CN103648490A

CN103648490A - 胞内酶用于释放共价连接的生物活性物的用途

Info

Publication number: CN103648490A
Application number: CN201280024126.1A
Authority: CN
Inventors: M.R.吉鲁塞克; J.C.米尔恩; D.卡尼; J.E.比米斯; C.B.武
Original assignee: Catabasis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Astria Therapeutics Inc
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2014-03-19
Also published as: EP2949344A3; US20140315786A1; EP2685969A2; EP2685969A4; WO2012129112A2; EP2949344A2; WO2012129112A3

Abstract

本发明涉及对胞内酶进行靶向以释放共价连接的生物活性物，这导致产生生物活性物之间的协同效应。本发明涉及直接共价连接或通过共价分子连接物连接的生物活性物的用途，所述直接共价连接或通过共价分子连接物连接的生物活性物与单独(即，不是共价连接的)给药所述生物活性物时相比，当通过胞内酶释放为游离的生物活性物形式时，具有增强的治疗活性。此外，本发明描述了向有此需要的患者给药具有增强治疗活性的相连的生物活性物形式的生物活性物的方法。因此，本发明还涉及治疗患者一些疾病的方法。

Description

胞内酶用于释放共价连接的生物活性物的用途

优先权

本申请要求2011年3月18日提交的美国临时专利申请61/454,314的优先权权益，在此将61/454,314的全部内容并入本申请作为参考。

技术领域

本发明涉及对胞内酶进行靶向以释放共价连接的生物活性物，这生物活性物之间产生了协同效应。本发明还涉及直接共价连接或通过共价分子连接物(linker)连接的生物活性物的用途，所述直接共价连接或通过共价分子连接物连接的生物活性物与单独(即，不是共价连接的)给药所述生物活性物时相比，当通过胞内酶释放为游离的生物活性物形式时，具有增强的治疗活性。此外，本发明描述了向有此需要的患者给药具有增强治疗活性的相连的生物活性物(linked biocative)形式的生物活性物的方法。因此，本发明还涉及治疗患者一些疾病的方法。

背景技术

联合疗法(或多疗法(polytherapy))是指使用不止一种药物或不止一种疗法治疗单一病症，而复方用药(polypharmacy)是指使用不止一种药物治疗多种不同的病症(S Baron(ed.)Medical Microbiology.4th edition.,University ofTexas Medical Branch at Galveston1996)。例如，在一些抗HIV/AIDS的抗病毒方法中，使用称为高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)的联合疗法。该治疗方案通常由属于至少两类抗逆转录病毒药物的至少三种药物的联用(或鸡尾酒(cocktail))组成。例如，常用的方法是将两种核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTIs)与蛋白酶抑制剂或非-核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)组合。在使用多种药物的情况下，非常期望的结果是协同作用即药物组合的超累加作用(super-additive effect)，所述超累加作用提供的结果大于从分开给药的各个药物的总和可预期的作用(Tallarida,Drug Synergism和Dose-Effect DataAnalysis,Chapman和Hall/CRC2000)。至少期望的是，所给药的药物具有累积作用，即与它们分开给药时所具有的作用相同。

然而，所述方法经常失败。即，一些联合疗法不是有效的，并因此显示次加性作用(即，低于累积作用)或甚至低于就分开的任一种药物所观察到的作用。此外，一些药物尽管与具体的病症具有明确的理论关联，但单独给药时却具有最小的作用或无作用。可假定多种理由来解释复杂系统中一种或多种药物失败的原因，例如患者的生理环境。撇开病因学，明确需要使作用最大化(潜在地通过协同作用)的可选择的药物递送策略。具体地，需要这样的疾病治疗方法，所述方法使用胞内酶释放相连的生物活性物，这样产生的效力高于当将所述生物活性物一起给药但不是共价连接时所观察到的效力。

发明内容

本发明涉及靶向胞内酶以释放共价连接的生物活性物的方法，这在生物活性物之间产生了协同作用。本发明部分是基于以下的发现：如果将一些生物活性物通过连接物基团(linker group)共价连接(相连的生物活性物)，随后在给药后，通过作用于连接物基团的胞内酶的作用在靶向的疾病中释放成游离的生物活性物，则这些生物活性物是有效的。这些相连的生物活性物被发现是血浆稳定的，并且在它们到达靶向病变组织前，不会从连接物基团上游离出生物有效量的所述生物活性物。更具体地，当所述相连的生物活性物的连接物基团通过一种或多种胞内酶的活性酶法断裂时，观察到该效力。该效力可为协同性的，即所述应答大于所述生物活性物的组合。在一些情况下，当两种生物活性物被共价连接成相连的生物活性物时，任一种生物活性物的相关副作用低于单独给药所述生物活性物时的副作用。这是由于通过在靶向细胞内部表达的并且作用在将生物活性物共价连接在一起的连接物基团上的一种或多种胞内酶的活性，单独的生物活性物仅可被释放在所述靶向细胞内。

因此，本发明一个方面描述了增加至少两种生物活性物的一种或多种细胞内生物活性的方法，所述方法包括:(a)选择第一生物活性物；(b)选择第二生物活性物，其可与(a)的生物活性物相同或不同；(c)选择连接物基团，所述连接物基团共价连接所述(a)的生物活性物和所述(b)的生物活性物，其中所述连接物基团包含至少一个用作胞内酶的功能性底物的键(linkage)；和(d)用所述(c)连接物基团连接所述(a)和(b)生物活性物。在一些实施方案中，胞内酶在发生病变的细胞类型中比相同细胞类型的非病变状态以较高的水平表达。

本发明另一个方面描述了(一种或多种)胞内酶在治疗疾病中的用途，所述胞内酶使连接两种或更多种生物活性物的连接物基团中包含的键断裂。在一些实施方案中，所述连接物基团可被胞内酶酶法断裂或水解并因此导致生物活性物(一种或多种)释放以及协同作用。在一些实施方案中，需要多种酶来实现所述生物活性物的释放。可用于本发明的酶的非限制性实例为酰胺酶、蛋白酶、巯基还原酶、脂肪酶和酰胺水解酶。在一些实施方案中，通过一种或多种酶进行的多次断裂最终使生物活性物之间的键断裂或水解或使所述生物活性物从所述连接物上游离出来。

本发明另一个方面为(一种或多种)胞内酶在治疗疾病中的用途，所述胞内酶使连接两种或更多种生物活性物的连接物基团中包含的键断裂，其中所述酶为能够对连接于生物活性物的脂肪酰胺进行加工的任意酶。

本发明另一方面为(一种或多种)胞内酶在治疗疾病中的用途，所述胞内酶使连接两种或更多种生物活性物的连接物基团中包含的键断裂，其中所述酶为脂肪酰胺水解酶。

本发明另一方面为(一种或多种)胞内酶在治疗疾病中的用途，所述胞内酶使连接两种或更多种生物活性物的连接物基团中包含的键断裂，其中所述生物活性物(一种或多种)可为不同或相同的化学实体。相连的生物活性物的非限制性实例包括水杨酸酯连ω3脂肪酸、烟酸连ω3脂肪酸、富马酸酯连ω3脂肪酸、ω3脂肪酸连ω3脂肪酸和环氧合酶抑制剂连ω3脂肪酸，其中所有这些相连的生物活性物在血浆中都是稳定的。

本发明另一方面为(一种或多种)胞内酶在治疗疾病中的用途，所述胞内酶使连接两种或更多种生物活性物的连接物基团中包含的键断裂，其中可根据所述细胞的状态来选择所述(一种或多种)胞内酶。例如，本发明一个方面包括选择被下述胞内酶断裂的连接物基团，所述胞内酶具有针对治疗而靶向的疾病有关联的表达模式。在一些实施方案中，根据胞内酶的组织特异性表达选择连接物基团，其中所述连接物基团包含作为所述胞内酶的底物的键。在一些实施方案中，如果存在包含针对所选择的酶的底物的连接物基团，则测定一些酶在疾病或组织环境中的功能。

本申请部分是基于发现：一些治疗剂当被以相连的生物活性物形式递送到表达一些酶的具体环境时，它们是有效的。因此，当用于治疗疾病的两种或更多种生物活性物被分开给药或当被共同给药但不是以相连的生物活性物形式连接在一起时对所述疾病具有较小的作用或无作用。在一些实施方案中，这些作用是由水解所述连接物基团以使其有效的胞内酶产生的。在本发明的不同方面中，不同的疾病得以治疗。在一些方面中，所治疗的疾病为炎症疾病。在一些方面中，所述疾病为包括脂质稳态(包括但不限于血脂障碍和甘油三酯血症)、心血管疾病、代谢疾病(包括但不限于II型糖尿病)、肾病、癌症、神经变性疾病、自身免疫性疾病、败血症性休克、病毒感染和不当免疫发育障碍的那些。

同样，这些生物活性物的药学相关活性直到所述生物活性物之间的连接物基团或连接物被胞内酶断裂才可被观察到。因此，本发明另一个方面为胞内酶抑制剂用于确定相连的生物活性物对特异性胞内酶就治疗疾病的功效具有依赖性的用途。在一个方面中，根据疾病将相连的生物活性物给药于患者，并且如果观察到阳性反应，则获取患者组织并就被怀疑过表达或较多功能的一些胞内酶的增加的表达或功能对所述患者组织测试。之后，可根据所述酶来选择连接物基团并用在生物活性物之间以增加所述生物活性物的治疗作用。

本发明另一个方面为治疗疾病，其中根据与疾病或组织类型相关的具体酶的表达或功能对生物活性物组合和连接各生物活性物的连接物基团进行修整以适配患者。

本发明另一个方面为在患有某些疾病的个体中抑制、预防或治疗疾病的方法，所述方法包括向所述患者给药被胞内酶选择性水解的相连的生物活性物。此外，本发明包括给药生物活性物的方法。生物活性物可通过含有键的连接物基团连接，并且根据靠近具体酶的底物的连接物基团(从而使所述酶断裂连接物基团)来选择所述生物活性物。

本发明另一个方面为选择ω-3脂肪酸作为生物活性物组分之一。在一些实施方案中，ω-3脂肪酸为所述生物活性物组分。在其它实施方案中，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)或这两者的组合可为所述生物活性物组分。

结合下面的描述对本发明的详细内容进行阐述。现在描述的是示例性方法和物质，但与本申请描述的那些方法和物质相似或等同的方法和物质可用在本发明的实施或测试中。通过所述描述和通过权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将会显而易见。在说明书和随附权利要求中，除非上下文给出明确的相反指示，单数形式也包括复数。除非另有定义，本申请使用的所有科技术语的含义与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。将说明书中引用的所有专利和出版物的全部内容并入本申请作为参考。

附图说明

图1说明了相连的生物活性物的体外水解。

图2-6说明了相连的生物活性物在体外测定中的协同作用。

图7A和7B说明了巯乙胺自二-脂肪酸相连的生物活性物的释放。

图8说明了使用重组MAGL水解化合II-l。

图9A-D说明了在已被过表达有FAAH-1或FAAH-2的COS-7细胞中，化合物1-1的水解。

发明详述

本发明涉及对胞内酶进行靶向以释放相连的生物活性物，这在生物活性物之间产生了协同作用。本发明还涉及直接共价连接或通过共价分子连接物连接的生物活性物的用途，所述直接共价连接或通过共价分子连接物连接的生物活性物与单独(即，不是共价连接的)给药所述生物活性物时相比，当通过胞内酶释放为游离的生物活性物形式时，具有增强的治疗活性。此外，本发明描述了向有此需要的患者给药具有增强治疗活性的相连的生物活性物形式的生物活性物的方法。因此，本发明还涉及治疗患者一些疾病的方法。

因此，本发明一个方面描述的是增加至少两种生物活性物的一种或多种细胞内生物活性的方法，所述方法包括:(a)选择第一生物活性物；(b)选择第二生物活性物，所述第二生物活性物可与(a)的生物活性物相同或不同；(c)选择包含在所述(a)的生物活性物和所述(b)的生物活性物之间的连接物基团中的连接物，其中所述键为胞内酶的功能性底物；和(d)用所述(c)连接物基团连接所述(a)和(b)生物活性物。在一些实施方案中，胞内酶在发生病变的细胞类型中比相同细胞类型的非病变状态以较高的水平表达。

本发明提供适当的(一种或多种)胞内酶在治疗病症中的用途，所述适当的胞内酶使连接两种或更多种生物活性物分子的连接物基团或键断裂。

本发明还提供用被胞内酶选择性水解的相连的生物活性物治疗受一些疾病困扰的个体的方法。生物活性物可被包含键的连接物基团连接起来并且基于具体的酶会断裂所述连接物基团或连接物的观察结果来选择所述生物活性物。本发明一个实施方案包括选择被下述胞内酶断裂的连接物基团，所述胞内酶具有与被靶向治疗的疾病有关联的表达模式。此外，对连接物基团的这种选择可通过胞内酶的组织特异性表达来确定。并且，本发明包括测定一些酶在病症和组织环境中的功能性来选择适当的连接物基团，而不是测定表达水平。

此外，本发明提供根据与病症或组织环境相关的酶的表达或功能状态用生物活性物进行治疗的方法。

此外，本发明提供进行疾病治疗的个体化用药方法。本发明该方面的一个实施方案为胞内酶抑制剂用于确定相连的生物活性物对特异性胞内酶就治疗疾病的功效具有依赖性的用途。此外，本发明包括治疗疾病的方法，其中根据与疾病或组织类型相关的具体酶的表达或功能对生物活性物组合和连接各生物活性物的连接物基团进行修整以适配患者。

定义

以下定义在本申请通篇中使用:

本申请中使用的冠词是指一个或不止一个(即，是指至少一个)所述冠词的语法客体。举例而言，要素是指一种要素或不止一种要素。

除非另有说明，用在本申请中的术语和/或意指“和”或“或”中的任一种情况。

用在本申请中的术语“生物活性物”或“多种生物活性物”是指在疾病治疗中有用的一种或多种化学实体，其中所述实体中的至少一种选自以下:ω3脂肪酸、可在体内被转化成ω3脂肪酸的脂肪酸和硫辛酸(lipoic acid)。

用在本申请中的术语“连接物基团”是指共价连接第一生物活性物和第二生物活性物的分子实体。连接物基团的非限制性代表性实例包括在下式中定义的基团：

其描述在例如本申请式VI中。

用在本申请中的术语“键”意指存在于第一生物活性物和连接物基团之间以及存在于任意随后的生物活性物和连接物基团之间的共价键。连接物基团通常具有至少两个键；第一键用于使所述第一生物活性物共价结合于构成所述连接物的分子实体，并且第二键用于共价结合于所述第二生物活性物。在一些情况下，所述两种生物活性物可为经由键共价连接的，而不使用连接物基团。对酶法水解敏感的多种化学键可用在所述键中。对酶法水解敏感的化学键的非限制性实例为:酰胺键、酯键、硫酯键、磷酸酯键、氨基磷酸酯键和二硫键。

在本申请中使用的术语“相连的生物活性物”意指通过连接物基团共价连接在一起的至少两种生物活性物。

除非另有专门定义，术语“芳基”是指具有1-2个芳族环的环状芳族烃基，包括单环或二环基团例如苯基、联苯基或萘基。在含有两个芳族环(二环的等)的情况下，所述芳基的芳族环可在单一点接合(例如，联苯基)或为稠合的(例如，萘基)。所述芳基可任选在任意连接点被一个或多个取代基例如1-5个取代基取代。所述取代基本身可为任选取代的。

“C₁-C₃”烷基是指含有1-3个碳原子的直链或支链饱和烃。C₁-C₃烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基和异丙基。

“C₁-C₄”烷基是指含有1-4个碳原子的直链或支链饱和烃。C₁-C₄烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

“C₁-C₅”是指含有1-5个碳原子的直链或支链饱和烃。C₁-C₅烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基和新戊基。

“C₁-C₆”是指含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃。C₁-C₆烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基和新戊基。

术语“环烷基”是指含有3-6个碳原子的环状烃。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。应当理解的是，环烷基上可取代氢中的任一个可被卤素、C₁-C₃烷基、羟基、烷氧基和氰基取代。

本申请使用的术语“杂环”是指含有3-6个原子的环状烃，其中所述原子中的至少一个为O、N或S。杂环的实例包括但不限于氮丙啶、环氧乙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、哌啶、四氢吡喃、硫杂环己烷(thiane)、咪唑烷、噁唑烷、噻唑烷、二氧戊环、二硫杂环戊烷、哌嗪、噁嗪、二硫杂环己烷和二噁烷。

本申请使用的术语“杂芳基”是指具有5-12个环原子的单环或二环结构，其中所述环原子中的一个或多个为杂原子例如N、O或S，并且所述二环结构中的一个或多个环为芳族的。杂芳基的一些非限制性实例为吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、四唑基、苯并呋喃基、呫吨和二氢吲哚。应当理解的是，杂芳基上可取代氢中的任一个可被卤素、C₁-C₃烷基、羟基、烷氧基和氰基取代。

本申请使用的术语“天然存在的氨基酸侧链中的任一个”意指下述氨基酸中的任一种的侧链:异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、组氨酸和酪氨酸。

本申请使用的术语“脂肪酸”意指ω-3脂肪酸和在体内被代谢成ω-3脂肪酸的脂肪酸。脂肪酸的非限制性实例为全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸(ALA或全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、十八碳四烯酸(STD或全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE或全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA或全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA或全顺式-5,8,11、14、17-二十碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA、鱼泡酸或全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA或全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)或二十四碳六烯酸(鲱油酸或全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四烯酸)。此外，术语“脂肪酸”也可指中链脂肪酸例如硫辛酸。

“受试者”为哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类动物例如猴子，猩猩、狒狒或猕猴，并且术语“受试者”和“患者”在本申请中互换使用。

本发明还包括药物组合物，其包含有效量的二-脂肪酸相连的生物活性物和药用载体。本发明包括以药用前药、水合物、盐例如药用盐、对映异构体、立体异构体或它们的混合物形式提供的二-脂肪酸相连的生物活性物。

代表性的药用盐包括例如水溶性和水不溶性盐，例如乙酸盐、氨芪磺酸盐(4,4-二氨基芪-2,2-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物盐、丁酸盐、钙盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、盐酸盐、枸橼酸盐、克拉维酸盐(clavulariate)、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐(fiunarate)、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸、乙内酰基氨苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明胺(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物盐、异硫代羟酸盐(isothionate)、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、镁盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡萄糖胺铵盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐(1,1-亚甲基-二-2-羟基-3-萘甲酸盐、双羟萘酸盐)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次醋酸盐(subacetate)、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、苏拉明酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化合物盐和戊酸盐。

本申请使用的术语“代谢疾病”是指牵涉血脂障碍、甘油三酯血症、胰岛素抵抗、II型糖尿病的障碍、疾病和综合征，并且术语代谢障碍、代谢疾病和代谢综合征在本申请中互换使用。

当与相连的生物活性物连用时，“有效量”为有效治疗或预防疾病的量。

本申请使用的术语“载体”包括载体、赋形剂和稀释剂并且意指参与在将药用试剂从身体的一个器官或部位运送或运输到所述身体的另一个器官或部位的物质、组合物或媒介物，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质。

术语“治疗”就受试者而言是指改善所述受试者的障碍的至少一种症状。治疗可为治愈、改善或至少部分减轻所述障碍。

除非另有说明，本申请使用的术语“障碍”意指术语疾病、病症或疾患，并且与这些术语互换使用。

本申请使用的术语“给药”或“给予”是指直接将化合物或所述化合物的药用盐或组合物给药于受试者，或者是指将可在所述受试者的体内形成等量活性化合物的所述化合物的前药衍生物或类似物或所述化合物的药用盐或组合物给药于所述受试者。

本申请中使用的术语“前药”意指通过代谢途径(例如，通过水解)在体内可转化的化合物。

在本申请中使用下述缩写并且具有所指示的定义:Boc和BOC为叔丁氧羰基；Boc₂O为一缩二碳酸二叔丁酯；CDI为1,1’-羰基二咪唑；DCC为N,N'-二环己基碳二亚胺；DIEA为N,N-二异丙基乙基胺；DMAP为4-二甲基氨基吡啶；DOSS二辛基磺基琥珀酸钠；EDC和EDCI为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；EtOAc为乙酸乙酯；h为小时；HATU为2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；HPMC为羟丙基甲基纤维素；oxone为过氧单硫酸钾；Pd/C为钯/炭；TFA为三氟乙酸；TGPS为生育酚丙二醇琥珀酸酯；THF为四氢呋喃和TNF为肿瘤坏死因子。

如上所述，本发明涉及对胞内酶进行靶向以释放相连的生物活性物，这在生物活性物之间产生了协同作用。因此，在一些实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述生物活性物是由酰胺键共价连接的并且被脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生协同作用，所述协同作用当所述生物活性物被单独给药或被以非-相连的生物活性物形式给药时没有观察到。在其它实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述生物活性物是由酰胺键共价连接的并且被脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生有效应答而无各单独组分的不良作用或副作用。甚至在其它实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述生物活性物是由酰胺键共价连接的并且被脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生有效应答，所述应答比单个组分的应答更好耐受。在其它实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述多种生物活性物是由酰胺键和二硫键共价连接的并且被巯基还原酶和脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生有效应答，所述应答大于单个组分的应答。在一些实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述生物活性物是由酰胺键和二硫键共价连接的并且被巯基还原酶和脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生有效应答，而无单个组分的不良作用或副作用。在进一步的实施方案中，本申请提供的是疾病的治疗方法，所述方法使用下述生物活性物，所述生物活性物是由酰胺键和二硫键共价连接的并且被巯基还原酶和脂肪酰胺水解酶细胞内断裂以释放所述生物活性物，从而产生有效应答，所述应答比单个组分的应答更好耐受。

本发明包括任意数目的胞内酶的用途。在一些实施方案中，所述酶为水解酶。水解酶包括通过引入一分子水来催化底物中各种共价键断裂的一类酶。所述反应包括由水分子的氧原子对所述底物中的目标键进行亲核攻击。所述水分子分裂穿过目标键，使所述键断裂并产生两个产物分子。水解酶参与在对诸如以下功能来说是必不可少的反应中：细胞组分的合成和降解以及对细胞功能包括细胞信号传导、细胞增殖、炎症、凋亡、分泌和排泄的调节。水解酶参与在牵涉这些功能的疾病过程的关键步骤中。可通过底物特异性对水解酶进行分类，所分的类包括但不限于磷酸酯酶、肽酶、溶血磷脂酶、磷酸二酯酶、糖苷酶和乙二醛酶。水解酶也包括酰胺酶。

磷酸酯酶从蛋白质上水解性除去磷酸酯基团，这是一个提供能量的步骤，该步骤调节多种细胞过程包括细胞内信号传导途径，所述细胞内信号传导途径随即控制细胞生长和分化、细胞间接触、细胞周期和肿瘤生成。

肽酶(也被称作蛋白酶)使形成肽链或蛋白质链的骨架的肽键断裂。蛋白酶解加工对于细胞生长、分化、重塑和内稳态以及炎症和免疫应答是必不可少的。由于典型蛋白质的半衰期范围为数小时至几天，因此肽酶不断将前体蛋白质断裂成它们的活性形式、从目标蛋白质中除去信号序列和降解老化或有缺陷的蛋白质。肽酶在细菌在宿主内侵入和复制、寄生虫在宿主内侵入和复制以及病毒在宿主内侵入和复制中发挥作用。肽酶的非限制性实例包括胰蛋白酶和糜蛋白酶、补体级联和凝血级联的组分、溶酶体组织蛋白酶、钙蛋白酶、胃蛋白酶、肾素和凝乳酶(Beynon&Bond(1994)Proteolytic Enzymes:APractical Approach,Oxford University Press,New York,1-5)。

溶血磷脂酶(LPL)通过催化酯键水解来除去酰基，从而调节细胞内脂质，这是脂质降解中的关键步骤。小的LPL同工型(约15-30千道尔顿)可发挥水解酶的作用；较大的异形体即可发挥水解酶的作用又可发挥酰基转移酶的作用。LPL的一种具体底物即溶血磷脂酰胆碱使细胞膜溶解。LPL活性是由多种途径(包括炎症性应答)中重要的信号传导分子调节的。

磷酸二酯酶催化磷酸二酯化合物中两个酯键之一的水解。磷酸二酯酶因此对于多种细胞过程是至关重要的。磷酸二酯酶包括DNA和RNA内-和外-核酸酶，它们对于细胞生长和复制以及蛋白质水解是重要的。另一种磷酸二酯酶为酸性鞘磷脂酶，其将膜磷脂鞘磷脂水解成神经酰胺和磷酰胆碱并因此参与多种细胞内信号传导途径中。

糖苷酶催化糖苷的半缩醛键的断裂，所述糖苷为含有一个或多个糖的化合物。

其它水解酶作用在醚键上，包括硫醚水解酶。

另一组水解酶包括作用在碳-氮(C-N)键而不是肽键上的那些酶。属于该组的为水解酰胺键的那些酶(例如，酰胺酶)、水解脒键的那些酶(例如，酰胺酶)和水解其它C-N键的那些酶。可根据底物特异性例如直链酰胺、环状酰胺、直链脒、环状脒、亚硝酸和其它化合物将该组进一步细分。

在其它实施方案中，所述酶为半胱氨酸水解酶家族的成员。该家族的非限制性示例性成员包括N-酰基鞘氨醇酰氨基水解酶(酸性神经酰胺酶)和N-酰基乙醇胺-水解酸性酰胺酶(N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase,NAAA)。

在其它实施方案中，所述酶为丝氨酸水解酶超家族的成员。丝氨酸水解酶包括在它们的活性位点含有丝氨酸残基的一类功能性水解酶。该类酶含有水解各种底物并因此具有不同生物作用的蛋白水解酶、酯酶和脂肪酶。可根据底物特异性或氨基酸相似性将该超家族中的蛋白质进一步分成亚家族(Puente&Lopez-Ont(1995)Cloning and Expression Analysis of a Novel HumanSerine Hydrolase with Sequence Similarity to Prokaryotic Enzymes Involved inthe Degradation of Aromatic Compounds J.Biol.Chem.270(21):12926-32).

与本发明相关的丝氨酸水解酶超家族的非限制性实例包括如下所述这些:丝氨酸蛋白酶(非限制性实例包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶)；细胞外脂肪酶(非限制性实例包括胰脂肪酶、肝脂肪酶、胃脂肪酶、内皮脂肪酶和脂蛋白脂肪酶)；细胞内脂肪酶(非限制性实例包括激素敏感性脂肪酶、单酰甘油脂肪酶、脂肪甘油三酯脂肪酶和二酰甘油脂肪酶)；胆碱酯酶(非限制性实例包括乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶)；小分子硫酯酶(非限制性实例包括脂肪酸合酶和酰基脂酰辅酶A硫酯酶；单酰甘油脂肪酶(MAGL)；多种磷脂酶(非限制性实例包括磷脂酶A2和血小板活化因子乙酰水解酶)；蛋白质和聚糖水解酶(非限制性实例包括蛋白磷酸酯甲基酯酶1、酰基氧基酰基水解酶和唾液酸乙酰酯酶)；多种肽酶(非限制性实例包括二肽基肽酶4、成纤维细胞激活蛋白和脯氨酰内肽酶)；和多种酰胺酶(非限制性实例包括FAAH)。

可水解所述键或连接物基团得到所述游离生物活性物的其它酶为丁酰胆碱酯酶、氨基酰基酶1(acy1)和L-天冬酰胺酰氨基水解酶。

在一个实施方案中，所述丝氨酸水解酶为脂肪酰胺水解酶(FAAH)。在另一个实施方案中，所述水解酶为N-酰基乙醇胺-水解酸性酰胺酶(NAAA)。

在另一个实施方案中，所述水解酶为N-酰基鞘氨醇酰氨基水解酶(酸性酰胺酶)。

在另一个实施方案中，所述水解酶为芳基甲酰胺酶(Afmid)。

在另一个实施方案中，所述二硫键细胞内还原成相应的硫醇类物质是经由一些巯基还原酶的作用发生的。对γ-干扰素-可诱导的溶酶体巯基还原酶的表征描述在Arunachalam et al,PNAS,2000,97,p.645-750中。

所使用的酶是细胞内的。因此，所述酶可被集中于核区室、溶酶体、内涵体、池内空间(intercisternal space)、任意细胞器和胞质溶胶。而且，可存在以下情况，其中，酶的一些复制体(copy)所在的区域不同于其它复制体所在的区域。

可用本发明治疗的病症包括但不限于炎症相关疾病。所述炎症可与炎症性疾病有关或与炎症导致的疾病有关。在身体组织有炎症的情况下可出现炎症性疾病。这些包括局部炎症性应答和全身炎症。所述疾病的实例包括但不限于:器官移植排斥；由器官移植导致的复氧损伤(Grupp et al.ProtectionAgainst Hypoxia-reoxygenation in the Absence of Poly(ADP-ribose)Synthetasein Isolated Working Hearts J.Mol.Cell.Cardiol.1999,31,297-03)，包括但不限于以下器官的移植:心脏、肺、肝脏和肾脏；关节的慢性炎症性疾病，包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎和与骨再吸收相关的骨疾病；炎症性肠病，非限制性实例包括回肠炎、溃疡性结肠炎、巴雷特氏综合征(Barrett's syndrome)和克罗恩病(Crohn's disease)；炎症性肺病，非限制性实例包括哮喘、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性气道疾病和囊性纤维化病；眼部的炎症性疾病，非限制性实例包括角膜营养不良、沙眼、盘尾丝虫病、葡萄膜炎、交感性眼炎和眼内炎；牙龈的慢性炎症性疾病，非限制性实例包括龈炎和牙周炎；肾脏的炎症性疾病，非限制性实例包括尿毒症并发症、肾小球肾炎和肾变病；皮肤的炎症性疾病，非限制性实例包括硬化性皮炎、银屑病和湿疹；中枢神经系统的炎症性疾病，非限制性实例包括神经系统的慢性脱髓鞘病、多发性硬化症、AIDS-相关神经变性和阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、感染性脑膜炎、脑脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、亨延顿氏舞蹈病(Huntington's disease)、肌萎缩性侧索硬化和病毒性或自身免疫性脑炎；代谢疾病、非限制性实例包括II型糖尿病；预防I型糖尿病；血脂障碍；甘油三酯血症；糖尿病性并发症，包括但不限于青光眼、视网膜病、黄斑水肿、肾病(例如微白蛋白尿和进行性糖尿病性肾病、多发性神经病、糖尿病性神经病、粥样硬化性冠状动脉病、外周动脉疾病、非酮性高血糖高渗性昏迷(nonketotic hyperglycemichyperosmolar coma)、单一神经病变、自主神经病、关节问题和皮肤或粘膜并发症，非限制性实例包括感染、胫斑(shin spot)、念珠菌感染或糖尿病脂性渐进性环死(necrobiosis lipoidicadiabeticorum)；免疫复合物血管炎、全身性红斑狼疮；和心脏的炎症性疾病，例如心肌病、缺血性心脏病、高胆固醇血症和动脉粥样硬化。

还包括可具有显著炎症性组分的多种其它疾病，非限制性实例包括先兆子痫；慢性肝衰竭、脑和脊索创伤和癌症。所述炎症性疾病也可为身体的全身性炎症，实例为革兰氏阳性或革兰氏阴性休克、出血性或过敏反应性休克或由癌症化疗在应答促炎症细胞因子时诱导的休克，非限制性实例为与促炎症细胞因子相关的休克。非限定举例而言，所述休克可以是由作为癌症治疗手段而被给药的化疗剂诱导的休克。其它障碍包括抑郁、肥胖症、变应性疾病、急性心血管事件、心律不齐、预防猝死、炎性肌病，非限制性实例包括皮肌炎、包涵体肌炎和多肌炎(olymyositis)和癌症恶病质。

本发明还涉及肌肉萎缩病和肌营养不良，包括但不限于迪谢内肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker MuscularDystrophy)、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy)、面肩肱肌营养不良、肢带型肌营养不良(Limb-girdle Muscular Dystrophy)、先天性肌强直病(Myotonia Congenita)和肌强直性营养不良(Myotonic Dystrophy)。

本发明还涉及侵扰器官的疾病。作为非限定实例，所述器官可为肝脏。因此，本发明可被用于各种类型的肝炎，包括但不限于非酒精性脂肪性肝病(NASH)。进一步，本发明涉及多种脂肪肝病。此外，本发明涉及肝硬化，包括但不限于原发性胆汁性肝硬变(PBC)。作为另一个非限制性实例，所述器官可为肾脏，并且本发明可用于治疗或预防各种肾病例如慢性肾病(CKD)、IgA肾病和肾病性胱氨酸病。

由手术和创伤引起的炎症也可用本发明的组合物和方法来治疗。

本发明一个实施方案为根据一种或多种胞内酶对键的作用关系来设计一种或多种连接物基团。因此，非限制性举例而言，包含共价结合生物活性物的化学键的键在本发明的范围内，所述化学键包括磷酸酯键、肽键、酰胺键、硫代酰胺键、酯键、磷酸二酯键、半缩醛键、醚键、硫醚键、二硫键、非酰胺的C-N键中的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明包括通过设计包含连接物基团的相连的生物活性物在受试者中治疗疾病，所述连接物基团包含键，其中连接物基团和/或键可受到在靶向病变组织中表达的胞内酶的作用。当所述胞内酶在所述靶向病变组织中表达并且所述相连的生物活性物被递送到该组织时，所述酶作用在连接物基团上，由此释放游离的生物活性物，所述游离的生物活性物在目标组织中累积，从而治疗疾病。一些病症使胞内酶的表达上调，而在其它病症中，一些酶的表达被上调，而其它酶的表达被下调。这种在一些组织中不同酶的同时上调和下调允许在连接物基团中选择性共同使用键和/或酶底物以递送恰好在那些组织中释放的相连的生物活性物。

FAAH与一些病症的关联的非限制实例在下面提供。目前有两种已知的人FAAH酶，它们共有20%序列同源性并且被称作FAAH-1和FAAH-2(Cravatt et al,J.Biological Chemistry2006,281,p.36569-36578)。

例如，已将FAAH的表达与神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病和亨延顿氏舞蹈病相关联。例如，在阿尔茨海默氏病的情况下，已在与伴随该疾病的炎症性过程相关的神经胶质细胞中观察到FAAH表达和活性的选择性增强。(Quinn&Wang(eds.),Lipids in Health和Disease,Volume49,Springer2008)。同样，在阿尔茨海默氏病中，FAAH在围绕神经斑的星形胶质细胞中是过表达的。(参见，例如，C.Benito,et al.(Dec.2003)J.Neuroscience23(35):11136-41)。

同样，已将FAAH表达与关节炎形式联系起来。例如，在一个报道中，在患有骨关节炎和类风湿性关节炎的患者的膝盖滑液中鉴别出FAAH表达(Richardson,et al.Characterisation of the Cannabinoid Receptor System inSynovial Tissue and Fluid in Patients with Osteoarthritis and RheumatoidArthritis Research&Therapy2008,10(2):R43)。

同样，已将FAAH的表达水平与一些癌症相关联。例如，已在前列腺癌组织中检测到与正常前列腺组织样品相比升高的FAAH蛋白表达(Endsleyet al.Expression和Function of Fatty Acid Amide Hydrolase in Prostate CancerInt.J.Cancer:123,1318-1326(2008))。进一步举例而言，在小鼠结肠致癌模型中，对FAAH的抑制通过增加细胞凋亡而增加了内源性大麻素浓度并降低了早期可识别的肿瘤性病变，这表明FAAH表达和活性可导致肿瘤发生(Izzo etal.Increased Endocannabinoid Levels Reduce the Development of PrecancerousLesions in the Mouse Colon.J Mol Med2007；86:89-98.)。

已将FAAH的表达水平与炎症相关联。在T-淋巴细胞中，FAAH的表达被瘦蛋白下调(瘦蛋白增加脂肪量并且脂肪中的炎症加剧)。(Maccarrone,M.et al.,Leptin Activates the Anandamide Promoter in Human T Lymphocytesthrough STAT3,Journal of Biological Chemistry,2003,278(11):13318-324。

在另一个实例中，在人败血症过程中，血浆FAAH水平上调(Tanaka M,et al.,The mRNA Expression of Fatty Acid Hydrolase in Human Whole BloodCorrelates with Sepsis.J Endotoxin Res2007,13:35-8)，并且当用LPS处理小鼠时，它们小肠中的FAAH表达增加(De Filippis,D.,et al.,Effect ofCannabidiol on Sepsis-induced Motility Disturbances in Mice:Involvement ofCB1Receptors和Fatty Acid Amide Hydrolase,Neurogastroenterol Motil(2008)20,919-927。

在另一个实例中，在脊髓损伤的大鼠中，FAAH表达下调但甘油一酯脂肪酶(MAGL)的表达是上调的，所述甘油一酯脂肪酶(MAGL)是脑中2-花生四烯酰甘油水解的主要贡献者(Garcia-Ovejero,D.et al,The EndocannabinoidSystem is Modulated in Response to Spinal Cord Injury in Rats,Neurobiology ofDisease2009,33:57-71。

在一些实施方案中，胞内酶在组织类型中的表达决定了对用作所述酶底物的一些连接物基团和/或连接物的选择。组织可为大量相连的细胞和/或细胞外基质物质。组织的非限制性实例为源自人和其它哺乳动物(作为非限制性实例)的皮肤组织、鼻道组织、CNS组织、神经组织、眼组织、肝脏组织、肾脏组织、胎盘组织、乳腺组织、胃肠组织、肌骨胳组织、生殖泌尿组织、骨髓等，并且包括与所述细胞和/或组织相关的连接物质和液体物质。

本领域技术人员熟悉可用于检测基因表达或蛋白表达与病症或组织类型的关联情况的技术。在一些实施方案中，所述基因表达或蛋白表达是在靶向病变组织中表达的具体酶的指示。作为非限制性实例，可使用免疫测定。免疫测定可包括对产生可测量结果的物质的任意分析或检查并包括抗体与抗原的关联。免疫测定依赖于产生信号以得到可测量结果(LefkovitsImmunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques,Vol1-4,Academic Press,Inc.,New York,1996)。作为非限制性实例，该信号可为放射性信号、比色信号、荧光信号、发光信号等。作为非限制性实例，可将所述信号与测定中的抗体、抗原、次级抗体或任意其它物质相关联。

可将免疫测定分类为竞争性的或非竞争性的。在一步法竞争性免疫测定中，测量未标记抗原与标记抗原竞争结合于抗体的结合位点(其以有限量存在)的能力。因此，所述信号与所述测定中未标记抗原的量负相关。两步法竞争性测定包括将重要未标记抗原与过量抗体一起孵育，随后引入标记的竞争性抗原。与一步法竞争性测定中一样，信号的量与未标记抗原的量负相关。非竞争性测定直接测量抗体与抗原的结合，因此提供信号量与所测量抗原量的正比例。这些免疫测定可为一步法或两步法并且包括夹心测定(Sandwichassay)。夹心测定通常包括结合于抗原的两种抗体，从而使所述抗原夹在所述两种抗体之间。通常，将所述抗体之一固定在固体载体上。

免疫测定也可为均质测定和异质测定。在前者中，直接在抗体-抗原复合物中进行测量，因此不需要将所述抗体-抗原复合物与其余的测定组分分离开。后者需要在测量前将所述抗体-抗原复合物从测定组分中分离出来。

非限制性示例性免疫测定为放射免疫测定，其中利用竞争性或非竞争性实验用放射性同位素检测分析物。另一种非限制性示例性免疫测定为酶法免疫测定，其中用酶产生检测标记。有用的酶包括碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶，并且所述信号可为颜色变化或发光。另一种非限制性示例性免疫测定为荧光免疫测定，其中用荧光标记作为信号；所述标记可在例如但不限于抗原或抗体上。荧光免疫测定的非限制性实例为荧光极化免疫测定，其利用了较大分子(例如，抗体和抗原的复合物)的慢速旋转并且使用光的极化以区分较慢的抗体-抗原复合物和较小的抗体或抗原分子。

限制性示例性免疫测定包括:比浊法；蛋白质印迹免疫沉淀作用(western blot immunoprecipitation)；染色质免疫沉淀作用；免疫扩散；奥克托洛尼双免疫扩散(Ouchterlony double immunodiffusion)；径向免疫扩散；免疫电泳法；对流免疫电泳法；ELISA；酶倍增免疫测定技术；RAST试验；凝集作用；血细胞凝集作用/血凝素(Coombs试验)；乳胶固定试验；浊度法；补体结合试验；免疫组织化学法；表位定位；皮肤变应性试验；和斑贴试验。用于所述方法的方案是本领域技术人员已知的。

其它蛋白表达测定也可用在本发明中。非限制性实例包括蛋白组学方法、质谱法和本领域技术人员已知的其它方法。

根据本申请提供的公开内容，本领域技术人员将会理解的是，一种或多种胞内酶的表达和/或活性水平也可通过确定编码所述一种或多种胞内酶的DNA或RNA的表达和/或活性水平来测量。此外，也可使用基于核酸的检测方法，例如RNA印迹、核酸酶保护测定、原位杂化和聚合酶链式反应(PCR)测定等。例如，实时聚合酶链式反应(RT-PCR)可用于检测一种或多种胞内酶的表达水平。此外，细胞中一种或多种胞内酶的活性水平也可通过确定受一种或多种胞内酶的活性影响的各种参数的水平来评估，例如(作为非限制性实例)底物的水平。因此，根据本申请提供的大量披露内容，本领域技术人员将会理解的是，存在多种可用于评估一种或多种胞内酶的表达水平的方法。

本发明另一个实施方案涉及测定一些酶在病症和组织环境中的功能状态，目的是为了根据所述酶选择适当的键和根据待治疗的疾病选择生物活性物。多种蛋白受到许多种翻译后机制的调节，鉴于这样的事实，蛋白质丰度测定可能不总是与蛋白活性有关联。例如，一些蛋白质例如酶经受修饰。例如，酶的活性位点仅代表所述蛋白整个表面的一小部分。该活性位点的化学性质和反应性是受所述位点的局部环境控制的，并且所述活性位点的化学性质和反应性是由其氨基酸组成和其三维结构所赋予的。酶的活性位点的形状和/或暴露可由任意数目的生物事件来调节。在多种情况下，酶的活性位点可被天然抑制剂遮蔽。可选择地，可通过变构辅助因子的作用使所述活性位点的形状更利于活性。因此，只测量蛋白质丰度可能不能说明酶的活性位点的状态，并因此也不能说明所述酶的功能状态。

因此，基于活性的蛋白质分布(activity-based protein profiling)(ABPP)系统可用在本发明中，其中活性位点导向的探针用于记录整个蛋白质组中蛋白质活性的变化(美国专利申请2002/0182652和Liu,et al.Activity-Based ProteinProfiling:The Serine Hydrolases Proc.Nat'l Acad.Sci199996(26):14694-99)。ABPP探针标记活性酶，但不标记它们的无活性前体或抑制剂结合形式，并因此报告在体内调节酶功能的主要翻译后事件(Jessani&Cravatt TheDevelopment和Application of Methods for Activity-Based Protein Profiling.Curr.Opin.Chem.Biol.2004,8,54-59)。ABPP探针通常包括三个部分:结合基团，其促进与具体种类的酶的活性位点的相互作用；反应基团，其共价标记这些活性位点；和报道基团(例如，荧光团,生物素)，其用于使探针-标记的酶可视化和将其亲和纯化。

本发明该方面的另一个实施方案为胞内酶抑制剂用于确定相连的生物活性物对特异性胞内酶就治疗疾病的功效具有依赖性的用途。

在一些实施方案中，FAAH为靶向的胞内酶并且有用的FAAH抑制剂的非限制性实例包括苯甲磺酰氟(PMSF)、甲氧基花生四烯酰基三氟膦酸盐(MAFP)、花生四烯酰基三氟甲基酮(ATMK)、URB532、URB597、PF-622、PF-3845和PF-750(参见，例如Ahn K、et al.(Nov.2007)Novel MechanisticClass of Fatty Acid Amide Hydrolase Inhibitors with Remarkable SelectivityBiochemistry46(45):13019-30)。塞来考昔(CELEBREX(R)；4-[[5-(对甲苯基)-3-(三氟甲基)-lH-吡唑-1-基]]苯磺酰胺)(美国专利5,466,823)和伐地考昔(BEXTRA(R)；4-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)苯磺酰胺)(美国专利5,633,272)也有效抑制FAAH。

可逆和不可逆抑制剂都在本发明范围内。因此，本申请包括通过在活性位点共价连接催化性亲和团Ser-241而不可逆地抑制FAAH的亲电试剂(参见Kathuria,et al,Modulation of Anxiety Through Blockade of AnandamideHydrolysis,Nature Medicine,2003,9(1):76-81；Patricelli,et al.Chemical和Mutagenic Investigations of Fatty Acid Amide Hydrolase:Evidence for a Familyof Serine Hydrolase with Distinct Catalytic Properties,Biochemistry,1999,38(31):9804-12；Boger,et al,Exceptionally Potent Inhibitors of Fatty AcidAmide Hydrolase:the Enzyme Responsible for Degradation of EndogenousOleamide和Anandamide,Proc Nat'l Acad Sci2000,97(10):5044-49)。同样，已鉴别出可逆性FAAH抑制剂并发现其在疼痛的动物模型中是有效的(参见，Boger,et al,Discovery of a Potent,Selective,and Efficacious Class ofReversible-Ketoheterocycle Inhibitors of Fatty Acid Amide Hydrolase Effectiveas Analgesics,J.Med.Chem.,2005,48:1849-1856)。

在一些实施方案中，巯基还原酶参与在所述生物活性物的酶法释放中并且多种巯基还原酶抑制剂可被用于检查所述水解过程。多种硫氧还蛋白还原酶抑制剂已报道在S.Urig和K.Becker,Seminars in Cancer Biology2006,16,p.452-465和Klossowski et al,J.Med.Chem.2012,55,p.55-67中，将这两篇文献的内容全部并入本申请作为参考。其它二硫键-还原酶抑制剂例如氯米帕明和米帕林也已描述在Schirmer et al,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,p.141-154中，将这该文献的内容全部并入本申请作为参考。

另一个实施方案为适当的(一种或多种)胞内酶在治疗病症中的用途，所述胞内酶断裂连接两个或更多个生物活性物分子的连接物基团。

在一些实施方案中，两个相同的生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，不止两个的相同生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，不止三个的生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，不止四个的生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，两个或更多个不同的生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，三个或更多个不同的生物活性物连接在一起。在一些实施方案中，四个或更多个不同的生物活性物可连在单一相连的生物活性物中。

在一些实施方案中，根据生物活性物抗具体疾病的用途来选择所使用的生物活性物。例如，在以本申请所述方式治疗具体疾病中，可通过参考科技文献、FDA橙皮书(FDA Orange Book)、美国药典(United States Pharmacopeia)或本领域已知的一些其它资源来确立所使用的生物活性物的性质(identity)。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物来自降胆固醇药家族。降胆固醇药的非限制性实例为阿伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、依泽替米贝和依泽替米贝/辛伐他汀组合

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为贝特类药物或降血脂药。贝特类药物或降血脂药的非限制性实例为阿昔呋喃、阿昔莫司、苄氯贝特、苯扎贝特、比尼贝特、环丙贝特、氯贝丁酯、考来维仑、吉非贝齐、非诺贝特、甲亚油酰胺、烟酸和罗纳贝特(ronafibrate)。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗糖尿病药。抗糖尿病药的非限制性实例为二甲双胍和吡格列酮。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗癫痫药。抗癫痫药的非限制性实例包括加巴喷丁和普瑞巴林。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗青光眼药。抗青光眼药的非限制性实例包括比马前列素(bimatroprost)、拉坦前列素、他氟前列素(tafluprost)和曲伏前列素。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗高血压药。抗高血压药的非限制性实例包括阿拉普利、阿夫唑嗪、阿利吉仑、苯磺酸氨氯地平、氨磺洛尔、阿雷地平、阿罗洛尔HCl、阿折地平、盐酸巴尼地平、盐酸贝那普利、盐酸贝尼地平、倍他洛尔HCl、贝凡洛尔HCl、富马酸比索洛尔、波吲洛尔、波生坦、布屈嗪、布那唑嗪HCl、坎地沙坦、卡托普利、卡维地洛、塞利洛尔HCl、西氯他宁、西拉普利、西尼地平、氯维地平、地拉普利、地来洛尔、甲磺酸多沙唑嗪、依福地平、马来酸依那普利、依那普利拉、依普利酮、依普罗沙坦、非洛地平、甲磺酸非诺多泮、福辛普利钠、硫酸胍那决尔、咪达普利HCl、依贝沙坦、伊拉地平、酮色林、拉西地平、乐卡地平、赖诺普利、氯沙坦、盐酸马尼地平、盐酸咪拉地尔、莫索尼定、奈必洛尔、尼伐地平、尼普地罗、尼索地平、奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)、培哚普利、吡那地尔、喹那普利、雷米普利、利美尼定、螺普利HCl、替米沙坦、替莫普利(temocarpil)、特拉唑嗪HCl、特他洛尔HCl、噻美尼定HCl、盐酸替利洛尔、群多普利、曲前列尼尔钠(treprostinil sodium)、曲马唑嗪HCl、缬沙坦和佐芬普利钙。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗炎药。抗炎药的非限制性实例包括布洛芬、萘普生、吲哚美辛、水杨酸(SA)、双水杨酯、5-氨基水杨酸(5-ASA)、二甲基富马酸盐、单甲基富马酸盐(MMF)、甲氨蝶呤、泼尼松和丙酸氟替卡松。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗抑郁药。抗抑郁药的非限制性实例包括丁氨苯丙酮HCl、西酞普兰、去甲文拉法辛(desvenlafaxine)、氟西汀HCl、马来酸氟伏沙明、美他帕明、米那普仑、米氮平、吗氯贝胺、奈法唑酮、帕罗西汀、匹伐加宾、瑞波西汀、司普替林、舍曲林HCl、噻奈普汀钠、托洛沙酮和文拉法辛。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗癌药。抗癌药的非限制性实例包括氯尼达明、多西紫杉醇、伏立诺他(vorinostat)和米托蒽醌HCl。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为免疫抑制剂。免疫抑制剂的非限制性实例包括麦考酚酸、霉酚酸钠和麦考酚酸莫酯。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为用于治疗骨质疏松的药物。用于治疗骨质疏松的药物的非限制性实例包括雷洛昔芬HCl、拉索昔芬和巴多昔芬(bazedoxifene)。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为用于治疗多发性硬化症的药物。用于治疗多发性硬化症的药物的非限制性实例包括二甲基富马酸盐、单甲基富马酸盐、芬戈莫德(fingolimod)、特立氟胺、拉喹莫德(laquinimod)、克拉屈滨和米托蒽醌HC1。

在一些实施方案中，所使用的生物活性物为抗病毒药。抗病毒药的非限制性实例包括阿扎那韦(atazanavir)、安泼那韦、印地那韦、咪喹莫特、洛匹那韦、奈非那韦(nelfmavir)、奥塞米韦、利托那韦、沙奎那韦、金刚乙胺、地瑞纳韦(darunavir)、博赛泼维(boceprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、扎那米韦、拉尼娜米韦(laninamivir)、帕拉米韦(peramivir)、PSI-7977、阿巴卡韦、阿德福韦二匹伏酯、西多福韦、去羟肌苷、恩曲他滨、恩替卡韦、拉米夫定、泛昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、索立夫定、扎西他滨、司他夫定、齐多夫定(AZT)、克来夫定和替比夫定(telbivudine)。

在一些实施方案中，对相连的生物活性物中的所述连接物基团的性质进行设计。对该连接物基团中化学基团的选择可受与病症或组织类型相关的一种或多种胞内酶的性质的驱动。

在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个酰氨基团。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个酯基。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个二硫基。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个氨基甲酸酯基。

在一些实施方案中，所述连接物包含至少两个酰氨基团。在一些实施方案中，所述连接物包含至少两个酯基。在一些实施方案中，所述连接物包含至少两个醚基。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个酰胺和至少一个酯。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个酰胺和至少一个醚。在一些实施方案中，所述连接物包含至少一个酯和至少一个醚。

相连的生物活性物的非限制性实例披露在美国2010/0041748；美国2010/0184730；美国2011/0053990；2011年1月7日提交的美国SN12/986,713；和PCT/US2011/026305中并且在下面描述。

式I化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自H、Cl、F、CN、NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-C(O)H、-C(O)C₁-C₃烷基、-C(O)OC₁-C₃烷基、-C(O)NH₂、-C(O)NH(C₁-C₃烷基)、-C(O)N(C₁-C₃烷基)₂、-C₁-C₃烷基、-O-C₁-C₃烷基、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基、二氟苯基和三氟甲基；

W₁和W₂各自独立地不存在、或者为O或NH，或者当W₁和W₂都为NH时，则W₁和W₂二者可一起形成哌啶部分；

每个符号-----表示任选的键，当其存在于酚羟基氧和含有取代基a的亚甲基之间时，要求Q是不存在的，或者当其存在于取代基a和含有取代基a的亚甲基的碳之间时，要求Q是存在的；

每个a和c独立地为H、CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个b独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，或者当两个R₇基团与它们连接的氮一起时可形成杂环；

每个R₈独立地为e、H或直链或支链C₁-C₁₀，其可任选取代有OH、NH₂、CO₂R、CONH₂、苯基、C₆H₄OH、咪唑或精氨酸；

每个R独立地为H、–C₁-C₃烷基或任选取代有OH或卤素的直链或支链C₁-C₄烷基；

每个Z独立地为H，或者

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2或3；

每个s独立地为5或6；

w为0或1；

每个t独立地为0或1；

Q不存在、或者为C(O)CH₃、Z、

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

W₃不存在、或者为-O-或–N(R)-；和

T为H、C(O)CH₃或Z；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，w为1和Z为

时，

则t必须为0；和

当w为0时，则W₁为O或NH。

式II化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

R₁、R₃和R₄各自独立地选自H、Cl、F、CN、NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-C(O)H、-C(O)C₁-C₃烷基、-C(O)OC₁-C₃烷基、-C(O)NH₂、-C(O)NH(C₁-C₃烷基)、-C(O)N(C₁-C₃烷基)₂、-C₁-C₃烷基、-O-C₁-C₃烷基、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基、二氟苯基和三氟甲基；

每个W₁、W_1’、W₂和W_2’独立地不存在、或者为O或NH，或者当W₁和W₂或者W_1’和W_2’都为NH时，则W₁和W₂二者或W_1’和W_2’二者可一起形成哌啶部分；

每个a、a’、c和c’独立地为H、CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个b和b’独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d和d’独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、n’、o、o’、p、p’、q和q’独立地为0或1；

每个L和L’独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

每个m和m’独立地为0、1、2、3、4或5；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，或者两个R₇基团当与它们连接的氮一起时可形成杂环；

每个Z和Z’独立地为H或

条件是在所述化合物中具有至少一个：

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

w为0或1；

u为0或1；

Q不存在、或者为C(O)CH₃、Z、

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

W₃不存在、或者为-O-或–N(R)-；和

T为H、C(O)CH₃或Z；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，w为1，和Z为

时，

则t必须为0；

当m’、n’、o’、p’和q’各自为0，u为1，W_1’和W_2’各自不存在和Z’为

时，

则t必须为0；

当w为0时，则W₁为O或NH；和

当w为1，Z为

和r为7时，则t为1。

式III化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

R₁、R₂和R₃各自独立地选自-H、-D、-Cl、-F、-CN、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-C(O)H、-C(O)C₁-C₃烷基、-C(O)OC₁-C₃烷基、-C(O)NH₂、-C(O)NH(C₁-C₃烷基)、-C(O)N(C₁-C₃烷基)₂、-C₁-C₃烷基、-O-C₁-C₃烷基、-S(O)C₁-C₃烷基和-S(O)₂C₁-C₃烷基；

W₁和W₂各自独立地不存在、或者为O、S、NH、NR，或者W₁和W₂可一起形成咪唑烷或哌嗪基团，条件是W₁和W₂不可同时为O；

每个a、b、c和d独立地为-H、-D、-CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)OR或-O-Z或苄基，或者a、b、c和d中的两个可与它们连接的单个碳一起形成环烷基或杂环；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，或者两个R₆基团当与它们连接的氮一起时可形成杂环；

每个R₈独立地为e、H或直链或支链C₁-C₁₀烷基，其可任选取代有OH、NH₂、CO₂R、CONH₂、苯基、C₆H₄OH、咪唑或精氨酸；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z独立地为-H或者

或者

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

R₅和R₆各自独立地为氢、氘、-C₁-C₄烷基、-卤素、-OH、-C(O)C₁-C₄烷基、-O-芳基、-O-苄基、-OC(O)C₁-C₄烷基、-C₁-C₃烯基、-C₁-C₃炔基、-C(O)C₁-C₄烷基、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-SH、-S(C₁-C₃烷基)、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基；和

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时

则t必须为0；和

当m、n、o、p和q中的每个为0，和W₁和W₂各自不存在时，则Z必须不是

式IV化合物和式V化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个W₁、W₂、W₁′和W₂′独立地不存在、或者为O、S、NH或NR，或者W₁和W₂或W₁′和W₂′可一起形成任选取代的咪唑烷或哌嗪基团；

每个a、b、c、d、a′、b′、c′和d′独立地为-H、-D、-CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)OR、-O-Z或苄基，或者a、b、c和d中的两个或a′、b′、c′和d′中的任意两个可与它们连接的单个碳一起形成环烷基或杂环；

每个n、o、p、q、n′、o′、p′和q′独立地为0、1或2；

每个L和L′独立地不存在、或者为-O-、-C(O)-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、-(C₁-C₆烷基)-、-(C₃-C₆环烷基)-、杂环、杂芳基,

其中，L和L′的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L和L′的左侧或右侧可分别与式IV或式V化合物的W₁或W₁′侧相连；

每个R₉独立地为-H、-D、-C₁-C₄烷基、-卤素、氰基、氧代、硫羰基、-OH、-C(O)C₁-C₄烷基、-O-芳基、-O-苄基、-OC(O)C₁-C₄烷基、-C₁-C₃烯基、-C₁-C₃炔基、-C(O)C₁-C₄烷基、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-SH、-S(C₁-C₃烷基)、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

每个m和m′独立地为0、1、2或3；如果m或m′大于1时，则L或L′可为相同或不同的；

每个m1独立地为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个R₇独立地为H或任选取代的C₁-C₆烷基，其中C₁-C₆烷基的亚甲基单元可任选被O或NR替代，并且在NR₇R₇中，两个R₇当与它们连接的氮一起时可形成杂环例如吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪或吡咯；

每个Z和Z′独立地为H、

条件是

在所述化合物中具有至少一个

每个t独立地为0或1；

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个v独立地为1、2或6；

每个R₁和R₂独立地为-H、-D、-C₁-C₄烷基、-卤素、-OH、-C(O)C₁-C₄烷基、-O-芳基、-O-苄基、-OC(O)C₁-C₄烷基、-C₁-C₃烯基、-C₁-C₃炔基、-C(O)C₁-C₄烷基、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-SH、-S(C₁-C₃烷基)、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个R独立地为-H或任选取代有OH或卤素的直链或支链C₁-C₄烷基；

条件是

当m、n、o、p和q中的每个为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0；

当m′、n′、o′、p′和q′中的每个为0，W₁′和W₂′各自不存在，和Z′为

时，

则t必须为0；和

当m、n、o、p和q中的每个为0，和W₁和W₂各自不存在，或者当每个m′、n′、o′、p′和q′中的每个为0，W₁′和W₂′各自不存在时，则Z或Z′必须不是

式VI化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

W₁和W₂各自独立地为O、S、NH、NR，或者W₁和W₂可一起形成咪唑烷或哌嗪基团；

条件是W₁和W₂不能同时为O，并且W1和W2中的一个为NH或NR；

每个a、b、c和d独立地为-H、-D、-CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)OR、-O-Z或苄基，或者a、b、c和d中的两个可与它们连接的单个碳一起形成环烷基或杂环；

每个n、o、p和q独立地为0、1或2；

L独立地不存在、或者为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、-(C₁-C₆烷基)-、-(C₃-C₆环烷基)-、杂环、杂芳基、

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式VI化合物的W₁侧相连；

R₉独立地为-H、-D、-C₁-C₄烷基、-卤素、氰基、氧代、硫羰基、-OH、-C(O)C₁-C₄烷基、-O-芳基、-O-苄基、-OC(O)C₁-C₄烷基、-C₁-C₃烯基、-C₁-C₃炔基、-C(O)C₁-C₄烷基、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-SH、-S(C₁-C₃烷基)、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；如果m是大于1时，则L可为相同或不同的；

m1为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，所述C₁-C₆烷基任选取代有O或N，并且在NR₇R₇中，两个R₇当与它们连接的氮一起时可形成杂环例如吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪或吡咯；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z和Z’独立地为-H或者

条件是在所述化合物中具有以下基团中的至少两个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

R₅和R₆独立地为-H、-D、-C₁-C₄烷基、-卤素、-OH、-C(O)C₁-C₄烷基、-O-芳基、-O-苄基、-OC(O)C₁-C₄烷基、-C₁-C₃烯基、-C₁-C₃炔基、-C(O)C₁-C₄烷基、-NH₂、-NH(C₁-C₃烷基)、-N(C₁-C₃烷基)₂、-NH(C(O)C₁-C₃烷基)、-N(C(O)C₁-C₃烷基)₂、-SH、-S(C₁-C₃烷基)、-S(O)C₁-C₃烷基、-S(O)₂C₁-C₃烷基；和

每个R独立地为-H、-C₁-C₃烷基或任选取代有OH或卤素的直链或支链C₁-C₄烷基；

进一步的条件是所述化合物不是

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸{2-[2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-乙基氨基]-乙基}-酰胺(A)；(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸{2-[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙基氨基]-乙基}-酰胺(B)；(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸{2-[2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-乙氧基]-乙基}-酰胺(C)；(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸{2-[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙氧基]-乙基}-酰胺(D)；(S)-2,6-二-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-己酸(E).

式化合物VII及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

W₁和W₂各自独立地不存在、或者为O、S、NH、NR，或W₁和W₂可一起形成咪唑烷或哌嗪基团，条件是W₁和W₂不能同时为O；

每个a、b、c和d独立地为-H、-D、-CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)OR或-O-Z或苄基，或a、b、c和d中的两个可与它们连接的单个碳一起形成环烷基或杂环；

每个n、o、p和q独立地为0、1或2；

每个L独立地不存在、或者为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、-(C₁-C₆烷基)-、-(C₃-C₆环烷基)-、杂环、杂芳基、

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式I的W₁侧相连；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m1为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z独立地为-H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0；和

当m、n、o、p和q各自为0，和W₁和W₂各自不存在时，则Z必须不是

进一步的条件是所述化合物不是二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-1-(2-(1-(4-氯苯甲酰基)-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙酰氧基)乙基酯或5-((S)-1,2-二硫杂环戊烷-3-基)-N-(2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)戊酰胺。

式Ia化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

W₁和W₂各自独立地不存在、或者为O或NH，或当W₁和W₂都为NH时，则W₁和W₂二者可一起形成哌啶部分；

每个b独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，或两个R₇基团当与它们连接的氮一起时可形成杂环；

每个Z独立地为H或

每个r独立地为2或3；

每个s独立地为5或6；

每个t独立地为0或1，和

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂不能都不存在；和

当W₁和W₂各自不存在，m、n、o、p和q中的一个必须为至少1。

式Ib化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个b独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；

每个R独立地为H、–C(O)-C₁-C₃烷基或直链或支链C₁-C₄烷基，其任选取代有OR、NR₂或卤素；

每个Z独立地为H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2或3；

每个s独立地为5或6；

每个t独立地为0或1；和

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0。

在另一个方面中，式Ic化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

W₁和W₂各自独立地不存在、或者为O或NH，或当W₁和W₂都为NH，则W₁和W₂二者可一起形成哌啶部分；

每个b独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m为0、1、2、3、4或5；

每个R独立地为H、–-C₁-C₃烷基或任选取代有OH或卤素的直链或支链C₁-C₄烷基；

每个Z独立地为H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2或3；

每个s独立地为5或6；

每个t独立地为0或1；

Q不存在、或者为H、C(O)CH₃、Z或

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

W₃不存在、或者为-O-或–N(R)-；和

T为H、C(O)CH₃或Z；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时

则t必须为0。

式IVa化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个W₁和W₂独立地不存在、或者为O、S、NH或NR，或W₁和W₂可一起形成任选取代的咪唑烷或哌嗪基团；

每个a、b、c和d独立地为-H、-D、-CH₃、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)OR或苄基，或a、b、c和d中的两个可与它们连接的单个碳一起形成环烷基或杂环；

每个n、o、p、q独立地为0、1或2；

每个L独立地不存在、或者为-O-、-C(O)-,-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S-S-、-(C₁-C₆烷基)-、-(C₃-C₆环烷基)-、杂环、杂芳基、

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式IVa化合物的W₁侧相连；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

每个m独立地为0、1、2、3、4或5；如果m是大于1时，则L可为相同或不同的；

每个m1独立地为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个R独立地为-H或任选取代有OH或卤素的直链或支链C₁-C₄烷基。

式IVb化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个n、o、p、q独立地为0、1或2；

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式IVb化合物的W₁侧相连；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

每个m独立地为0、1、2或3；如果m是大于1时，则L可为相同或不同的；

每个m1独立地为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

式IVc化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个n、o、p、q独立地为0、1或2；

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式IVc化合物的W₁侧相连；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

每个m1独立地为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个R₇独立地为H或任选取代的C₁-C₆烷基，其中C₁-C₆烷基的亚甲基单元可任选被O或NR替代，并且在NR₇T₇中，两个R₄当与它们连接的氮一起时可形成杂环例如吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪或吡咯；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

式VIIa化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个n、o、p和q独立地为0、1或2；

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式VIIa化合物的W₁侧相连；

每个g独立地为2、3或4；

每个h独立地为1、2、3或4；

m1为0、1、2或3；

k为0、1、2或3；

z为1、2或3；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z独立地为-H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0；和

式Id化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个b独立地为H、CH₃、C(O)OH、O-Z、C(O)OR或苄基；

每个d独立地为H、C(O)OH、C(O)OR或苄基；

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为

m为0、1、2、3、4或5；

每个R₈独立地为e、H或直链或支链C₁-C₁₀其可任选取代有OH、NH₂、CO₂R、CONH₂、苯基、C₆H₄OH、咪唑或精氨酸；

每个Z独立地为H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2或3；

每个s独立地为5或6；

每个t独立地为0或1；和

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时

则t必须为0。

式III-a化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体

其中

每个n、o、p和q独立地为0或1；

每个L独立地为

m为0、1、2、3、4或5；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，或两个R₆基团当与它们连接的氮一起时可形成杂环；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z独立地为-H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0；和d

式IV-d化合物及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个n、o、p、q独立地为0、1或2；

每个L独立地为

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式IV-d化合物的W₁侧相连；

每个m1独立地为0、1、2或3；

每个R₈独立地为e、H或直链或支链C₁-C₁₀烷基其可任选取代有OH、NH₂、CO₂R、CONH₂、苯基、C₆H₄OH、咪唑或精氨酸；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

式化合物VII-b及其药用盐、水合物、溶剂化物、前药、对映异构体和立体异构体:

其中

每个n、o、p和q独立地为0、1或2；

每个L独立地为

其中，L的表示方式在方向上不限于所描绘的那样是从左到右的，而是L的左侧或右侧可与式VII-b化合物的W₁侧相连；

m1为0、1、2或3；

每个R₇独立地为H或C₁-C₆烷基，所述C₁-C₆烷基任选被O或N取代，并且在NR₇R₇中，两个R₇当与它们连接的氮一起时可形成杂环例如吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪或吡咯；

每个e独立地为H或天然存在的氨基酸的侧链中的任一个；

每个Z独立地为-H或

条件是在所述化合物中具有至少一个

每个r独立地为2、3或7；

每个s独立地为3、5或6；

每个t独立地为0或1；

每个v独立地为1、2或6；

条件是

当m、n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和Z为

时，

则t必须为0；和

式I、II、III、IV、V、IV、Ia、Ib、Ic、IVa、IVb、IVc和VIIa的具体示例性实施方案如下所述:

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为0，n和o各自为1，和p和q各自为0。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，和L为O。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，和L为–S-S-。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n和o各自为0，p和q各自为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，k为O，n和o各自为0，p和q各自为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n和o各自为1，p和q各自为0，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，k为0，n为1，o、p和q各自为0，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o和p各自为0，和q为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，k为1，n、o和p各自为0，和q为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n为1，和o、p和q各自为0，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，k为1，o、p和q各自为0，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为0，k为1，o和p各自为1，和q为0。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为0，n、o、p和q各自为1。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为0，n和o各自为1，p和q各自为0，和每个a为CH₃。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为0，n和o各自为1，p和q各自为0，和每个b为CH₃。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，R₃为H，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n，p和q各自为1，和o为2，R₄为H，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p各自为1，和q为2，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n和p各自为1，和o和q各自为0，和L为–C(O)-。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n和p各自为1，和o和q各自为0，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p、q各自为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，h为1，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p和q各自为1，和L为-S-。

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为1，n、o、p各自为0，q为1，一个d为-CH₃，和L为

在一些实施方案中，W₁和W₂各自为NH，m为2，n、o、p和q各自为0，一个L为

和

一个L为

在一些实施方案中，m为0，n、o、p和q各自为0，和W₁和W₂一起形成任选取代的哌嗪基团。

在一些实施方案中，m为1，n、o、p和q各自为0，W₁和W₂各自不存在，和L为

在一些实施方案中，m为1，n和p各自为1，o和q各自为0，W₁和W₂各自为NH，和L为C₃-C₆环烷基。

在一些实施方案中，m为1，n为1，o、p和q各自为0，W₁和W₂各自为NH，和L为C₃-C₆环烷基。

在一些实施方案中，m为1，n、o、p各自为0，q为1，W₁和W₂各自为NH，和L为C₃-C₆环烷基。

在一些实施方案中，m为1，n、o、p和q各自为0，W₁为NH，W₂不存在，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p和q各自为0，W₁不存在，W₂为NH，和L为

在一些实施方案中，m为1，n为1，o、p和q各自为0，W₁为NH，W₂不存在，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p,各自为0，q为1，W₁不存在，W₂为NH，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p各自为0，q为1，W₁不存在，W₂为NH，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p、q各自为0，W₁和W₂不存在，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p、q各自为0，W₁为NH，W₂不存在，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p、q各自为0，W₁不存在，W₂为NH，和L为

在一些实施方案中，m为1，n、o、p各自为0，q为1，W₁和W₂各自为NH不存在，L为

在一些实施方案中，当W1和W2各自为NH，和n、o、p、q各自为0和m为3，则L基团中的至少两个必须为

在一些实施方案中，当W1和W2各自为NH，和n、o、p、q各自为0和m为4，则L基团中的至少两个必须为

在一些实施方案中，当W1和W2各自为NH，和n、o、p、q各自为0和m为5时，则L基团中的至少两个必须为

在一些实施方案中，当W1和W2各自为NH，m为2，和n、o、p、q各自为0时，则L为

和

其中R₇为H。

在其它示例性实施方案中，式I、II、III、IV、V、VI、Ia、Ib、Ic、IVa、IVb、IVc和VIIa的相连的生物活性物如下所述:

N-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-1)；

2-羟基-N-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-甲基二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)苯甲酰胺(I-2)；

N-(1-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基丙-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-3)；

N-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基丙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-4)；

N-(3-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基丁-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-5)；

2-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-3-苯基丙酰基氧基)苯甲酸乙酯(I-6)；

2',4'-二氟-4-羟基-联苯-3-羧酸[2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-乙基]-酰胺(I-7)；

2',4'-二氟-4-羟基-联苯-3-羧酸[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙基]-酰胺(I-8)；

N-(2-(2-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)二硫基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-9)；

2-羟基-N-(2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基乙基)苯甲酰胺(I-10)；

N-(1-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-2-甲基丙-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-11)；

(R)-3-[(R)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-2-甲氧基羰基-乙基二硫基]-2-(2-羟基-苯甲酰基氨基)-丙酸甲酯(I-12)；

(S)-6-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-(2-羟基苯甲酰氨基)己酸(I-13)；

N-(2-((2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-15)；

N-((S)-1-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-16)；

N-((S)-1-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-17)；

N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-18)；

N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-5-胍基戊酰氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-19)；

N-(2-((S)-5-胍基-2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)戊酰氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-20)；

N-((S)-1-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-21)；

N-((S)-5-胍基-1-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代戊-2-基)-2-羟基苯甲酰胺(I-22)；

5-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-2-羟基苯甲酸(II-1)；

5-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-4-甲基戊酰氨基)-2-羟基苯甲酸(II-2)；

5-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-2-羟基苯甲酸甲基酯(II-4)；

5-((2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙氧基)羰基)-2-羟基苯甲酸甲基酯(II-5)；

N-(2-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基乙基)吡啶-3-甲酰胺(III-1)；

N-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)吡啶-3-甲酰胺(III-2)；

(S)-6-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-(吡啶-3-甲酰氨基)己酸(III-3)；

N-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基-2-甲基丙基)吡啶-3-甲酰胺(III-4)；

N-(4-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基丁基)吡啶-3-甲酰胺(III-5)；

N-(1-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基-2-甲基丙-2-基)吡啶-3-甲酰胺(III-6)；

N-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)-N-甲基吡啶-3-甲酰胺(III-7)；

N-(1-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基-2-甲基丙-2-基)吡啶-3-甲酰胺(III-8)；

N-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-甲基二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)吡啶-3-甲酰胺(III-9)；

(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-1-(4-烟酰基哌嗪-1-基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯-1-酮(III-10)；

N-((S)-1-((2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)吡啶-3-甲酰胺(III-11)；

N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)吡啶-3-甲酰胺(III-12)；

(E)-4-(2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲基酯(IV-1)；

(E)-4-(4-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基哌嗪-1-基)-4-氧代丁-2-烯酸甲基酯(IV-2)；

(E)-4-(2-((2-(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基乙基)(甲基)氨基)乙基氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲基酯(IV-3)；

(E)-4-(((S)-1-((2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲基酯(IV-4)；

(E)-4-((2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲基酯(IV-5)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-[4-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基)-哌嗪-1-基]-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯-1-酮(VI-1)；

(2S,3R)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-3-[(S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-丙酰基氧基]-丁酸甲酯(VI-2)；

(S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-5-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-戊酸(VI-3)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸[2-((R)-5-[1,2]二硫杂环戊烷-3-基-戊酰基氨基)-乙基]-酰胺(VI-4)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙基]-酰胺(VI-5)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸[2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰基氨基)-乙基]-酰胺(VI-6)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸{2-[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙基二硫基]-乙基}-酰胺(VI-7)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(VIIa-1)；

(2S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-6-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)己酸(VIIa-2)；

(2S)-6-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)-2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)己酸(VIIa-3)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)(甲基)氨基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(VIIa-4)；

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-((2S)-2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)丙酰氨基)乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(VIIa-5)；和

(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-((2S)-1-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(VIIa-6).

实施例

实施例1:Sprague-Dawley大鼠脑匀浆促进的相连的生物活性物的断裂

该测定的目的是测量在脂肪酰胺水解酶抑制剂URB597(从CaymanChemical获得，目录号为#10046)存在下Sprague-Dawley大鼠脑匀浆使相连的生物活性物水解的能力。从雄性Sprague-Dawley大鼠采集脑并以1:4(克:毫升)在20mM4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(pH7.0)中匀化。通过Bradford蛋白测定确定所述大鼠脑匀浆中的总蛋白质。

将相连的生物活性物溶解在甲醇中，浓度为50mM。用500μM化合物于反应缓冲液(50mM Hepes、1mM EDTA、0.1%Triton X100(pH8.0)和1mg/mL来自大鼠脑匀浆的总蛋白质)中来进行水解反应。将反应混合物在37℃孵育。反应物总体积为500μL。0小时、1小时、2小时和3小时后，通过将30μL反应混合物转移到含有100ng/mL内标化合物的200μL乙腈中来淬灭反应。反应在缺少和存在5μM FAAH抑制剂URB597的情况下进行。

大体上，相连的生物活性物母体和水解产物的水平用Agilent1260HPLC和带有电喷雾源的Agilent6410三重四级杆质谱仪来测量，并且使用多反应监测和相关质量/电荷转换。就具体的相连的生物活性物母体和相关水解产物选择甲醇和水的梯度。就每种具体的相连的生物活性物母体和相关水解产物确定注射体积和流速。

具体地，对于相连的生物活性物，将20μL样品注射到HPLC中，其中流动相流速设为0.9mL/分钟。使用以下甲醇和水梯度:

时间	甲醇％	水％
			0.01	70	30
0.5	70	30
			1	95	5
4	95	5
			4.01	70	30
4.7	70	30

将所述质谱仪上的气体温度设为350℃。毛细管电压设为4000。以下质量/电荷转换用于监测代谢物1(酶法水解产物)。

化合物名称	前体离子	产物离子	碎裂电压	碰撞能电压
					内标	515.4	205.1	135	30
代谢物1	179.1	93.1	102	21

用Agilent Masshunter Qualitative Analysis软件对代谢物1(酶法水解产物)峰进行积分。将积分值标准化为内标数据，生成质谱仪相对比例值(MS R.R)。用GraphPad Prism将这些值相对于时间作图。

时间(小时)代谢物1质谱R.R.代谢物1质谱R.R.

如图1中所示，该研究的结果证明大鼠脑匀浆使所述相连的生物活性物水解，该作用在FAAH抑制剂URB597存在下被基本消除。

实施例2:相连的生物活性物的治疗作用是协同的。

图2-6举例说明了相连的生物活性物母体的活性与它们相应的水解产物作为单独生物活性物给药时的活性的对比。

图2-6中所选择的实验显示本发明一些相连的生物活性物对RAW264.7巨噬细胞中NFκB水平的作用。

将转染有NFκB-驱动的荧光素酶受体的RAW264.7细胞置于96孔板中。将细胞用媒介物(0.1%乙醇)或试验化合物处理2小时。作为抑制NFκB信号传导的阳性对照，将6个孔用10μM地塞米松处理。然后将细胞在试验化合物的存在下用200ng/mL LPS刺激。将用媒介物处理的一亚组孔保留不用LPS刺激以确定所述测定的基础信号(floor signal)。NFκB驱动的荧光素酶活性是通过添加BriteLite荧光素酶试剂盒(PERKIN)显现的并且是用Victor V板读数器测量的。将每次处理的NFκB活性(荧光素酶活性)标准化为用LPS(%NFκB应答)处理的媒介物孔。AlamarBlue用于监测细胞活力以确保对荧光素酶信号的抑制不是由化合物毒性导致的。

通过NFκB测定证明的协同作用的实例显示在图2、4和5中。在图2中，化合物II-1为5-氨基水杨酸酯连ω-3脂肪酸(DHA)，并且在NFkB测定中表现出40-50μM的IC₅₀。然而，当分开使用5-氨基水杨酸酯和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至250μM的浓度未观察到活性。类似地，化合物I-1为水杨酸连DHA，并且在NFkB测定中表现出30-35μM的IC₅₀。然而，当分开使用水杨酸酯和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至250μM的浓度未观察到活性。在图4中，化合物IV-1为富马酸单甲酯连DHA，并且在NFkB测定中表现出16μM的IC₅₀。然而，当分开使用富马酸单甲酯和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至200μM的浓度未观察到活性。在图5中，化合物VI-5为EPA连DHA并且在NFkB测定中表现出63μM的IC₅₀。然而，当分开使用EPA和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至200μM的浓度未观察到活性。化合物VI-6为连在一起的两个DHA分子并且在NFkB测定中表现出68μM的IC₅₀。然而，当分开使用DHA或以化学计量2使用但无键连接时，在该测定中在高至200μM的浓度未观察到活性。

图2-6中所选的实验显示了相连的生物活性物对HepG2细胞中ApoB分泌的作用。

将HepG2细胞(ATCC)以10,000个细胞/孔接种在96孔板中。粘附过夜后，除去生长培养基(10%FBS于DMEM中)并将细胞在含有0.1%无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA,

)的DMEM中血清饥饿24小时。然后将细胞用化合物处理。将浓度为5mM的烟酸用作阳性对照。所有处理一式三份地进行。在用化合物处理的同时，通过添加0.1油酸酯复合无脂肪酸的BSA(5:1摩尔比例)来刺激ApoB分泌。移出培养基上清液并用EL为A试剂盒(MABTECH)测量ApoB浓度。通过将数据标准化为媒介物处理的孔来确定ApoB分泌的抑制百分比。对于给定的化合物，也可通过使用参数-拟合抑制曲线模型(GRAPH PAD

)来确定IC₅₀(ApoB分泌的50%受到抑制的浓度)。在每个实验中，用ATPlite1-步试剂盒(PERKIN

)确定细胞活力，从而可监测由于毒性引起的化合物作用。

通过ApoB测定证明的协同作用的实例显示在图3和5中。在图3中，化合物III-2为烟酸连DHA，并且在ApoB测定中表现出50μM的IC₅₀。然而，当分开使用烟酸和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至100μM的浓度未观察到活性。类似地，化合物III-1为烟酸连EPA，并且在ApoB测定中表现出50μM的IC₅₀。然而，当分开使用烟酸和EPA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至100μM的浓度未观察到活性。在图5中，化合物VI-1为DHA连EPA，并且在ApoB测定中表现出10μM的IC₅₀。然而，当分开使用EPA和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至100μM的浓度未观察到活性。

图2-6中所选的实验显示相连的生物活性物对IL-1β的作用。

将RAW264.7巨噬细胞以100,000个细胞/孔的密度接种在于补充有10%FBS和青霉素:链霉素的DMEM中的96-孔板中。16小时后，吸出培养基并置换为90μL/孔无血清DMEM。将相连的生物活性物吸收在100%乙醇中至浓度为100mM，然后在100%FBS中以1:100稀释，得到由1mM化合物和1%乙醇组成的原液。然后将这些原液在补充有1%乙醇的FBS中以1:10稀释，产生浓度为100μM的相连的生物活性物。然后向RAW246.7细胞中添加10μ稀释液以使相连的生物活性物的最终浓度为10μM或使每种生物活性物的浓度为10μM，随同一起的是仅为对照的媒介物。使相连的生物活性物预孵育2小时，然后用100ng/ml LPS(向每个孔中加入10μL1μg/ml的LPS)刺激。LPS刺激3小时后，将细胞用1x PBS洗涤一次，吸干并在液氮中快速冷冻。然后分离出RNA并用Cells to cDNA试剂盒

根据制造商的方案转化成cDNA。然后用Taqman引物/探针测定套盒(APPLIED

)测量IL-1β转录物水平，用deltaCt方法标准化为GAPDH，并且将数据相对于仅为对照的媒介物来表达。

通过该测定证明的协同作用的实例显示在图5中。化合物VI-2为EPA连DHA的并且在IL-1β测定中表现出10μM的IC₅₀。然而，当分开使用EPA和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至200μM的浓度未观察到活性。

图2-6中所选的实验显示相连的生物活性物对LTB₄的作用。

所述LTB₄测定是用商购试剂盒(CISBIO,Bedford,MA)在HL-60细胞中进行的。在37℃和5%CO₂，将HL-60细胞维持在补充有20%血清的IMEM中。每周更换培养基2次，并且保持细胞浓度为2x10⁵至1x10⁶个细胞/ml。

实验前，将细胞培养基更换为10%血清，并且使HL-60细胞在1.3%DMSO中分化3天。在第3天时，将细胞浓缩2倍于含有培养基的DMSO中，并且以1ml细胞悬浮液/孔置于24-孔板中。将BSA对照或在来自乙醇或DMSO原液的1%BSA中制备的CAT化合物加至所述细胞中并孵育21小时。第二天，将细胞转移到Eppendorf管中，以300g离心并在DPBS中冲洗一次。将细胞重新悬浮在含有2%FBS(测定缓冲液)的300μl DPBS中，并将80μl/孔置于96-孔板(黑色侧壁，透明底)中。一些孔用10μM NDGA(LOX抑制剂)预孵育。为了引发LTB₄分泌，将细胞用钙离子载体A23187(5μM)刺激15分钟。然后将板立即放在冰上并在4℃以1500g离心3分钟。通过来自CISBIO的均相时间分辨荧光(HTRF)LTB₄测定(384-孔板式)来评测上清液中的LTB₄含量。在96-孔板中通过CellTiter-Glo(Promega,Madison,WI)确定细胞活力。

通过该LTB₄测定证明的协同作用的实例显示在图6中。两个化合物VIIa-1和VIIa-2都是布洛芬连DHA，并且在该LTB₄测定中分别表现出2.2μM和1.6μM的IC₅₀。然而，当分开使用布洛芬和DHA或一起使用但无键连接时，在该测定中在高至100μM的浓度未观察到活性。

实施例3:FAAH和巯基还原酶促进的相连的生物活性物的断裂

证明巯基还原酶在释放相连的生物活性物中的应用的实例显示在图7A和7B中。该实施例中采用的二-脂肪酸相连的生物活性物为(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸{2-[2-((5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰基氨基)-乙基二硫基]-乙基}-酰胺(VI-7)。如上所讨论，一旦到达细胞内，化合物VI-7中的二硫键可经由溶酶体巯基还原酶的作用被还原成相应的巯基，并最终释放巯乙胺。巯乙胺随即可用于治疗肾病性胱氨酸病，这是一种以结晶胱氨酸在细胞内的过量累积为特征的罕见疾病。

大鼠肝脏溶胞产物水解实验在Eppendorf管中进行，该实验首先加入用于所述测定的必要量的水。从500mM HEPES和10mM EDTA/水制备的HEPES和EDTA的最终浓度分别为50mM和1mM的10x缓冲液。从-80℃贮存取出大鼠肝脏溶胞产物，解冻并在4000g离心5分钟。将一定体积的上清液转移到Eppendorf管中，得到测定中的最终浓度为的3mg/mL的大鼠肝脏溶胞产物。将所述管轻柔倒转以混合组分。然后将反应混合物放置在37℃孵育箱中，保持20分钟，以使反应混合物达到37℃，然后引发反应。

为了引发水解反应，从孵育箱中取出样品并加入本发明化合物，本发明化合物为DMSO溶液形式，并且是以允许<1%最终DMSO浓度和5μM最终化合物浓度的方式制备的。混合内容物，然后在时间点=0，立即将一定体积的反应混合物转移到乙腈冲击缓冲液(crash buffer)中，用于在LC/MS/MS上在线性范围内分析感兴趣的分析物。然后在需要的其它时间点(对于所使用的不同时间点，参见相应的图7A和7B)重复该过程。

该大鼠肝脏溶胞产物分析测定用于对二-脂肪酸相连的生物活性物水解成单独组分进行评估。作为示例性实例，在该大鼠肝脏溶胞产物测定中对二-脂肪酸胱胺相连的生物活性物VI-7进行评估。对于化合物VI-7，单独的组分为DHA、EPA、(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺、(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-巯基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺、胱胺和巯乙胺。在细胞内，VI-7的二硫键可经由溶酶体巯基还原酶的作用被还原成活性硫醇衍生物(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-(2-巯基乙基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺和(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-N-(2-巯基乙基)二十碳-5,8,11,14,17-五烯酰胺。通过进一步水解酰胺部分得到巯乙胺。细胞内释放巯乙胺有利于患有肾病性胱氨酸病的患者，这是因为巯乙胺与患有肾病性胱氨酸病的细胞内存在的胱氨酸形成混合型二硫键，从而除去有害的结晶胱氨酸。如图7A中所示，化合物VI-7在大鼠肝脏溶胞产物中显示出时间依赖性水解。图7B进一步显示在该大鼠肝脏溶胞产物测定中在不存在FAAH抑制剂PF-3845的情况下，从化合物VI-7时间依赖性形成巯乙胺。图7B还显示在FAAH抑制剂PF-3845存在下，由于脂肪酸部分的水解受到抑制，因此巯乙胺基本无增加。形成的巯乙胺量可通过LC-MS/MS通过用Ellman’s试剂进行初始衍生化来定量。通过先将39.6mg试剂(5,5’二硫-二(2-硝基苯甲酸))溶解在10ml HEPES缓冲液(0.01M,pH7)中来制备Ellmans试剂饱和溶液(10mM)。将50μl组织溶胞产物反应混合物转移到1.5mL Eppendorf管中并用50μl10mM Ellman’s试剂(5,5’二硫-二(2-硝基苯甲酸))对巯乙胺进行衍生化。将样品在室温孵育10分钟，涡动1分钟，然后通过添加300μl含有IS和0.2%丁羟茴醚(BHA)的乙腈进行蛋白质析出。将上清液转移到干净的LC小瓶中并将10μl样品注射到LC-MS/MS上以测量巯乙胺。通过LC-MS/MS测量巯乙胺的浓度。将经衍生化的样品(10μl)注射到柱(Luna,HILIC,150X4.60mm,3μPhenomenex)中。通过以下阶式梯度将巯乙胺-Ellmans复合物从所述柱上洗脱下来：在0分钟时10%流动相B，在2.5分钟时10%B，在2.7分钟时50%B，和在3分钟时10%B。流动相A为含有0.1%甲酸的乙腈/水/乙酸铵(20mM)，和流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈/乙酸铵(20mM)。将所述柱洗脱物直接注射到Agilent三重四级杆质谱仪中，将该质谱仪维持在电喷雾正离子模式。巯乙胺-Ellmans加合物的保留时间为1.76分钟。通过m/z274.8-229.9的跃迁(其中具有碰撞电压为62并且碰撞能量为10eV)来监测经衍生化的巯乙胺。将所述柱维持在25℃。

实施例4:单酰甘油脂肪酶促进的相连的生物活性物的断裂

水解实验牵涉单酰甘油脂肪酶(MAGL)，存在或不存在MAGL抑制剂。将来自Cayman(目录编号#705192)的商购单酰甘油(MAGL)试剂盒用于水解实验。所述水解在是在Eppendorf管中通过一起添加300μL10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2,1mM EDTA)、20μL DMSO和20μL人重组MAG-脂肪酶来进行的。将化合物II-1作为最后一个组分来添加，添加形式是20μL浓度为900μM的DMSO溶液，目的是使最终浓度为5μM。将所述Eppendorf管轻柔倒转以混合组分，然后放在37℃孵育箱中。在下面的每个时间点提取25μL样品:0、5、10、15和30分钟。通过LC/MS/MS方法使用适当的乙腈冲击液(crash)和内标分析每个样品中化合物II-1的剩余量。在单独的实验中，然后在MAGL抑制剂(化合物JZL184，以商购MAGL试剂盒形式提供)存在下重复所述水解。向Eppendorf管中装入300μL10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2,1mM EDTA)、20μL浓度为900μM的JZL184的DMSO溶液(目的是使最终浓度为5μM)和20μL人重组MAG-脂肪酶。将化合物II-1作为最后一个组分来添加，添加形式是20μL浓度为900μM的DMSO溶液，目的是使最终浓度为5μM。将所述Eppendorf管轻柔倒转以混合组分，然后放在37℃孵育箱中。在与上面所示相同的时间点提取25μL样品并通过LC/MS/MS分析化合物II-1的剩余量。如图8中所示，用人重组MAG-脂肪酶观察到化合物II-1的时间依赖性水解。在MAGL抑制剂JZL184存在下，化合物II-1的水解速度明显降低。

实施例5:在已过表达有FAAH-1或FAAH-2的COS-7细胞中脂肪酰胺水解酶促进的相连的生物活性物的断裂。

用过表达有FAAH-1或FAAH-2的COS-7细胞进行水解实验。为了获得已过表达有FAAH-1或FAAH-2的COS-7细胞，采用以下方案:将1.75x10⁶COS-7个细胞/板接种在10cm皿中。第二天，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)根据制造商的方案使细胞转染有10μg载体对照物即标志-FAAH-1或标志-FAAH-2质粒，一式两份。转染后24小时，将细胞在冷PBS中洗涤1次，吸干，然后在0.6mL反应缓冲液(50mM HEPES,pH9.0；1mMEDTA)存在下刮去所述板。然后将细胞用VWR VDI12Adaptable匀浆器匀浆，在冰上保持1分钟，然后通过在6,000g离心5分钟使样品澄清。然后将该经匀浆部分的上清液用于FAAH水解测定。为了评估在所述匀浆部分中存在的FAAH蛋白的量，将所述沉淀物随后依次用EBC、RIPA和10%SDS溶解，通过蛋白质印迹分析针对各缓冲溶液条件的上清液部分以及匀浆部分，用抗-FLAG抗体(Cell Signaling#2368)作探针。进行凝胶光密度法并根据标准操作确定在每个连续溶解条件下提取的%FAAH。

用含有过表达的FAAH-1或FAAH-2的COS-7细胞进行以下水解实验。使用两种抑制剂:FAAH-1特异性抑制剂PF-3845和FAAH-1/FAAH-2抑制剂URB597。使用化合物I-1并且观察到化合物I-1消失或观察到在COS-7细胞溶胞产物中出现DHA。对于含有过表达的FAAH-1的COS-7细胞，蛋白质浓度为1.03mg/mL。对于含有过表达的FAAH-2的COS-7细胞，蛋白质浓度为1.25mg/mL。简言之，所述水解实验是在Eppendorf管中进行的，使用与上述操作类似的操作。简言之，所述水解实验是在Eppendorf管中进行的。在37℃进行所述水解，使用50mM Hepes缓冲液(pH9.0)、1mM EDTA、化合物I-1以使最终浓度为5μM，并且使用PF-3845或URB597以使最终浓度为5μM。在时间=0、1和3小时，用乙腈使蛋白质析出。将样品离心并通过LC/MS/MS分析上清液中的化合物I-1或DHA，使用适当的内标。图9A总结了化合物I-1在过表达有FAAH-1的COS-7细胞中的水解。在不存在任何抑制剂的情况下，在实验进行过程中观察到化合物I-1的明显水解。通过添加5μM PF-3845或URB597可使该水解速度明显降低，因为这两种化合物都被已知为FAAH-1抑制剂。图9B总结了化合物I-1在过表达有FAAH-2的COS-7细胞中的水解。在FAAH-1/FAAH-2抑制剂URB597存在下，该水解过程显著减少。FAAH-1抑制剂PF-3845不如URB597有效。图9C总结了化合物在过表达FAAH-1的COS-7细胞中的相同水解；然而，在该实验中，监测了DHA的出现而不是I-1的消失。如图9C中所看到，存在时间依赖性形成DHA；并且该形成速度被PF-3845或URB597明显降低。图9D总结了使用过表达有FAAH-2的COS-7细胞的相同实验。在该实验中，FAAH-1/FAAH-2抑制剂URB597在所述实验进行过程中更有效地降低了DHA的形成。

实施例6:N-酰基乙醇胺-水解酸性酰胺酶促进的相连的生物活性物的断裂.

使用重组NAAA的水解实验，存在或不存在NAAA抑制剂。简言之，在Eppendorf管中准备反应混合物，先加入计算量的测定用水。然后使用由500mM Hepes和10mM EDTA/水组成的10x缓冲液，将一定体积的该10X缓冲液加至所述Eppendorf管中，从而对所述10x缓冲液进行10x稀释并使HEPES和EDTA的最终浓度分别为50mM和1mM。向反应混合物中加入DTT和NPO-40，使所得浓度分别为1mM和0.1%。从-80℃贮存取出NAAA酶(根据Ueda et al,Progress in Lipid Research2010,49,p.299-315中记录的操作来制备)，并在冰上解冻。将一定体积的酶转移到Eppendorf中，使其在测定中的最终浓度为10nM。然后将所述管轻柔倒转以混合组分。混合后，向反应混合物中加入NAAA抑制剂以形成5μM的最终浓度，最高1%DMSO(该套样品被称作+NAAA抑制剂)。将与加至+NAAA抑制剂样品中的NAAA抑制剂体积相同的一定体积DMSO加至–NAAA抑制剂中以用作媒介物对照。下面的NAAA抑制剂可用于该类型水解实验:(S)-N-(2-氧代环氧丙烷-3-基)-3-苯基丙酰胺(如Solorzano et al,J.Med.Chem.2010,53,p.5770-5781中所记载)。然后将全部反应混合物在37℃孵育箱中放置20分钟以使反应混合物达到37℃，然后引发反应。为了引发水解，从所述孵育箱取出所有样品并将所期望的化合物加至所有管中，最终浓度为5μM。混合，然后在时间点=0，将一定体积的反应混合物立即转移到冲击缓冲液中。所转移的体积和所使用的冲击液的体积依赖于所测试的具体分析物的质谱敏感性。冲击后，将所述样品在14,800g离心5分钟。将一部分上清液(100μL)转移至弹簧装载的HPLC嵌入物(spring loaded HPLC insert)并置于HPLC小瓶中。然后通过LC/MS/MS分析样品。然后在任意其它时间点重复该操作。

实施例7:芳基甲酰胺酶促进的相连的生物活性物的断裂.

用芳基甲酰胺酶进行水解实验。简言之，在Eppendorf管中准备反应混合物，先加入计算量的测定用水。然后使用由500mM Hepes和10mM EDTA/水组成的10x缓冲液，将一定体积的该10X缓冲液加至所述Eppendorf管中，从而对所述10x缓冲液进行10x稀释并使HEPES和EDTA的最终浓度分别为50mM和1mM。从-80℃贮存取出芳基甲酰胺酶(Brown et al,Canadian J.Microbiology1986,32,p.465-72)，并在冰上解冻。将一定体积的酶转移到Eppendorf中，使其在测定中的最终浓度为10nM。然后将所述管轻柔倒转以混合组分。然后将全部反应混合物在37℃孵育箱中放置20分钟以使反应混合物达到37℃，然后引发反应。为了引发水解，从所述孵育箱取出所有样品并加入所期望的脂肪酸连接的生物活性物以使最终浓度为5μM。将所述管轻柔倒转，然后在时间点=0，将一定体积的反应混合物立即转移到冲击缓冲液中。所转移的体积和所使用的冲击液的体积依赖于所测试的具体分析物的质谱敏感性。冲击后，将所述样品在14,800g离心5分钟。将一部分上清液(100μL)转移至弹簧装载的HPLC嵌入物并置于HPLC小瓶中。然后通过LC/MS/MS分析样品。然后在任意其它时间点重复该操作。

制备方法

化合物I-1、I-15和II-1是根据WO2010006085和US20100184730中描述的操作制备的。化合物III-1和III-2是根据WO2011028689中描述的操作制备的。化合物IV-1、IV-2和IV-3是根据WO2011085211中描述的操作制备的。化合物VI-1、VI-2、VI-5、VI-6和VI-7是根据WO2011106688中描述的操作制备的。化合物VIIa-1和VIIa-2是根据WO WO2011028689中描述的操作制备的。

制备(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-((2S)-1-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(VIIa-6)

N-(2-氨基乙基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺的HCl盐是根据WO2011109681中描述的操作制备的。将该物质(1.62g,5.71mmol)与L-Boc-丙氨酸(1.0g,5.71mmol)、EDC(1.20g,6.28mmol)、HOBT(848mg,6.28mmol)和Et₃N(2.4mL)一起吸收在30mL CH₂Cl₂中。将所得反应混合物在室温搅拌18小时。然后将其用饱和NH₄Cl、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并减压浓缩。经所得残余物通过硅胶色谱法(95%CH₂Cl₂,5% MeOH)来纯化，得到520mg((2S)-1-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(75%收率)。MS(ES)C₂₃H₃₇N₃O₄的计算值:419.28；实测值：420(M+H)。

将((2S)-1-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸叔丁酯(250mg,0.597mmol)吸收在5mL4NHCl/二噁烷中并使其在室温静置1小时。然后将反应混合物减压浓缩得到(2S)-2-氨基-N-(2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)丙酰胺的HCl盐。然后将该物质与DHA(195mg,0.597mmol)、EDC(126mg,0.657mmol)、HOBT(90mg,0.657mmol)和DIEA(312μL)一起吸收在10mL CH₂Cl₂中。将所得反应混合物在室温搅拌2小时。然后将其用饱和NH₄Cl水溶液、盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)并减压浓缩。将所得残余物通过硅胶色谱法(95% CH₂Cl₂,5%MeOH)来纯化得到120mg(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-N-((2S)-1-((2-(2-(4-异丁基苯基)丙酰氨基)乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰胺(32%收率)。MS(ES)C₄₀H₅₉N₃O₃计算值:629.46；实测值:630(M+H)。

制备N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺(I-18)

N-(2-氨基乙基)-2-羟基苯甲酰胺的HCl盐是根据WO2010006085和US20100184730中描述的操作制备的。使该化合物经历与上述反应条件相同的反应条件，使用L-Boc-丙氨酸和DHA得到N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)-2-羟基苯甲酰胺。MS(ES)C₃₄H₄₇N₃O₄计算值:561.36；实测值:562(M+H)。

制备N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)吡啶-3-甲酰胺(III-12)

N-(2-氨基乙基)吡啶-3-甲酰胺的HCl盐是根据WO2011028689中描述的操作制备的。使该化合物经历与上述反应条件相同的反应条件，使用L-Boc-丙氨酸和EPA得到N-(2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)吡啶-3-甲酰胺。MS(ES)C₃₁H₄₄N₄O₃计算值:520.34；实测值:521(M+H)。

制备(E)-4-((2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲酯(IV-5)

(E)-4-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲酯的HCl盐是根据WO2011106688中描述的操作制备的。使该化合物经历与上述反应条件相同的反应条件，使用L-Boc-丙氨酸和DHA得到(E)-4-((2-((S)-2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酰氨基)丙酰氨基)乙基)氨基)-4-氧代丁-2-烯酸甲酯。MS(ES)C₃₂H₄₇N₃O₅的计算值:553.35；实测值:554(M+H)。

本领域技术人员容易理解的是，本发明很适于实现目的并获得本申请所提及的以及隐含的结果和优点。本领域技术人员会想到，本发明实施例以及本申请披露的方法、操作、处理、分子和具体化合物和其它用途包括在本发明主旨内，其由权利要求的范围来定义。

等同

本领域技术人员只利用常规实验就会意识到或能够确定本申请具体描述的具体实施方案的多个等同。所述等同预期包括在随附权利要求的范围内。

参考引用

出于所有目的，将本申请上面披露的每篇专利文献和科技出版物的全部内容专门并入本申请作为参考。

Claims

1.使用胞内酶在特定靶向组织中增强相连的生物活性物的有效性以用于治疗有此需要的患者的疾病的方法，其中所述相连的生物活性物在被所述胞内酶断裂后表现出了两种生物活性物之间的协同作用，而当单独给药所述生物活性物或以非-相连的生物活性物形式给药所述生物活性物时未观察到所述协同作用。

2.权利要求1的方法，其中所述胞内酶选自丝氨酸水解酶、巯基还原酶、磷酸酯酶、肽酶、溶血磷脂酶、磷酸二酯酶和糖苷酶。

3.权利要求2的方法，其中所述酶为丝氨酸水解酶。

4.权利要求3的方法，其中所述酶为脂肪酰胺水解酶。

5.权利要求2的方法，其中所述酶为巯基还原酶。

6.权利要求1的方法，其中所述酶在发生病变的细胞类型中比相同细胞类型的非病变状态以较高的水平表达。

7.权利要求1的方法，其中所述相连的生物活性物的生物活性物选自ω-3脂肪酸、降胆固醇药、贝特类药物、降血脂药、抗糖尿病药、抗癫痫药、抗青光眼药、抗高血压药、抗炎药、抗抑郁药、抗癌药、免疫抑制剂、治疗骨质疏松的药物、治疗多发性硬化症的药物、抗病毒药、抗氧化剂、治疗CAN的药物、治疗神经变性的药物，其中至少一种所述生物活性物为ω-3脂肪酸。

8.权利要求7的方法，其中所述生物活性剂为DHA。

9.权利要求7的方法，其中所述生物活性剂为EPA。

10.权利要求7的方法，其中所述生物活性剂为水杨酸酯。

11.权利要求7的方法，其中所述生物活性剂为烟酸。

12.权利要求7的方法，其中所述生物活性剂为富马酸酯。

13.权利要求7的方法，其中所述相连的生物活性物包含两种ω-3脂肪酸。

14.权利要求的方法1，其中所述疾病选自器官移植排斥；由器官移植导致的复氧损伤、关节的慢性炎症性疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎和与骨再吸收相关的骨疾病；炎症性肠病、回肠炎、溃疡性结肠炎、巴雷特氏综合征、克罗恩病；哮喘、成人呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性气道疾病、囊性纤维化病；角膜营养不良、沙眼、盘尾丝虫病、葡萄膜炎、交感性眼炎、眼内炎、龈炎、牙周炎、尿毒症并发症、肾小球肾炎、肾变病；硬化性皮炎、银屑病、湿疹、神经系统的慢性脱髓鞘病、多发性硬化症、AIDS-相关的神经变性、阿尔茨海默氏病、感染性脑膜炎、脑脊髓炎、帕金森氏病、亨延顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、病毒性脑炎、自身免疫性脑炎；代谢疾病、II型糖尿病、血脂障碍、高甘油三酯血症、青光眼、视网膜病、黄斑水肿、肾病、微白蛋白尿和进行性糖尿病性肾病、多发性神经病、糖尿病性神经病、粥样硬化性冠状动脉病、外周动脉疾病、非酮性高血糖高渗性昏迷、单一神经病变、自主神经病、关节问题、念珠菌感染、糖尿病脂性渐进性环死、免疫复合物血管炎、全身性红斑狼疮；心肌病、缺血性心脏病、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、先兆子痫；慢性肝衰竭、脑和脊髓创伤、癌症、革兰氏阳性或革兰氏阴性休克、出血性或过敏反应性休克或由癌症化疗在应答促炎症细胞因子时诱导的休克、抑郁、肥胖症、变应性疾病、急性心血管事件、心律不齐、预防猝死、炎性肌病、皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎、癌症恶病质、肌肉萎缩病、肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、面肩肱肌营养不良、肢带型肌营养不良、先天性肌强直病、肌强直性营养不良、肝炎包括但不限于非酒精性脂肪性肝病(NASH)、脂肪肝病、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、慢性肾病(CKD)、IgA肾病、肾病性胱氨酸病、法布里病、戈谢病、蓬佩病、神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)、尼曼匹克病和黏多糖病(MPS1)。

15.权利要求14的方法，其中所述疾病选自代谢疾病、II型糖尿病、血脂障碍、高甘油三酯血症、炎症性肠病、肾病性胱氨酸病、迪谢内肌营养不良和肌萎缩性侧索硬化。

16.权利要求1的方法，进一步包括测定所述胞内酶的表达。

17.权利要求的方法1，其中

选择用于治疗所述疾病的第一生物活性物；

选择第二生物活性物，其可与所述第一生物活性物相同或不同；

选择包含键的连接物基团，其中所述键为所述胞内酶的功能性底物；和

其中，所述第一生物活性物和第二生物活性物经所述连接物基团共价连接；

其中，所述相连的生物活性物在被所述胞内酶断裂后表现出所述两种生物活性物之间的协同作用，而当单独给药所述生物活性物或以非-相连的生物活性物形式给药所述生物活性物时未观察到所述协同作用。

18.权利要求1的方法，其中将所述相连的生物活性物给药于需要治疗所述疾病的患者。

19.权利要求17的方法，其中将所述相连的生物活性物给药于需要治疗所述疾病的患者。

20.治疗疾病的方法，包括靶向在所述疾病的细胞中被上调的胞内酶，所述方法包括:

(a)选择用于治疗所述疾病的第一生物活性物；

(b)选择可与(a)所述的生物活性物相同或不同的第二生物活性物；

(c)选择包含键的连接物基团，其中所述键为所述胞内酶的功能性底物；和

(d)将(a)所述的生物活性物和(b)的所述生物活性物经(c)的所述连接物基团连接；

21.权利要求20的方法，其中所述疾病为炎症。

22.权利要求20的方法，其中所述胞内酶为FAAH。

23.权利要求20的方法，其中所述键为酰氨键。

24.权利要求20的方法，其中所述酶在发生病变的细胞类型中比相同细胞类型的非病变状态以较高的水平表达。

25.用于增加至少两种生物活性物的细胞内活性的方法，所述方法包括:

(a)选择第一生物活性物；

(b)选择第二生物活性物，所述第二生物活性物可与(a)的所述生物活性物相同或不同；

(c)选择包含在连接物基团中的键，所述连接物基团在(a)的所述生物活性物和(b)的所述生物活性物之间，其中所述键为所述胞内酶的功能性底物；和

(d)将(a)的所述生物活性物和(b)的所述生物活性物经(c)所述的连接物基团连接；

其中，所述相连的生物活性物在被所述胞内酶断裂后表现出所述两种生物活性物细胞内生物活性的增加，而当单独给药所述生物活性物或以非-相连的生物活性物形式给药所述生物活性物时未观察到所述增加。

26.权利要求25的方法，其中所述疾病为炎症。

27.权利要求25的方法，其中所述胞内酶为FAAH。

28.权利要求25的方法，其中所述键为酰氨键。

29.权利要求25的方法，其中所述酶在发生病变的细胞类型中比相同细胞类型的非病变状态以较高的水平表达。

30.一种设计靶向胞内酶的相连的生物活性物的方法，所述酶在病变状态变的细胞中是被上调的，所述方法包括:

(a)选择第一生物活性物；

(c)选择包含在连接物基团中的键，其中所述键为所述胞内酶的功能性底物；和

(d)将(a)的所述生物活性物和(b)的所述生物活性物经(c)的所述连接物基团连接；

31.治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者给药治疗有效量的相连的生物活性物；

其中，所述相连的生物活性物包括键，所述键在靶向病变组织中被表达的胞内酶被断裂；

其中，所述相连的生物活性物被胞内酶断裂生成了游离的生物活性物，所述游离的生物活性物表现出协同作用，而当单独给药所述生物活性物或以非-相连的生物活性物形式给药所述生物活性物时未观察到所述协同作用。