CN103626800A - 福司曲星衍生物、其药用用途及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类下列通式（I）所示的新型Fostrecin（福司曲星或FST）衍生物，它们的药用用途，及它们的制备方法，并进一步涉及这种化合物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度生长或降低心肌梗塞及其对细胞的损伤的药物组合物中的应用。

Description

福司曲星衍生物、其药用用途及制备方法

本申请为申请号为200810091830.4，发明名称为“福司曲星衍生物及其药用用途”的申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一类新型的福司曲星衍生物，特别涉及一系列新型硫代磷酸、磷酸类似物或磷酸模拟物的福司曲星衍生物（FST衍生物）,以及这类化合物的制备方法和在制备抗肿瘤、抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。 

背景技术

福司曲星(Fostriecin或FST)是最初从土壤微生物Streptomyces pulveraceus中分离出来一类新型磷酸脂的聚酮化合物(1983)，并且也在2001年由Boger实验室成功地被化学全合成出，同时也从天然的FST产生菌株分离检测到其它FST类似结构化合物PD113270和PD113271,其结构式如下所示（见Lewy et al.,2002）。 

已知FST体外对白血病、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等肿瘤细胞具有活性（白血病细胞L1210，IC50=0.46mM），体内也表现出好的抗肿瘤疗效。一般认为FST的抗肿瘤活性来自于对蛋白磷酸酶PP2A（IC50=1.5nM）和PP4（IC50=3nM）的选择性抑制。有报道化学合成和天然产生的FST类似物具有相似的活性，关于FST及其类似物的更多信息，参见Lewy et al.,2002,"Fostriecin:Chemistry and Biology"Current Medicinal Chemistry9:2005-2032,以此作为参考。FST的I期临床试验由于产品不同批次间化学纯度难以控制以及化合物的在体内外的稳定性较弱而停止（如FST去磷酸化成为无活性的去磷酸FST）。 因此发明制备高纯度，尤其是高稳定性的FST衍生物是有很大的必要性。 

FST是拓扑异构酶II的弱抑制剂（IC₅₀=50mM），但却是PP2A和PP4的最有选择性的抑制剂。由于其它蛋白磷酸酶抑制剂如大田软海绵酸（okadaic acid）和花萼海绵诱癌素（calyculin A）通常具有肿瘤促进活性而非抗肿瘤活性，所以FST的抗肿瘤活性和酶抑制活性间的关系令人非常感兴趣。另外值得注意的是FST能促进染色质的紧缩（compaction）并使肿瘤细胞对放疗敏感。因此为了能获得治疗肿瘤或其它疾病有效的治疗方案，无论是单独用药还是联合用药，需要开发新型FST类似物。如果能制备稳定性更高的FST衍生物，这样的化合物可能在临床上更有效，从而也就有了更加有效的治疗癌症的手段。将有望成为新型作用机制的新型抗肿瘤药物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一系列新型更稳定的FST化合物；并提供了该类化合物的制备方法,如采用化学修饰和/或基因操作的方法。本发明进一步提供了这类新型FST化合物在制备抗肿瘤、抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。 

本发明提供的福司曲星衍生物，具有如下通式（I） 

其中， 

R1为 

R1不为磷酸基； 

R2,R3，R4各自独立地选自H，OH，OR5，NHR₆和低级烷基； 

W为O,O-CRjRj或NRj； 

G为P，S或C； 

X为SR6，OR5或NHRj，当G为硫S时，X为=NRj或=O； 

Y为OR5，NHRj，未取代的低级烷基或被羟基、低级酰氧基、低级烷酰基、低级烷氧基、氨基、卤素、低级烷酰氨基或低级酰基氨基取代的低级烷基，或CF3； 

R5和R6分别为H,Na,K，或未取代的低级烷基或被羟基、低级酰氧基、低级烷酰基、低级烷氧基、氨基、卤素、低级烷酰氨基、低级酰基氨基取代的低级烷基； 

当G为C时，X不存在； 

Rj为H,OH,烷基或卤素，其中所述卤素优选为F。 

Rn为O,NRj或S。 

上述的“低级”所指的碳数为1-4个碳。 

其中，通式I化合物可以利用FST或其衍生物如前述的PD113270，通过生物或/和化学修饰而脱磷酸,再进行磷酸衍生物修饰而制得。 

本发明的化合物包括具有通式（II）的FST衍生物，其为硫代磷酸FST,见下式(II)。 

首先，脱磷酸FST可通过生物化学酶解(如实施例1所述)或通过本发明所述的重组基因工程菌株发酵获得(如实施例2所述)。此重组基因工程菌株包含了一种修饰后的FST生物合成酶基因，所修饰的基因是通过DNA重组技术使FST产生菌中的FST生物合成酶基因中编码磷酸化激酶（homoserine kinases）的DNA序列（fosK基因）通过突变、缺失或取代而失活。该磷酸化酶（激酶）FosK在FST生物合成中负责FST磷酸化。 

脱羟基FST可以通过本发明所述的重组基因工程菌株发酵获得。该菌包含了一种修饰后的FST生物合成酶基因，所修饰的基因是通过DNA重组技术使FST产生菌中的FST生物合成酶基因中编码的3个细胞色素P450羟基化酶的DNA序列通过突变如缺失或取代而分别失活。FST生物合成酶中包含有3个P450基因编码羟基化酶分别负责作用于FST在C8和C18位以及PD113,271在C4位上的羟基化。 

本发明提供的基因工程菌株是通过重组技术获得的，该技术利用同源重组的方法将所需被改变的基因或功能基团的相邻区域克隆到自杀载体中，通过自杀载体中的基因与宿主细胞核所含基因组中的同源基因进行双杂交重组，导致参与FST生物合成的一个或多个基因或功能基团失活或被取代，而得到重组的基因工程生产菌株。这种失活作用可通过随机或点基因突变，缺失或取代来完成。由此得到的重组的生物合成基因不同于天然的生物合成基因，它可以在重组宿主细胞中产生FST衍生物为主要产物。 

在本发明的一些实施方案中涉及的通式I化合物可通过化学反应式解1中描述的通用方法，由去磷酸FST或其衍生物制得。进一步优选的化合物A,也可通过实施例3中描述的方法或化学反应式解1中描述的通用方法由去磷酸FST制得。化学反应式解1： 

Alkaline phosphatase：碱性磷酸酶； 

2,6-lutidine：2,6-二甲基吡啶。 

1.将FST生物化学酶解获得脱磷酸FST 

2.保护基团可以存在于FST化合物中，并且应该保护所涉及的官能团以 防止不需要的副反应，如酰化，醚化，氧化，溶剂解和类似的反应。保护基团的特征是它们本身易于通过溶剂解，还原，光解或通过酶活性除去，并且不存在于最终产物中。如用TBDPS保护基团首先保护FST中11-和18-位的主要游离羟基，再通过TES或TBS保护基团选择性将FST中8-位的游离羟基进行保护，获得保护的去磷酸FST中间体（P-S）。 

3.保护的去磷酸FST中间体（P-S）与二-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（bis-(2-cyanoethyle)-N,N-diisopropylphosphoramidite）和四唑反应，然后再加硫，获得保护的硫代磷酸FST中间体。 

4.保护的硫代磷酸FST中间体通过在甲醇中的氢氧化钾反应除去硫代磷酸上保护的二（2-氰乙基）基团，再利用本领域公知的方法可以进行羟基保护基团的去保护，如HF-MeCN中的HF-吡啶处理进行去保护而获得硫代磷酸FST衍生物A。 

在本发明的一些实施方案中涉及的通式I化合物可通过化学反应式解2中描述的通用方法由去磷酸FST或其衍生物制得。如进一步优选化合物B，C和D,该类化合物B可参见实施例4中描述的方法由去磷酸FST制得。 

化学反应式解2： 

1.在甲苯中，磷酸二乙酯、多聚甲醛和三乙胺混合物加热至87C反应2小时，可制备获得Ps-3化合物。 

2.在THF中，2M的叔丁氧基锂溶液加入到保护的去磷酸FST中间体（P-S）中，与Ps-3反应制得P-S2。 

3.利用三甲基溴硅烷将乙氰中P-S2的甲氧磷酸上的二个乙基基团除去。 

4.再利用本领域公知的方法可以进行羟基保护基团的去保护，如HF-MeCN中的HF-吡啶处理进行去保护而获得甲氧磷酸FST衍生物B。 

5.P-S2化合物可通过与THF中的二（三甲硅基）胺钠（sodium bis(trimethylsilyl)amide）和氟化剂，如SELECTFLUOR（Air Products&Chemicals，Inc.制造）或固体的N-氟-苯磺酰亚胺（N-fluoro benzenesulfonimide(NSFI)）反应，获得α-氟化甲氧磷酸FST衍生物中间体。 

6.α-氟化甲氧磷酸FST衍生物中间体可继续通过二（三甲硅基）胺钠和 氟化剂氟化，获得二氟甲氧磷酸FST衍生物中间体。 

7.α-氟甲氧磷酸FST衍生物与二氟甲氧磷酸FST衍生物中间体可通过上述步骤3和4分别获得去保护的化合物C和D。 

P-S2也可以通过化学反应式解2B中描述的通用方法由P-S制得。 

在盐酸下通过多聚甲醛处理保护的去磷酸FST中间体而获得甲基氯衍生物，与三乙基磷反应也可获得P-S2。P-S2化合物与在DMF中的三甲基溴硅烷反应后，用NH₄OH处理可获得保护的B-2中间体，通过去保护获得化合物B-2。 

在本发明的一些实施方案中涉及的通式I化合物可通过化学反应式解3中描述的通用的酰化方法制备，如由去磷酸FST衍生物制得进一步优选的化合物E或F。 

化学反应式解3： 

通过P-S与酰氯在吡啶、二氯甲烷下反应，获得保护的酰化FST衍生物，再通过乙氰中的HF-吡啶处理进行去保护而获得化合物E。化合物E中进一步优选的化合物F也可通过P-S酰胺化制备。 

本发明的一些实施方案中涉及的通式I化合物进一步优选化合物G可通过化学反应式解4中描述的通用方法由去磷酸FST衍生物可制得。 

化学反应式解4： 

1.将保护形式的FST衍生物P-S通过使用四（三苯膦）合鈀形成烯丙基钯π配对物，接用叠氮化钠处理。再用三甲基膦还原，制得氨基-FST衍生物P-S3。 

2.通过使用标准的酰胺键偶合剂如二苯基磷酰基叠氮化物(diphenylphosphoryl azid)/NaHCO₃或EDC/HOBT（1-羟基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole））或溴代三吡咯烷基磷六磷酸盐（PyBroP），由P-S3与酸进行相应酰胺化，获得保护的中间体。 

3.通过乙氰中的HF-吡啶处理进行去保护而获得化合物G。 

本发明的一些实施方案中涉及的通式I化合物进一步优选化合物H可通过化学反应式解5中描述的通用方法由氨基-FST衍生物P-S3可制得。 

反应式解5： 

通过P-S3与氯代甲基硫酸(或氯代磷酸)衍生物在Et3N（三乙基胺）、二氯甲烷下反应，获得保护的甲基硫酸氨FST衍生物H(其中R7优选为甲基)或氯代磷酸氨FST衍生物，再通过乙氰中的HF-吡啶处理进行去保护而获得化合物。 

化合物G或H也可以通过化学反应式解6中描述的通用方法由去磷酸FST衍生物P-S可制得。 

化学反应式解6： 

将保护形式的FST衍生物P-S通过使用四（三苯膦）合鈀形成烯丙基钯π配对物，接着用胺（如酰胺或硫酸铵、磷酸铵）处理，可获得保护的中间体，再通过乙氰中的HF-吡啶处理进行去保护而获得化合物。 

在其他实施方案中，本发明提供通式（I）中优选具有下面结构的化合物，可通过本领域公知的方法和本文描述的方法制备。 

利用本领域技术人员公知的常规分析方法可以筛选本发明的化合物，如可以测定化合物的细胞毒性，药物的体内外稳定性。本发明进一步提供了具有通式（I）的FST衍生物在制备抗肿瘤、抑制细胞过度增长和中止细胞生长或降低心肌梗塞及其对细胞损伤的药物组合物中的应用。 

本发明的化合物可以是自由形式或其衍生物（如其盐或其酯）、其结合体或其前药。化合物可以是任何形态的，如固态、半固态或液态。本发明所述的化合物可与药学上可接受的载体或稀释剂配制成用于口服、静脉给药或皮下给药的制剂，可按标准方法使用适用于所需的给药方式的固体或液体载体、稀释剂和添加剂配制药物组合物。对于口服制剂，本发明化合物可以片剂、胶囊、颗粒、粉末等形式给药，本发明化合物的剂量范围为约0.05至200mg/kg/天，可以单剂量或3至10个分剂量的形式给药。硫代磷酸FST（A）、甲基磷酸FST（B）和FST的体外抗肿瘤活性（IC₅₀；μM）如下。人白血病瘤株(HL60):FST(IC₅₀值为12μM),化合物A(IC₅₀值为10.5μM),化合物B(IC₅₀值为12.5μM);人肺癌瘤株(NCI-H460):FST(IC₅₀值为14.5μM),化合物A(IC₅₀值为13.2μM),化合物B(IC₅₀值为16.3μM)。 

附图说明

图1显示了FST衍生物和FST对碱性磷酸酶的稳定性。 

具体实施方式

实施例1：碱性磷酸酶水解制备脱磷酸FST 

反应条件：将FST溶解在pH8.3浓度为75mM Tris Buffer和5mM MgCl₂溶液中，FST浓度为20mM，每毫克福司曲星加入1至1.5单位的碱性磷酸酶，37℃酶解2-5小时。获得脱磷酸FST（C₁₉H₂₆O₆）的MS（ESI+）：351[M+H]⁺。 

图1显示了FST在碱性磷酸酶酶解下逐步生成脱磷酸FST。 

实施例2.基因重组产生脱磷酸FST 

本实施例的方法使用能生产FST的宿主菌进行基因操作。用于本发明的FST生物合成的基因和DNA序列可从天然资源，如从FST天然生产菌株中制备得到。 

将FST生物合成酶基因中编码磷酸化激酶（a homoserine kinases）的DNA序列（即FosK基因）通过插入新霉素抗性基因失活而导致FST产生菌产生去磷酸FST，而不产FST。再通过类似于天然的FST发酵工艺对工程菌株进行发酵生产，并可从发酵液中分离提取获得本发明化合物去磷酸FST。 

实施例3硫代磷酸FST的制备 

1.脱磷酸FST可以按实施例1中利用FST的生物化学酶解获得。 

2.将上述步骤1产品进行TBDPS保护（TBDPSCl，咪唑），并利用Boger 等人的描述方法（J.Am.Chem.Soc.,2001）用TES选择性保护（TBSOTf，2,6-lutidine），在25C处理10分钟后,让混合物蒸干，进行SiO₂色谱提纯，获得保护的去磷酸FST中间体（P-S）。保护的去磷酸FST中间体（12mg）溶于二氯甲烷（3ml）中，加入在MeCN中的二-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺（0.1ml）和四唑(1M,0.7ml)溶液，反应混合物在室温下搅拌过夜，然后再加入75mg的硫，继续在室温下搅拌4小时，让混合物蒸干，进行SiO2色谱提纯，获得保护的硫代磷酸FST中间体。 

3.保护的硫代磷酸FST中间体（4.9mg）溶解在2ml的1N的KOH甲醇溶液中，室温下搅拌2小时，再利用本领域公知的方法进行羟基保护基团的去保护，如HF-MeCN中的HF-吡啶处理进行去保护而获得硫代磷酸FST衍生物A。利用反相层析C18色谱提纯。硫代磷酸FST（C₁₉H₂₇O₈PS）的MS（ESI+）：447[M+H]⁺

实施例4甲基磷酸FST的制备 

1.在150ml CH₂Cl₂中的0.22molP-S化合物中加入多聚甲醛（0.23mol）,在5C下将盐酸以气态用气泡通入上述溶液2小时，用MgSO₄干燥，过滤后蒸干滤液，获得氯代FST中间体。 

2.将步骤1制得的产物（0.1mol）与三乙基磷一起加热至110C，保持3小时，真空干燥，用SiO₂色谱提纯产品P-S2。 

3.处理保护的去磷酸FST中间体而获得甲基氯衍生物，与三乙基磷酸反应也可获得P-S2。 

4.将三甲基溴硅烷（1.56g）加入到1g P-S2和0.9g乙氰混合物中，保持温度不超过50℃，再用0.3g乙氰洗涤，混合物在70℃左右回流3小时，真 空干燥，用SiO₂色谱提纯产品。 

5.再利用本领域公知的方法可以进行羟基保护基团的去保护，如HF-MeCN中的HF-吡啶处理进行去保护而获得甲氧磷酸FST衍生物B。甲基磷酸FST（C₂₀H₂₉O₉P）的MS（ESI+）：445[M+H]⁺。 

Claims (8)

1.具有如下通式（I）的化合物： 

式I 

其中， 

R₁为 

R₁不为磷酸基； 

R₂, R₃，R₄各自独立地选自H，OH，OR5，NHR₆和C_1-4烷基； 

W为O, O-CRjRj或NRj； 

G为P，S或C； 

X为SR₆，OR₅或NHRj，当G为硫S时，X为=NRj或=O； 

Y为OR₅，NHRj，未取代的C_1-4烷基或被羟基、C_1-4酰氧基、C_1-4烷酰基、C_1-4烷氧基、氨基、卤素、C_1-4烷酰氨基或C_1-4酰基氨基取代的C_1-4烷基，或CF₃； 

R₅和R₆分别为H,Na,K，或未取代的C_1-4烷基或被羟基、C_1-4酰氧基、C_1-4烷酰基、C_1-4烷氧基、氨基、卤素、C_1-4烷酰氨基、C_1-4酰基氨基取代的C_1-4烷基； 

当G为C时，X不存在； 

Rj为H,OH,烷基或卤素； 

Rn为O,NRj或S。 

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的R₁选自如下结构： 

其中，R7为甲基或CF₃。 

3.如权利要求1所述的化合物，其为通式（II）所示的化合物： 

4.如权利要求1所述的化合物，其为通式（III）所示的化合物： 

5.如权利要求1所述的化合物，其选自下列化合物： 

。

6.权利要求1～5任一项所述的化合物在制备抗肿瘤、抑制细胞过度增长、中止细胞生长、或降低心肌梗塞及其对细胞损伤的药物组合物中的应用。 

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于该药物组合物包含一种或多种权利要求1～5所述的化合物和药物可接受的载体和/或稀释剂。 

8.制备权利要求1～5任一项所述的化合物的方法，其包括利用FST或其衍生物，通过生物或/和化学修饰而脱磷酸，再进行磷酸衍生物修饰而制得。 

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