予二级耐药性的突变而定义)的NSCLC细胞系。我们能够鉴定出一个这样的细胞系HCC2279，显著的是它尽管是有效的EGFR抑制但却不能激活凋亡^16,1719,20。我们证实HCC2779细胞中存在BIM缺失多态性(图25A)，并且确定了这种缺失多态性对BIM功能的影响。如预期，与没有这种多态性的细胞相比，这种缺失导致含有外显子3的BIM同工型的表达相比于含有外显子4/BH3的BIM同工型增加(图25B)。此外，与对照细胞相比，TKI暴露伴随含有外显子4/BH3的BIM同工型的表达在转录物水平和蛋白质水平减少以及受损的凋亡信号传导激活作用(图25C和图25D)。与TKI耐药性因含有BH3的BIM蛋白质水平降低的理论一致，添加BH3模拟物药物(ABT-737)增强了TKI诱导的凋亡信号传导和细胞死亡(图25E和图25F)。另外，我们还证明，将这种缺失多态性从头导入伊马替尼敏感性CML细胞中足以使得这类细胞变成伊马替尼内在耐药¹⁶，表明这种多态性很大程度上负责HCC2279细胞中的TKI耐药性。

实施例N4.BIM中的缺失与对EGFR TKI的应答持续期相关

接下来，我们疑问这种缺失是否与具有激活性EGFR突变的NSCLC患者中对EGFR TKI的应答持续期相关。具有或没有这种缺失多态性的的患者就已知的预后因素而言并无不同(表N1)。然而，与没有这种多态性的个体的11.9个月的无进展生存期相比，这种多态性的存在预示着中位数为6.6个月的显著较短的无进展生存期(n=141，p=0.0027)(图26)。在使用Cox回归模型的多变量分析中，除了存在TKI耐药性外显子20突变(风险比=6.00，95%置信区间2.05-17.57，p=0.0011)外^18,19，仅缺失多态性(风险比=2.14,95%，95%置信区间1.30-3.50，p=0.0026)作为更差无进展生存期的独立预后因素出现。

总而言之，我们发现，BIM缺失多态性导致正常细胞和癌细胞中含有BH3的BIM同工型的剪接和表达受损(图25和参考文献16)。在酪氨酸激酶驱动型癌症的背景下，由这种多态引起的异常剪接足以导致针对TKI的内在细胞耐药性，而无论潜在的‘驱动’突变(图25和参考文献16)。重要地，在患有CML或EGFR突变的NSCLC的患者中，这种多态性的存在还与明显低劣的TKI反应相关(图26和参考文献16)。

在靶向型癌症疗法的背景下，我们的结果为统一定义并治疗的患者当中肿瘤反应的不均一性提供了解释。我们的数据也凸显，单个种系多态性在关键基因中出现时怎样在享有共有生物学的不同癌症中强烈影响临床结果。这可能反映了BIM在介导这些疾病中TKI敏感性方面的核心作用^14,15,20。我们预计，其中BIM多态性影响TKI反应的癌症列表将扩充以包括敏感性也依赖于BIM表达的其他癌症^21-23。尽管我们的数据集中在多态性对治疗反应的影响上，但人类多态性也可能解释癌症生物学的其他方面之间的不一致性。不同于BIM缺失，这些多态性可能可想象地导致增强的治疗反应，或甚至与‘驱动’突变协作以加速或延缓癌症进展。如我们已经证明，对这种这类多态性怎样影响基因功能的机制性理解可以导致在预后和疗法方面改进对癌症患者的管理。在具有所述BIM多态性的患者中出现TKI耐药性的情况下，向标准TKI疗法中添加BH3模拟物可以实现个性化治疗从而克服耐药性。

实施例N5.实施例N2至N4的参考文献

以下是实施例N2至实施例N4的参考文献。

1.Paez,J.G.等人,Science304,1497-1500(2004).

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3.Shepherd,F.A.等人,N Engl J Med353,123-132(2005).

4.Kim,E.S.等人,Lancet372,1809-1818(2008).

5.Park,K.和Goto,K.Curr Med Res Opin22,561-573(2006).

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7.Rosell,R.等人,N Engl J Med361,958-967(2009).

8.Sequist,L.V.等人,J Clin Oncol26,2442-2449(2008).

9.Mok,T.S.等人,N Engl J Med361,947-957(2009).

10.Gazdar,A.F.Oncogene28Suppl1,S24-31(2009).

11.Sharma,S.V.,Bell,D.W.,Settleman,J.和Haber,D.A.Nat Rev Cancer7,169-181(2007).

12.Sequist,L.V.,Bell,D.W.,Lynch,T.J.和Haber,D.A.J Clin Oncol25,587-595(2007).

13.Hillmer,A.M.等人,评审中(2011).

14.Costa,D.B.等人,PLoS Med4,1669-1679；讨论1680(2007).

15.Cragg,M.S.,Kuroda,J.,Puthalakath,H.,Huang,D.C.和Strasser,A.PLoS Med4,1681-1689；讨论1690(2007).

16.Machida,K.等人,PLoS One5,e13470(2010).

17.Lu,Y.,Liang,K.,Li,X.和Fan,Z.Mol Cancer6,63(2007).

18.Wu,J.Y.等人,Clin Cancer Res14,4877-4882(2008).

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22.Will,B.等人,Blood115,2901-2909(2010).

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本文中所提到的每份申请及专利，和在以上每份申请及专利中所援引或参考的每份文献，包括在每份申请及专利审查期间(“申请援引的文献”)和在每份申请及专利中及在任何申请援引的文献中所援引或参考的任何产品的任何制造商的说明书或目录，均通过引用的方式并入本文。另外，本文中援引的全部文献和在本文中所援引的文献内引用或参考的全部文献，和本文中引用或提及的任何产品的任何制造商说明书或目录，均通过引用的方式并入本文。

本发明的所述方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将显而易见，不脱离本发明的范围和精神。虽然已经通过具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解所要求保护的发明不应不合理地受限于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明所述模式的多种修改均属于权利要求书的范围。

Claims (16)

1.一种预测易患或患有癌症或骨髓增生病的个体是否可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性的方法，所述方法包括确定所述个体是否具有BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，所述多态性变体以5′至3′顺序包含SEQID NO:5中所述的核苷酸序列和紧接的SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列，优选地,其中所述BIM(BCL2L11)基因多态性变体缺少SEQ ID NO:6中所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括：(a)检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物的存在，所述扩增产物作为所述个体具有所述BIM(BCL2L11)基因多态性变体的指示物，或(b)检测包含SEQ ID NO:2中所述序列的核酸扩增产物的存在，所述扩增产物作为所述个体缺少所述BIM(BCL2L11)基因多态性变体的指示物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括使用例如(a)如SEQ ID NO:3中所述或(b)如SEQ ID NO:4中所述或(a)和(b)组合的核苷酸序列作为引物集合时的核酸扩增产物。

4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中(a)如果测定所述个体具有所述BIM(BCL2L11)基因多态性变体，则所述个体可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性，或其中(b)如果测定所述个体不具有所述BIM(BCL2L11)基因多态性变体，则所述个体形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性的可能性较小。

5.一种为患有癌症或骨髓增生病的个体选择疗法的方法，所述方法包括通过前述任一项权利要求所述的方法确定患者是否可能形成酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性，并且在确定所述个体可能形成这种耐药性的情况下，选择包括以下一种或多种的疗法：

(a)更频繁地监测所述患者；

(b)更频繁的血液检查和骨髓检查；

(c)骨髓移植；

(d)施用更强力的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如尼洛替尼或达沙替尼；

(e)施用BH3-模拟物，例如，ABT-263，例如与TKI组合；

(f)增加酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼的剂量，例如超过400mg/日的标准剂量至600mg/日或800mg/日；或

(g)用抑制BCL2组蛋白质的促存活作用的药物治疗。

6.确定具体疗法在患有癌症或骨髓增生病的个体上取得成功的可能性的方法，所述方法包括将所述疗法与通过权利要求5所述的方法确定的疗法相比较。

7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中：

(a)所述癌症或骨髓增生病包括慢性髓性白血病(CML)，并且其中酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性包括例如BCR-ABL非依赖性TKI耐药性，如针对酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的耐药性；

(b)所述癌症或骨髓增生病包括胃肠道间质肿瘤(GIST)，并且其中酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性包括例如c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药性，如针对酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的耐药性；

(c)所述癌症或骨髓增生病包括非小细胞肺癌(NSCLC)，并且其中酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性包括例如EGFR非依赖性TKI耐药性，如针对酪氨酸激酶抑制剂如厄洛替尼或吉非替尼或其他激酶抑制剂例如舒尼替尼、尼洛替尼和索拉非尼的耐药性；

(d)所述癌症或骨髓增生病包括如选自真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化的骨髓增生病，并且其中酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药性包括例如JAK2非依赖性TKI耐药性，如针对JAK抑制剂的耐药性；或

(e)其中所述癌症或骨髓增生病选自：血液学恶性病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、实体瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤和神经母细胞瘤。

8.BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其以5′至3′顺序包含SEQ ID NO:5中所述的核苷酸序列和紧接的SEQ ID NO:7中所述的核苷酸序列。

9.BIM(BCL2L11)基因的多态性变体，其特征在于缺少SEQ ID NO:6中所述的核苷酸序列。

10.如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所述的核苷酸序列，其通过例如核酸扩增可获自权利要求8或9所述的BIM多态性变体。

11.根据权利要求8或9所述的BIM(BCL2L11)基因的多态性变体或根据权利要求10所述的核苷酸序列，其在包含这种多态性的个体中与以下相关：

(i)在BCR-ABL再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂对慢性髓性白血病的治疗耐药性(BCR-ABL非依赖性TKI耐药)；

(ii)在c-KIT/PDGFR再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂对胃肠道间质肿瘤(GIST)的治疗耐药性(c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药)；

(iii)在EGFR再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗耐药性(EGFR非依赖性TKI耐药)；或

(iv)在JAK2再激活不存在的情况下酪氨酸激酶抑制剂对骨髓增生病的治疗耐药性(JAK2非依赖性TKI耐药)。

12.(a)如SEQ ID NO:3中所述或(b)如SEQ ID NO:4中所述或(a)和(b)组合的核苷酸序列，例如引物集合。

13.检测个体中存在或不存在权利要求8或9所述的BIM(BCL2L11)多态性的方法，所述方法包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列或SEQ ID NO:2中所述序列的核酸扩增产物，例如通过使用权利要求12所述的引物集合检测。

14.治疗患有癌症或骨髓增生病的患者的方法，所述方法包括通过权利要求1至7任一项所述的方法确定所述癌症或骨髓增生病是否为BCR-ABL非依赖性TKI耐药性CML癌症、c-KIT/PDGFR非依赖性TKI耐药性GIST癌症、EGFR非依赖性TKI耐药性NSCLC癌症或JAK2非依赖性TKI耐药性骨髓增生病，和通过实施选自权利要求5中所述的(a)至(g)的步骤治疗所述患者。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其包括检测包含SEQ ID NO:1中所述序列的核酸扩增产物，例如通过使用权利要求5所述的引物集合检测。

16.多态性变体、核苷酸序列或方法，其基本上如本文参考附图1至26所描述和如附图1至26中所显示。

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