CN103635476B - 高三尖杉酯碱的酰化衍生物、及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然药物及药物化学领域并涉及通式I和通式II的新型高三尖杉酯碱的酰化衍生物或其药学上可接受的盐，制备这些化合物的方法、包含该化合物的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

Description

高三尖杉酯碱的酰化衍生物、及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物及药物化学领域并涉及新型高三尖杉酯碱衍生物，特别是高三尖杉酯碱的酰化衍生物，及制备这些化合物的方法、包含该化合物的组合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT)又称为氧-3-[(2R)-2，6-二羟基-2-(2′-甲氧基-2′-氧代乙基)-6-甲基庚酰基]粗榧碱(O-3-[(2R)-2，6-dihydroxy-2-(2’-methoxy-2’-oxoethyl)-6-methylheptanoyl]cephalotaxine)是从中国中草药三尖杉科植物三尖杉(cephatotaxusfortuneif)或其同属植物中，提取分离得到的生物碱。三尖杉科三尖杉属植物共9种，其中8种产于中国。此属植物中含有多种生物碱，其中三尖杉酯碱(harringtonine)、高三尖杉酯碱(homoharringtonine)、异三尖杉酯碱(isoharringtonine)及脱氧三尖杉酯碱(deoxyharringtonine)被提取分离、鉴定，并得到了广泛的研究(钟三保等，三尖杉酯类生物碱的半合成及结构和抗肿瘤活性的关系，药学学报，1994，29(1)，33-39；王定志等，三尖杉属植物中生物碱的研究，药学学报，1992，03，178-184)。此外非酯碱的三尖杉碱(即粗榧碱cephalotacine)也作为主要成分被分离出来。
临床研究证明HHT应用于急性髓系细胞白血病的诱导缓解及缓解后治疗，骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒细胞性白血病及真性红细胞增多症及恶性淋巴瘤等，尤其是应用于治疗急性非淋巴细胞白血病(章志学等，HAG方案治疗中高危骨髓增生异常综合征及急性髓性白血病的临床研究，井冈山大学学报，2010，31(6)，108-110；邓建群等，高三尖杉酯碱对白血病原癌基因bcl-1，c-myc，抑癌基因p15的影响，临床合理用药杂志，2010，3(7)，15-16；陈丽娟等，阿糖胞苷，高三尖杉酯碱诱导急性非淋巴细胞凋亡的临床应用，江苏医药，1999，25(4)，257-258；张辉等，LD-HA方案治疗急性髓性白血病27例临床分析，苏州医学院学报，1997，17(4)，689-690；丁素心等，LD-HA方案治疗低增生性白血病26例临床分析，苏州医学院学报，1997，17(1)，89-90；薛艳萍等，HAD方案治疗成人急性非淋巴细胞白血病的临床观察，中华血液学杂志，1995，16(2)，59-61)。
HHT可促进细胞分化及凋亡(王昀等，高三尖杉酯碱诱导K562和CML细胞凋亡及分化的实验研究，上海医学，2001，24(3)，166-168；卢大用等，高三尖杉酯碱对白血病细胞分化和肿瘤转移的影响，上海大学学报，1999，5(2)，175-177)。
从对同步化KB(人类口腔表皮样癌)细胞的研究显示，HHT具有细胞周期特异性，其对G1和G2期细胞杀伤作用最强，而对S期细胞作用较小(金伟等，高三尖杉酯碱对HL-60细胞QCY7703细胞的作用研究，中医药学报，2001，29(3)，44-45；罗晨美等，高三尖杉酯碱和血栓通对人翼状胬肉成纤维细胞周期性变化的影响，中国中医眼科杂志，1999，9(2)，67-70)。
HHT的药理学作用主要抑制真核细胞的蛋白质合成，抑制氨酰基-tRNA对核糖的结合及其核糖体与肽链的形成，因此影响多聚体形成的的早期阶段，并使多聚核糖体解聚，干扰蛋白质核糖体功能，对细胞内DNA的合成也有抑制作用(蔡真等，凋亡相关基因Survivin，Bc1-2和bax表达在高三尖杉酯碱诱导骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞凋亡作用，中华实用肿瘤杂志，2003，18(3)，188-191；蔡真等，survivingmRNA表达水平与高三尖杉酯碱诱导恶性血液病细胞凋亡的相关性研究，浙江大学学报，2006，35(2)，204-208；王恒等，高三尖杉酯碱通过抑制P210-bcr/abl诱导K562细胞凋亡，中国试验血液学杂志，2000，8(4)，287-289；陈春燕等，高三尖杉酯碱启动白血病细胞凋亡的比较蛋白质组学研究，中华血液学杂志，2003，24(12)，624-628；李玉峰等，高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病患者骨髓CD34+细胞端粒酶活性的影响，白血病·淋巴瘤，2004，13(1)，42-43；李玉峰等，高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病患者骨髓CD34～+CD7～+细胞的影响，中华血液学杂志，2007，28(10)，706-707；李玉峰等，高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病患者骨髓T细胞亚群和Th细胞亚群的影响，白血病·淋巴瘤，2006，15(1)，37-39；李玉峰等，高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病患者骨髓及K562细胞端粒酶活性的影响，中华血液学杂志，2003，24(6)，329-329；孟小莉，高三尖杉酯碱诱导HL60细胞端粒酶活性的变化，郑州大学学报，2004，39(3)，440-442；谢万灼等，端粒酶在高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞凋亡中的作用，中华医学遗传学杂志，2002，19(2)，169-171)。这些三尖杉酯碱天然产物在其他方面的应用也在开发中。但是迄今为止尚未见单酰化和双酰化的新型高三尖杉酯碱衍生物的合成与应用的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供单酰化的通式(I)和双酰化的通式(II)的新型高三尖杉酯碱衍生物或其药学上可接受的加成物、复合物或者盐：
其中，R1和R2独立地选自H、C1-C20烷基、C2-C20烯烃基、C4-C20共扼烯烃基、C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基、杂芳基和氨基酸侧链残基，其中上述非氢基团任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、氨基、C1-C6烷基氨基、硝基、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、巯基、C1-C6烷硫基，所述C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基或杂芳基任选地被C1-C6烷基取代，所述C1-C20烷基、C2-C20烯烃基或C4-C20共扼烯烃基任选地被芳基或杂芳基取代。
本发明的目的之二是提供制备本发明通式(I)的单酰化的高三尖杉酯碱衍生物的方法，包括
1)将任选被活化的高三尖杉酯碱与有机酸R1CO2H缩合酯化；
2)将高三尖杉酯碱与有机酰氯R1COCl或有机酸酐(R1CO)2O缩合酯化；或
3)将活化的有机酸R1CO2H与高三尖杉酯碱反应；
以获得通式(I)的化合物，
其中R1如上述式(I)化合物中所定义。。
本发明的也提供制备本发明通式(II)的双酰化的高三尖杉酯碱衍生物的方法：包括
1)将任选被活化的高三尖杉酯碱与有机酸R1CO2H缩合酯化(其中R1＝R2)或将任选活化的通式(I)的化合物与有机酸R2CO2H缩合酯化；
2)将高三尖杉酯碱与有机酰氯R1COCl或有机酸酐(R1CO)2O缩合酯化(其中R1＝R2)；或将通式(I)的化合物与有机酰氯R2COCl或有机酸酐(R2CO)2O缩合酯化；或
3)将活化的有机酸R1CO2H与高三尖杉酯碱反应(其中R1＝R2)或将活化的有机酸R2CO2H与通式(I)的化合物反应；
以获得通式(II)的化合物，
各式中R1和R2与上文在通式(II)中的定义相同。
本发明的目的之三是提供包含本发明化合物的药物组合物，所述药物组合物包括至少一种本发明化合物，和任选的药学上可以接受的赋形剂。
本发明的目的之四是提供本发明化合物或包含该化合物的药物组合物在制备药物、特别是抗肿瘤药物中的用途。相应地，本发明提供一种治疗肿瘤患者的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的至少一种本发明的化合物。所述肿瘤特别选自白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌、胆管细胞癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤、人宫颈癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、食管癌、中耳肿瘤、前列腺癌等。
本发明还涉及用于治疗肿瘤的本发明的化合物。
附图简要说明
图1是化合物BS-HH-002的核磁共振氢谱；
图2是化合物BS-HH-002的核磁共振13碳谱；
图3是化合物BS-HH-002的液质谱图；
图4是显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠体重影响的动态变化的图；
图5是显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤影响的动态曲线；
图6显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤重量的影响；
图7显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤重量的影响，其中*表示与对照组比较p＜0.05；
图8显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤的抑制作用；
图9显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠体重影响的动态曲线；
图10显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤影响的动态曲线；
图11显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤重量的影响；
图12显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤重量的影响，其中与对照组比较，*为p＜0.05，**为p＜0.01；
图13显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤的抑制作用。
具体实施方式
具体地，本发明特别涉及如下各项内容。
1.单酰化的通式(I)和双酰化的通式(II)的新型高三尖杉酯碱衍生物或其药学上可接受的加成物、复合物或者盐
其中，R1和R2独立地选自H、C1-C20烷基、C2-C20烯烃基、C4-C20共扼烯烃基、C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基、杂芳基和氨基酸侧链残基，其中上述非氢基团任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、氨基、C1-C6烷基氨基、硝基、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、巯基、C1-C6烷硫基，所述C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基或杂芳基任选地被C1-C6烷基取代，所述C1-C20烷基、C2-C20烯烃基或C4-C20共扼烯烃基任选地被芳基或杂芳基取代。
2.根据上述第1项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯烃基、C4-C8共扼烯烃基、C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基、杂芳基和氨基酸侧链残基，其中上述非氢基团任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、氨基、C1-C4烷基氨基、硝基、氰基、羟基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4烷硫基，所述C3-C7环烷基或环烯烃基、芳基、杂环基或杂芳基任选地被C1-C4烷基取代，所述C1-C6烷基、C2-C6烯烃基或C4-C8共扼烯烃基任选地被芳基或杂芳基取代。
3.根据上述第1项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、C2-C6烯烃基、C3-C7环烷基、芳基和杂芳基，其中上述非氢基团任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、氨基、C1-C4烷基氨基、硝基、氰基、羟基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4烷硫基，所述C3-C7环烷基、芳基和杂芳基任选地被C1-C4烷基取代，所述C1-C6烷基或C2-C6烯烃基任选地被芳基或杂芳基取代。
4.根据上述第1项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、芳基或杂芳基取代的C1-C6烷基、C2-C6烯烃基、芳基或杂芳基取代的C2-C6烯烃基、C3-C7环烷基、芳基、C1-C4烷基取代的芳基、杂芳基和C1-C4烷基取代的杂芳基，其中上述基团任选地被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、氨基、C1-C4烷基氨基、硝基、氰基、羟基、C1-C4烷氧基、巯基和C1-C4烷硫基。
5.根据上述第1项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2独立地选自C1-C6烷基、芳基或杂芳基取代的C1-C6烷基、C2-C6烯烃基、芳基或杂芳基取代的C2-C6烯烃基、C3-C7环烷基、芳基、C1-C4烷基取代的芳基、杂芳基和C1-C4烷基取代的杂芳基，其中任一基团任选地被一个或多个卤素原子所取代。
6.根据上述第1-5任一项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述芳基为苯基；所述杂芳基为呋喃基、噻吩基、吡啶基、噁唑基或异噁唑基；所述C3-C7环烷基为环丙基、环丁基、环戊基或环己基；所述每个基团任选地被C1-C4烷基(优选甲基)或卤素原子(优选氯或溴)取代。
7.根据上述第1-6任一项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其为通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
8.根据上述第7的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐其中R1选自C1-C6烷基、芳基或杂芳基取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基、芳基、C1-C4烷基取代的芳基、杂芳基和C1-C4烷基取代的杂芳基，其中任一基团任选地被一个或多个卤素原子所取代。
9.根据上述第8项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述芳基为苯基，所述杂芳基为呋喃基、吡啶基、噻唑基；所述环烷基为环戊基，其中任一基团任选地被一个或多个卤素原子所取代。
10.根据上述第9项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1选自甲基、呋喃基、任选被卤素取代的吡啶基、任选被甲基取代的噻唑基、苯基和环戊基。
本发明的部分化合物如下所示。所列化合物仅对本发明做例举说明，并不对本发明的范围构成任何限制。
上面所示化合物的部分数据列如下表：
本发明特别优选如下化合物：
2，6-二乙酰基高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-001.
6-O-乙酰基高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-002
6-O-(呋喃-2-酰基)高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-059
6-O-(2-氯吡啶-3-酰基)高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-066
6-O-(4-甲基噻唑-5-酰基)高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-0721
6-O-(苯乙酰基)高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-074
6-O-(环戊酰基)高三尖杉酯碱，化合物BS-HH-077
本发明涉及以下形式的本发明的通式(I)和通式(II)化合物：它们的盐、溶剂化物、水合物、加成物、复合物、多晶型物或前药。
如本文所使用，术语“烷基”是指含有指定碳原子数的直链或支链烷基，例如C1-C20烷基、C1-C6烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基等。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正戊基、正己基、正二十烷基等。
术语“烯烃基”是指含有指定碳原子数的直链或支链的含有至少一个碳-碳双键的烃基，例如C2-C20烯烃基、C2-C10烯烃基、C2-C8烯烃基C2-C7烯烃基、C2-C6烯烃基、C2-C4烯烃基和C2-C3烯烃基。烯烃基的例子包括但不限于乙烯基、烯丙基、和二十烯烃基。
术语“共扼烯烃基”是指含有指定碳原子数的直链或支链的、含有至少两个互相共扼的碳-碳双键的烃基，例如C4-C20共扼烯烃基、C4-C18共扼烯烃基、C4-C10、C4-C8共扼烯烃基、C4-C7共扼烯烃基、C4-C6共扼烯烃基、C4-C5共扼烯烃基。共扼烯烃基的例子包括但不限于共扼丁二烯烃基和(9Z)-十八(碳)-9-烯烃基。
术语“C3-C7环烷基或环烯烃基”是指饱和或不饱和的3-7元单环烃基，例如C3-C7环烷基可以为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环丙烯基和环己烯基。
术语“芳基”是指含有6-14个碳原子的单碳环芳香基或融合或非融合的多碳环芳香基，在多碳环的情况下，只要一个碳环是芳香的即可。芳基也包括与杂环基稠合的芳基。所述芳基的例子有苯基、联苯基、萘基、5，6，7，8-四氢萘基、2.3-二氢苯并呋喃基等。
术语“杂芳基”是指在环中含有1-4个杂原子(例如1、2、3或4个杂原子)作为环原子的芳香环基团。杂原子是指氮、氧或硫。杂芳基可以是具有5-7个环原子的单环杂芳基，或者具有7-11个环原子的双环杂芳基。所述双环芳基中只要一个环是芳香杂环即可，另一个可以是芳香的或非芳香的、含杂原子的或不合杂原子的。杂芳基的例子有例如吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、吲哚基等。
“杂环基”含有1-4个杂原子(例如1、2、3或4个杂原子)作为环原子的非芳香环基团。杂原子是指氮、氧或硫。杂环基可以是具有4-8个环原子的单环杂环基，或者具有7-11个环原子的双环杂环基。杂环基可以是饱和的，或者不饱和但非芳香的。杂环基的例子有氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、哌嗪基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻吩基等。
术语“氨基酸”是指天然氨基酸。
术语“氨基酸侧链残基”是指氨基酸α碳上羧基之外的部分。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“烷基氨基”是指被一个或两个具有指定碳原子数的烷基(包括环烷基)取代的氨基。
术语“烷氧基”包括烷氧基和环烷基氧基。
术语“烷硫基”烷硫基和环烷基硫基。
术语“式(I)和式(II)化合物的药学上可以接受的加和物和复合物”是指本发明的化合物进一步与其他小分子或生物大分子以非化学键或者非共价分子间力结合的产物。
如本文所使用，术语“通式(I)和通式(II)化合物的药学上可以接受的盐”是指本发明的化合物与药学上可以接受的阴离子的有机酸形成的有机酸盐，这些有机酸盐包括但不限于甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苹果酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐；也可形成合适的无机盐，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等。
药学上可以接受的盐可使用本领域熟知的标准程序获得，例如，通过将足量的碱性化合物和提供药学上可以接受的阴离子的合适的酸反应生成。
如本文所使用，术语“多晶型物”是指本发明的化合物或其复合物的固体晶体形式。相同化合物的不同的多晶型物可以显示不同的物理、化学和/或光谱性质。不同的物理性质包括但不限于稳定性(例如，对热或光)、可压缩性和密度(对于配制制剂和产品生产是重要的)和溶解速率(其可以影响生物吸收度和利用度)。稳定性的不同会造成化学反应性(例如差异氧化，使得当由一种多晶型物构成时比由另一多晶型物构成时剂型更快地褪色)或机械性能(例如，储存时作为动力学有利的多晶型物的片剂碎末转化成热力学更加稳定的多晶型物)或两者(例如，一种多晶型物的片剂在高潮湿度时更加容易破碎)中的变化。多晶型物的不同的物理性质可以影响它们的加工。例如，一种多晶型物可能比另一种更可能形成溶剂化物或可能比另一种更加难以过滤或洗去杂质，这是由于其颗粒的形状或大小分布不同的缘故。
如本文所使用，术语“水合物”是指本发明的化合物或其盐，其进一步包含通过非共价分子间力结合的化学计量的或非化学计量的水。
如本文所使用，除非另外说明，术语“前药”是指可以在生物学条件(体外或体内)下水解、氧化或进行其他反应以提供本发明的化合物的衍生物。前药仅在生物学条件下经过该反应成为活性化合物，或者它们在它们不反应的形式中具有活性。通常可以使用公知的方法制备前药，例如1Burger′sMedicinalChemistryandDrugDiscovery(1995)172-178，949-982(ManfredE.Wolff编，第5版)和J.Rautio’sProdrugsandTargetedDelivery(2011)31-60(Wiley-VCH，MethodsandPrinciplesinMedicinalChemistry第47卷)和G.Thomas’sFundamentalsofMedicinalChemistry(2003)195-200(Wiley)中描述的那些方法。
本发明化合物中高三尖杉酯碱衍生物的四个手性中心具有通式I和通式II结构式所显示的立体化学结构。本文使用的立体化学的定义和约定一般遵循MCGRAw-HILLDICTIONARYOFCHEMICALTERMS(S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillBookCompany，NewYork，1984)；ELIEL，E.和WILEN，S.，STEREOCHEMISTRYOFORGANICCOMPOUNDS(JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，1994)。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏光的平面的能力。
本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
本发明的化合物可以按照常规的有机化学合成方法制备。例如，本发明的通式(I)化合物的通用制备方法如下：
6’-位酰基化或酯化的通式(I)可由天然提取分离的高三尖杉酯碱(HHT)和相应的有机酸、有机酸酐或有机酰氯反应制取。通式(I)中R1与上文在通式(I)中的定义相同。
2’，6’-双酰基化或酯化的式(II)也可由天然提取分离的高三尖杉酯碱(HHT)和相应的有机酸、有机酸酐或有机酰氯反应一步制取；也可经由通式(I)中间体与相应的有机酸、有机酸酐或有机酰氯反应两步制取。通式(II)中R1和R2与上文在通式(II)中的定义相同。
例如，本发明提供制备本发明通式(I)的单酰化的高三尖杉酯碱衍生物的方法：
单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)可由高三尖杉酯碱与相应的有机酸R1CO2H在有缩和剂或者催化剂的存在下，缩合酯化而成；也可以由高三尖杉酯碱与相应的有机酰氯R1COCl或者有机酸酐(R1CO)2O在有缩和剂或者碱性试剂存在下，缩合酯化而成；或者将有机酸R1CO2H活化生成中间体，而后与高三尖杉酯碱反应生成单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)；也可以将高三尖杉酯碱的羟基活化生成中间体，而后与有机酸R1CO2H反应生成单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)。式(I)中R1、有机酸R1CO2H中R1和有机酰氯R1COCl中R1与上文在式(I)中的定义相同。
本发明的也提供制备本发明通式(II)的双酰化的高三尖杉酯碱衍生物的方法：
双酰化的高三尖杉酯碱衍生物(II)可按上述方法先制取单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)，而后与相应的有机酸R2CO2H在有缩和剂或者催化剂存在下，缩合酯化而成；或者由单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)与相应的有机酰氯R2COCl或者有机酸酐(R2CO)2O在有缩和剂或者碱性试剂存在下，缩合酯化而成；或者将有机酸R2CO2H活化生成中间体，而后与单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)反应生成双酰化的高三尖杉酯碱衍生物(II)；也可以将单酰化的高三尖杉酯碱衍生物(I)的羟基活化生成中间体，而后与有机酸R2CO2H反应生成双酰化的高三尖杉酯碱衍生物(II)。
通式(I)中R1、有机酸R1CO2H中R1、有机酰氯R1COCl中R1和有机酸酐(R1CO)2中R1与上文在式(I)中的定义相同。式(II)中R1和R2、有机酸R1CO2H中R1和有机酰氯R1COCl中R1、有机酸R2CO2H中R2和有机酰氯R2COCl中R2与上文在式(I)和式(II)中的定义相同。上述方法更适用于R1和R2不相同的衍生物的制备。对于R1和R2相同的二酰化的衍生物的制备可按照如下方法制备而成：
增加有机酸的投料摩尔比例，延长反应时间，使用更强的活化试剂，即可制取通式II的双酰化的高三尖杉酯碱衍生物。上式中的有机酸RCO2H可以为有机酸R1CO2H或有机酸R2CO2H；通式(II)中R1和R2与上文在通式(II)中的定义相同
上述反应一般在有碱或碱性试剂存在下进行。这里碱可以是但不局限于有机碱。例如二异丙基乙基胺，三乙胺，二甲基胺基吡啶。
上述反应一般在溶剂中进行。使用的溶剂包括但不局限于非质子极性溶剂，例如二氯甲烷(DCM)，二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或四氢呋喃(THF)等。
上述反应的反应温度一般为0℃至50℃。一般随所用的反应原料以及碱的不同而变化。
制备反应的原料是高三尖杉酯碱(HHT)。该原料是由天然产物提取分离而得到，可以在市场上购买获得。
制备反应的有机酸、有机酸酐或有机酰氯全部可以在市场上购买获得。
常规的化学转换可用于实施本发明。本领域的技术人员可以决定用于这些化学转换的适当的化学试剂、溶剂、保护基和反应条件。相关信息描述于R.Larock，ComprehensiveOrganicTransformations，VCHPublishers(1989)；T.W.GreeneandP.G.M.Wuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，3rdEd.，JohnWileyandSons(1999)；L.FieserandM.Fieser，FieserandFieser’sReagentsforOrganicSynthesis，JohnWileyandSons(1994)；L.A.Paquetteeditor，EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis，JohnWileyandSons(1995)及其后来的版本。
保护基指那些一旦连接活性部分(例如，羟基或氨基)，防止这些部分被后来的反应干扰并可在反应后通过常规的方法去除的基团。羟基保护基的例子包括但不限于，烷基、苯甲基、烯丙基、三苯甲基(即，三苯基甲基)、酰基(例如，苯甲酰基、乙酰基或HOOC-X”-CO-，X”为亚烷基、亚链烯基、亚环烷基或亚芳基)、甲硅烷基(例如，三甲基硅烷基、三乙基硅烷基和叔丁基二甲基硅烷基)、烷氧基羰基、氨基羰基(例如，二甲基氨基羰基、甲基乙氨基羰基和苯基氨基羰基)、烷氧甲基、苯甲氧甲基和烷基巯甲基。氨基保护基的例子包括但不限于，烷氧基羰基、烷酰基、芳氧基羰基、芳基取代的烷基等。羟基和氨基保护基已在T.W.GreeneandP.G.M.Wuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，2ndEdition，JohnWileyandSons(1991)中讨论。羟基和氨基保护基都可在反应后通过常规的方法去除。
本发明还提供了包含本发明通式I和式II化合物的药物组合物。
本发明提供了这样的药物组合物，其中包含至少一种如上所述的本发明的式I或式II的化合物，和任选的药学上可以接受的赋形剂。
制备各种含有一定量的活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，Martin，E.W.，ed.，MackPublishingCompany，19thed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。
以已知的方法制造本发明的药物制剂，包括常规的混合、溶解或冻干方法。
本发明的化合物可以制成药物组合物，并向患者以适于选定的施用方式的各种途径施用，例如口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。
因此，本发明的化合物结合药学上可以接受的载体(如惰性稀释剂或可食用的载体)可以全身施用，例如，口服。它们可以封闭在硬或软壳的明胶胶囊中，可以压为片剂。对于口服治疗施用，活性化合物可以结合一种或多种赋形剂，并以可吞咽的片剂、颊含片剂、含片、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、圆片等的形式使用。这种组合物和制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。这种组合物和制剂的比例当然可以变化，可以占给定的单位剂型重量的大约1％至大约99％。在这种治疗有用的组合物中，活性化合物的量使得能够获得有效剂量水平。
片剂、含片、丸剂、胶囊剂等也可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和缓释装置中。
活性化合物也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性化合物或其盐的水溶液，任选的可混和的无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。
通过将合适的溶剂中的需要量的活性化合物与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的以前无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。
有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本发明的化合物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。
增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。
化合物或其活性盐或衍生物的治疗需要量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的本质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.1到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
本发明还提供本发明的化合物或包含该化合物的组合物在制备药物、特别是抗肿瘤药物中的用途。相应地，本发明提供一种治疗肿瘤患者的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的至少一种本发明的化合物。本发明的单酰化和双酰化的高三尖杉酯碱衍生物或其药学上可接受的盐例如可用于治疗白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌、胆管细胞癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、人宫颈癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、食管癌、中耳肿瘤等肿瘤。
在下列实施例中，将更加具体地解释本发明。但应理解，下列实施例旨在说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制。
以下实施例中所用的化学原料均为商购获得或通过本领域熟知的合成方法获得。
实施例1：化合物BS-HH-001的合成
式中，HHT：高三尖杉酯碱；Ac2O：醋酐；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；DCM：二氯甲烷；BS-HH-001：2，6-二乙酰基高三尖杉酯碱；BS-HH-002：6-乙酰基高三尖杉酯碱。
将高三尖杉酯碱HHT(125mg，0.23mmol)，二异丙基乙基胺(444mg，3.44mmol)及4-二甲氨基吡啶(28mg，0.023mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，向混合溶液中加入醋酐(351mg，3.44mmol)，在35℃条件下反应24小时，反应液用水洗，然后再用饱和碳酸氢钠洗，干燥，浓缩，得到的粗产品经制备液相色谱纯化，得到白色固体化合物BS-HH-001(43.3mg，30％)。
LC-MS：保留时间：1.11min(98.7％)，m/z：630.5[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ6.60(d，2H)，5.80-5.93(m，3H)，5.02(s，1H)，3.76(d，J＝9.9Hz，1H)，3.67(s，3H)，3.60(s，3H)，3.03-3.17(m，2H)，2.84(d，J＝15.0Hz，1H)，2.52-2.67(m，3H)，2.37(dd，J＝13.5Hz，6.3Hz，1H)，2.00(s，3H)，1.95(s，3H)，1.39(d，6H).
实施例2：化合物BS-HH-002的合成
式中，HHT：高三尖杉酯碱；Ac2O：醋酸酐；
向Ac2O(20mL)中加入高三尖杉酯碱HHT(1g，1.84mmol)，反应加热升温至80℃，搅拌反应13小时，反应结束后浓缩反应液，得到黏状粗产物，加入乙醚后固化，向固化的粗产物中加入乙酸乙酯使其溶解，用饱和碳酸钾溶液洗，浓缩，得到的粗产品经硅胶柱(EA∶PE＝1∶2)纯化，得到黄色油状物，用乙醚重结晶后得到白色固体化合物BS-HH-002(654mg，61％)，同时回收高三尖杉酯碱HHT原料(354mg)。BS-HH-002：LC-MS：保留时间：1.00min(96.74％)，m/z：588.2[M+H]+.1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ6.62(s，1H)，6.55(s，1H)，5.99(d，J＝9.6Hz，1H)，5.87(d，J＝3.2Hz，2H)，5.06(s，1H)，3.78(d，J＝9.6Hz，1H)，3.68(s，3H)，3.57(s，3H)，3.52(s，1H)，3.15-3.07(m，2H)，2.99-2.91(m，1H)，2.63-2.59(m，2H)，2.41-2.36(m，1H)，2.21(d，J＝16.4Hz，1H)，2.05-1.87(m，6H)，1.76(m，2H)，1.68-1.63(m，2H)，1.46-1.39(m，9H)，1.23-1.14(m，1H).13CNMR(400MHz，CDCl3)：δ173.91，170.41，170.30，157.65，146.62，145.75，133.11，128.13，112.60，109.57，100.75，100.03，82.14，74.67，74.41，70.57，57.31，55.63，53.81，51.47，48.48，43.17，42.36，40.57，38.76，31.14，25.70，22.44，20.44，20.13，17.44.
所获得的化合物BS-HH-002的核磁共振氢谱见图1，核磁共振13碳谱见图2，液质谱图见图3。
实施例3：化合物BS-HH-077的合成
式中，HHT：高三尖杉酯碱；Yi：环戊基甲酸；4-ppy：4-(1′-四氢吡咯)吡啶；DCC：二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷。
将高三尖杉酯碱(110mg，0.2mmol)，环戊基甲酸(46mg，0.4mmol)，4-(1′-四氢吡咯)吡啶(60mg，0.4mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，往溶液中加入二环己基碳二亚胺(83mg，0.4mmol)，加热回流三小时后，过滤。滤液浓缩，得到的粗品用高效液相色谱纯化，得到浅黄色粉末状固体BS-HH-077(35.9mg，28％)。
LC-MS：保留时间：1.52min(95.63％)，m/z：642.6[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ6.63(s，1H)，6.59(s，1H)，5.99(d，J＝9.0Hz，1H)，5.90(m，2H)，5.09(s，1H)，3.80(m，1H)，3.73(s，3H)，3.57(s，3H)，3.49-3.54(m，1H)，2.73-3.02(m，2H)，2.42-2.65(m，3H)，2.27(m，1H)，2.03-2.24(m，3H)，1.76-1.84(m，3H)，1.56(m，2H)，1.40(d，6H).
按照BS-HH-001的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与呋喃-2-丙烯酸反应，制备了BS-HH-0022：LC-MS：保留时间：1.69min(70.42％)，m/z：786.8[M+H]+.
1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.46(d，J＝6Hz，2H)，7.37-7.29(m，2H)，6.60(m，4H)，6.46(s，2H)，6.25(d，2H)，5.93(m，3H)，3.71(s，3H)，3.57(s，3H)，1.46(s，6H).
按照BS-HH-001的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与噻吩-2-羧酸反应，制备了BS-HH-0572：LC-MS：保留时间：1.65min(94.68％)，m/z：766.5[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.71(m，2H)，7.53(m，2H)，7.05(m，2H)，6.60(d，2H)，5.99(d，1H)，3.75(s，1H)，3.62(s，3H)，3.52(s，3H)，2.24(s，2H)，1.55(d，6H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与呋喃-2-羧酸反应，制备了BS-HH-059：LC-MS：保留时间：1.41min(100％)，m/z：640.3[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.54(m，1H)，7.05(d，1H)，6.58(s，1H)，6.53(s，1H)，6.47(m，1H)，5.99(d，J＝9.0Hz，1H)，5.86(m，2H)，5.03(s，1H)，3.78(d，J＝9.0Hz，1H)，3.65(s，3H)，3.56(s，3H)，3.51(s，1H)，3.12(m，2H)，2.61(m，1H)，2.38(dd，J＝9Hz，2H)，1.86(m，2H)，1.54(d，6H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与5-甲基异噁唑-4-羧酸反应，制备了BS-HH-061：LC-MS：保留时间：1.46min(89.16％)，m/z：655.6[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ6.63(s，1H)，6.55(s，1H)，6.00(d，J＝9.0Hz，1H)，5.87(m，2H)，5.34(s，1H)，5.06(s，1H)，3.81(d，J＝12Hz，1H)，3.69(s，3H)，3.57(s，3H)，3.48(s，1H)，2.61(m，2H)，2.31(m，2H)，2.26(s，3H)，1.49(s，6H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与环丙烷甲酸反应，制备了BS-HH-062：LC-MS：保留时间：1.40min(93.07％)，m/z：614.6[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ6.62(s，1H)，6.57(s，1H)，6.02(d，J＝12.0，1H)，5.90(m，2H)，5.05(s，1H)，3.71(m，4H)，3.57-3.49(m，4H)，1.41(d，6H)，0.90(m，2H)，0.77(m，2H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与2-氯尼古丁酸反应，制备了BS-HH-066：LC-MS：保留时间：1.41min(99.12％)，m/z：685.7[M+H]+.
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与4-甲基噻唑-5-羧酸反应，制备了BS-HH-0721：LC-MS：保留时间：1.40min(91.07％)，m/z：671.6.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.73(s，1H)，6.60(s，1H)，6.56(s，1H)，6.00(d，J＝9.0Hz，1H)，5.89(m，2H)，5.15(s，1H)，3.76-3.84(m，1H)，3.68(s，3H)，3.57(s，3H)，3.48(s，1H)，2.73(s，3H)，1.52(d，6H).
按照BS-HH-001的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与4-甲基噻唑-5-羧酸反应，制备了BS-HH-0722：LC-MS：保留时间：1.54min(92.92％)，m/z：796.9[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ8.74(d，2H)，6.64(d，2H)，5.93(m，3H)，5.05(s，1H)，3.78(m，1H)，3.67(s，3H)，3.54(s，3H)，3.48(s，3H)，3.10(m，2H)，2.73(d，6H)，1.54(d，6H).
按照BS-HH-001的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与苯甲酸反应，制备了BS-HH-0732：LC-MS：保留时间：1.69min(78.92％)，m/z：754.8[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.98-7.88(m，4H)，7.53(m，2H)，7.43-7.36(m，4H)，6.66(s，1H)，6.60(s，1H)，5.93(m，3H)，5.92(m，3H)，3.63(s，3H)，3.49(s，3H)，1.55(d，6H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与苯乙酸反应，制备了BS-HH-074：LC-MS：保留时间：1.48min(87.91％)，m/z：664.7[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ7.28-7.34(m，5H)，6.62(s，1H)，6.58(s，1H)，5.99(d，J＝9.0，1H)，5.9(m，2H)，3.69(s，1H)，3.58(s，3H)，3.50(s，3H)，3.48(s，1H)，1.40(s，3H)，1.37(s，3H).
按照BS-HH-077的方法，使用上述同样的试剂，将高三尖杉酯碱与环己烷羧酸反应，制备了BS-HH-076：LC-MS：保留时间：1.56min(79.98％)，m/z：656.6[M+H]+.1HNMR(300MHz，CDCl3)：δ6.61(s，1H)，6.55(s，1H)，5.97(d，J＝9.0，1H)，5.88(m，2H)，5.06(s，1H)，3.81(d，1H)，3.70(s，3H)，3.57(s，3H)，3.48(s，1H)，1.40(s，3H)，1.36(s，3H).
实施例4：本发明高三尖杉酯碱衍生物抗白血病活性测定
(1)实验材料
白血病细胞株：白血病细胞株：K562/adr(耐药慢性髓系白血病，CML)、NB4(急性早幼粒细胞白血病，AML)、Kasumi-1(急性髓系白血病M2型，AML-M2)、Jurkat(急性淋巴细胞白血病，ALL)，以上细胞系均受赠于浙江大学肿瘤研究所；H9(急性淋巴细胞白血病，ALL)，购自中国典型培养物保藏中心。
试剂：高三尖杉酯碱(HHT)标准品购自泰华天然生物制药有限公司(陕西)，本发明的高三尖杉酯碱衍生物。
主要仪器：ThermoScientific3111细胞培养箱，Bio-RadiMark酶标仪。
(2)实验方法
取生长良好的白血病细胞6000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的高三尖杉酯碱类化合物，混匀后，置于二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养72小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加化合物处理)细胞活力设为100％，并计算出化合物作用后细胞活力(％)和72小时白血病细胞半数生长抑制浓度(72小时IC50值)。
(3)实验结果
实验结果见表1。表1显示本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物能诱导人慢性髓系白血病、急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病细胞死亡和抑制这些白血病细胞生长，与高三尖杉酯碱本身比较，本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物抗白血病细胞活性明显增强，其中本发明高三尖杉酯碱酰化衍生物BS-HH-066抗Kasumi-1(急性髓系白血病M2型，AML-M2)活性提高7倍以上；BS-HH-074抗K562/adr(耐药慢性髓系白血病，CML)活性提高5倍以上，抗Kasumi-1(急性髓系白血病M2型，AML-M2)活性提高5倍以上，抗NB4(急性早幼粒细胞白血病，AML)和H9(急性淋巴细胞白血病，ALL)活性提高2倍以上；BS-HH-002抗Kasumi-1(急性髓系白血病M2型，AML-M2)活性提高3.4倍以上，抗K562/adr(耐药慢性髓系白血病，CML)活性提高3.2倍以上，抗NB4(急性早幼粒细胞白血病，AML)活性提高3倍以上，抗H9(急性淋巴细胞白血病，ALL)活性提高5倍以上.
表1：高三尖杉酯碱的酰化衍生物对白血病细胞生长抑制浓度测定(72小时，IC50(μg/mL)值和IC90(μg/mL)值)
表1(续)
实施例5：本发明高三尖杉酯碱衍生物抗人多发性骨髓瘤和淋巴瘤细胞活性测定
(1)实验材料
骨髓瘤和淋巴瘤细胞株：RPMI8226(多发性骨髓瘤)，购自上海复祥生物科技有限公司。
试剂：同实施例4
主要仪器：ThermoScientific3111细胞培养箱，Bio-RadiMark酶标仪。
(2)实验方法
取生长良好的上述肿瘤细胞6000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的高三尖杉酯碱类化合物，混匀后，置于二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养72小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加化合物处理)细胞活力设为100％，并计算出化合物作用后细胞活力(％)和72小时白血病细胞半数生长抑制浓度(72小时IC50值和IC90值)。
(3)实验结果
实验结果见表2。表2显示本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物能诱导人骨髓瘤和淋巴瘤细胞死亡和抑制这些肿瘤细胞生长，其中本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物BS-HH-001和BS-HH-002抗RPMI8226(多发性骨髓瘤)效果尤为明显。
实施例6：本发明高三尖杉酯碱的酰化衍生物抗人实体瘤作用测定
(1)实验材料
人实体瘤细胞株：Hep-2(喉癌)、A549(人肺癌)、CaES-17(食道癌细胞)、PC-3(前列腺癌)、CNE(鼻咽癌细胞)、SK-OV-3(卵巢癌细胞)，均购自中国典型培养物保藏中心；RKO(人结肠腺癌细胞)、MGC803(人胃癌细胞)、MG63(骨肉瘤)、U87MG(恶性脑胶质瘤细胞)，均购自上海复祥生物科技有限公司；PANC-1(胰腺癌)、Huh7(人肝癌细胞)、Becap37(人乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)，均受赠于浙江大学肿瘤研究所。
试剂：同实施例4
主要仪器：ThermoScientific3111细胞培养箱，Bio-RadiMark酶标仪。
(2)实验方法
取生长良好的人实体瘤细胞4000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液。置于二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时，然后，加入不同浓度的高三尖杉酯碱类化合物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养72小时。然后用MTT法测定活细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加化合物处理)细胞活力设为100％。
(3)实验结果见表2。
表2显示本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物能诱导人骨髓瘤和淋巴瘤细胞死亡和抑制这些肿瘤细胞生长，其中本发明的高三尖杉酯碱酰化衍生物BS-HH-002，BS-HH-0721和BS-HH-074抗RPMI8226(多发性骨髓瘤)效果是高三尖杉酯碱的两倍以上。BS-HH-002，BS-HH-0721，BS-HH-074抗A549(人肺癌)的效果是高三尖杉酯碱的三倍以上。BS-HH-002，BS-HH-0721抗PANC-1(胰腺癌)的效果分别是高三尖杉酯碱的三，四倍以上。BS-HH-002，BS-HH-059，BS-HH-0721，BS-HH-074抗Becap37(人乳腺癌细胞)的效果是高三尖杉酯碱的两倍以上。BS-HH-002，BS-HH-059，BS-HH-0721，BS-HH-074抗MG63(骨肉瘤)的效果远优于高三尖杉酯碱。BS-HH-002，BS-HH0721抗Huh7(人肝癌细胞)的效果是高三尖杉酯碱的两倍以上。BS-HH-002，BS-HH-059，BS-HH-0721抗RKO(人结肠腺癌细胞)的效果远优于高三尖杉酯碱。BS-HH-002，BS-HH-0721，BS-HH-074抗Hela(人宫颈癌细胞)的效果分别是高三尖杉酯碱的2.5，4.0，5.6倍以上.BS-HH-002，BS-HH-0721抗CaES-17(食道癌细胞)的效果是高三尖杉酯碱的两倍以上。BS-HH-0721，BS-HH-074，BS-HH077抗CNE(鼻咽癌细胞)的效果分别是高三尖杉酯碱的10，27，3倍以上.BS-HH-002，BS-HH-0721，BS-HH074，BS-HH-077抗Hep-2(喉癌)的效果是高三尖杉酯碱的两倍以上。BS-HH-002，BS-HH-074抗PC-3(前列腺癌)的效果分别是高三尖杉酯碱的6，10倍以上.BS-HH-002PC-3抗SK-OV-3(卵巢癌细胞)的效果是高三尖杉酯碱的两倍。
表2高三尖杉酯碱的酰化衍生物对淋巴瘤和多发性骨髓瘤和人实体瘤细胞半数生长抑制浓度测定(72小时，IC50(μg/mL)值和IC90(μg/mL)值)。
表2(续)
表2(续)
表2(续)
实施例7：本发明高三尖杉酯碱的酰化衍生物BS-HH-002抗体内肿瘤的活性测定和毒性的初步测试
实验7-1：BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤的抑制作用
(1)实验材料：
白血病细胞株：kasumi-1(人急性粒细胞白血病M2型细胞株)动物：NOD/SCID鼠(多重免疫缺陷鼠)，8周，雌性，购自中国科学院上海实验动物中心
(2)试剂：BS-HH-002，BS-HH-002-0.1为0.1mg/kg/次的剂量，BS-HH-002-0.3为0.3mg/kg/次的剂量.
(3)主要仪器：细胞培养箱，超净工作台，层流架
(4)实验方法
无菌条件下收集对数生长期上述肿瘤细胞，以5×107/0.2ml/只裸鼠的细胞量(活细胞率＞95％)，经皮下注射于NOD/SCID鼠右腋下，建立白血病NOD/SCID鼠移植瘤模型。接种后第三天开始给药，实验组按实验设计量灌胃，阴性对照组用无菌水灌胃，每只鼠每次灌胃0.4ml，每天用药3次，用药时间为8点，14点，20点，间隔时间为6小时，连续给药10天。以给药前一天为第0天，每隔约5天测体重及瘤径，做出体重及肿瘤生长动态图。第31天解剖取出瘤体称重，以对照组抑瘤率为0，计算出药物作用后的肿瘤抑制率(％)。
测定值用平均数±标准误(M±SD)表示，各组实验数据采用SPSS18.0统计软件中的One-wayANOVA法分析，p＜0.05作为具有统计学差异显著性。
表3BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤的影响
注：与对照组比较，*为P＜0.05
如图4所示，对照组与实验组体重比较无明显差别，动物也未观察到明显体征变化，表明BS-HH-002在这两个剂量下，无明显毒副作用。
图5显示了BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤影响的动态曲线。如图5所示，BS-HH-002具有明显的抑瘤作用，但是剂量依赖关系不明显。
图6显示BS-HH-002显著减小了NOD/SCID鼠白血病移植瘤的重量。
图7显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤重量的影响。
图8显示BS-HH-002对NOD/SCID鼠白血病移植瘤的抑制作用。
如上述表和图所示，在动物体内实验中，BS-HH-002在剂量0.1和0.3mg/kg下对白血病移植瘤的抑制率均超过40％。从始末体重看，BS-HH-002对动物体重影响不大，表明无明显毒性。
实验7-2：BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤的抑制作用
(1)实验材料：
胃癌细胞株：MGC-803
动物：BALB/c-nu裸鼠，8周，雌性，购自中国科学院上海实验动物中心
(2)试剂：BS-HH-002，BS-HH-002-0.1为0.1mg/kg/次的剂量，BS-HH-002-0.3为0.3mg/kg/次的剂量，BS-HH-002-0.5为0.5mg/kg/次的剂量，BS-HH-002-1.0为1.0mg/kg/次的剂量
(3)主要仪器：细胞培养箱，超净工作台，层流架
(4)实验方法
无菌条件下收集对数生长期上述肿瘤细胞，以2×107/0.2ml/只裸鼠的细胞量(活细胞率＞95％)，经皮下注射于裸鼠右腋下，建立BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤模型。接种后第三天开始给药，实验组按实验设计量灌胃，阴性对照组用无菌水灌胃，每只鼠每次灌胃0.4ml，每天用药次数及剂量见表1。每天单次给药时间为8点，两次给药时间为8点，14点，三次给药时间为8点，14点，20点，给药间隔时间为6小时，连续给药10天。以给药前一天为第0天，每隔约5天测体重及瘤径，做出体重及肿瘤生长动态图。第27天解剖取出瘤体称重，以对照组抑瘤率为0，计算出药物作用后的肿瘤抑制率(％)。
测定值用平均数±标准误(M±SD)表示，各组实验数据采用SPSS18.0统计软件中的One-wayANOVA法分析，P＜0.05作为具有统计学差异显著性。
表4BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤的影响
注：与对照组比较，*为P＜0.05，**为P＜0.01
图9显示了BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠体重影响的动态曲线。
图10显示BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤影响的动态曲线。
图11显示了BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤重量的影响。
图12显示了BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤重量的影响。
图13显示了BS-HH-002对BALB/c-nu裸鼠胃癌移植瘤的抑制作用。
如以上这些图所示，在体内实验中，BS-HH-002对胃癌的抑瘤率均达到40％以上，瘤重与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，其中，每天给药3次，每次剂量1.0mg/kg试验组与对照组比差异非常显著(P＜0.01)。另外，从始末体重看，给药组体重与对照组体重均明显上升，且趋势基本一致，并且，到解剖时止，各组均无动物死亡，说明各个剂量组都未对动物造成明显毒副作用。

Claims (8)

1.通式(I)或通式(II)的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，
其中，R1选自C1-C6烷基、苯基、呋喃基、任选被卤素取代的吡啶基、任选被甲基取代的噻唑基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基，R2选自C1-C6烷基。
2.根据权利要求1的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1选自甲基、呋喃基、任选被卤素取代的吡啶基、任选被甲基取代的噻唑基、苯基和环戊基。
3.根据权利要求1的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐，其为选自下组的化合物：
4.一种制备如权利要求1-3任一项定义的通式(I)化合物的方法，
包括
1)将任选被活化的高三尖杉酯碱与有机酸R1CO2H缩合酯化；
2)将高三尖杉酯碱与有机酰氯R1COCl或有机酸酐(R1CO)2O缩合酯化；或
3)将活化的有机酸R1CO2H与高三尖杉酯碱反应；
以获得通式(I)的化合物，
其中R1如权利要求1-3中任一项所定义。
5.一种制备如权利要求1-2任一项中所定义的通式(II)化合物的方法，包括
1)将任选被活化的高三尖杉酯碱与有机酸R1CO2H缩合酯化，其中R1＝R2，或将任选活化的通式(I)的化合物与有机酸R2CO2H缩合酯化；
2)将高三尖杉酯碱与有机酰氯R1COCl或有机酸酐(R1CO)2O缩合酯化，其中R1＝R2；或将通式(I)的化合物与有机酰氯R2COCl或有机酸酐(R2CO)2O缩合酯化；或
3)将活化的有机酸R1CO2H与高三尖杉酯碱反应，其中R1＝R2，或将活化的有机酸R2CO2H与通式(I)的化合物反应；
以获得通式(II)的化合物，
其中R1和R2如权利要求1-2中任一项所定义。
6.一种药物组合物，其中包含权利要求1-3中任一项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐和药学上可以接受的赋形剂。
7.权利要求1-3中任一项的高三尖杉酯碱酰化衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中，所述肿瘤选自白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、胃癌、乳腺癌、胆管细胞癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、骨肉瘤、人宫颈癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、食管癌、中耳肿瘤、黑色素瘤和前列腺癌。
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