CN103623750A - 一种解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的制备方法，其包括如下步骤：1）将解淀粉芽孢杆菌Sh1溶液、乳液、悬液或浆状物与明胶溶液均匀混合；2）将步骤（1）所获得混合物进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊；其特征在于，在所述步骤2）喷雾干燥步骤中，空气流量为600-800L/h。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊制备方法

技术领域

本发明属于水产饲用微生物添加剂技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊制备方法。该解淀粉芽孢杆菌Sh1已经在申请号为201010264180.6、申请人为上海海洋大学、名称为一种水霉拮抗菌及其应用的中国发明专利中公开，相应的生物保藏信息为：CCTCC No：M20101292010.06.02）。

背景技术

近年来，集约化水产养殖业的快速发展导致作为水产动物疾病治疗剂和生长促进剂的抗生素过度滥用，使水产品安全受到日益严峻的挑战，并引起了一系列环境、卫生和社会问题。目前，欧洲、美国、日本等发达国家已明令禁用抗生素作为饲料添加剂，并在积极地寻找抗生素的替代品。因此，水产养殖业迫切需要既能满足无公害要求又能使水产动物快速、健康生长的新型饲料添加剂。众多研究表明，益生菌作为饲料添加剂饲喂水产养殖动物，能够有效控制水产动物病原菌的增殖、促进动物生长作用，同时不会出现耐药性，也不存在有害残留或污染等副作用，有望成为替代抗生素、控制动物疾病的最有效的工具之一。其中益生性芽孢杆菌以其具有抗逆性强、耐储藏、应用条件不苛求等优良性状成为目前应用最为广泛的一种益生菌，已经被美国FDA、中国农业部列入可直接用于饲料添加剂的菌种目录。然而，益生菌饲料添加剂普遍存在产品含量低、产品稳定性差等问题，极大阻碍了微生物饲料添加剂产业的健康可持续发展。

此外，喷雾干燥法是以单一工序将溶液、乳液、悬液或浆状物经雾化器作用，喷成非常细微的雾滴，并依靠干燥介质（热空气、冷空气、烟道气或惰性气体）与雾滴均匀混合，进行热交换和质交换，使得溶剂气化或使得熔融物固化，最终加工成粉状干燥制品的一种干燥法，其操作费用低，生产效率高，生产过程简单，产品的分散性和溶解性较好，是食品或食品添加剂行业普遍采用的生产方法之一。例如，程艳薇等利用喷雾干燥技术生产了嗜酸乳杆菌菌粉，为生产泡椒的稳定与缩短发酵时间提供了有力的保障，戚薇等采用喷雾干燥的方法制备了凝结芽孢杆菌微胶囊，大大提高了凝结芽孢杆菌的保藏期。目前普遍对于喷雾干燥技术制备的微胶囊的有效含菌量不高，对于解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊来说，其有效含菌量成为一个大规模工业应用的关键因素。因此，对于如何调节喷雾干燥技术的条件以制备高有效含菌量的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊方面的研究，是很需要的。

发明内容

为克服现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种高有效含菌量的解淀粉芽孢杆菌Sh1（保藏编号：CCTCC No.M2010129）微胶囊的制备方法，其包括如下步骤：

1）将解淀粉芽孢杆菌Sh1溶液、乳液、悬液或浆状物与无菌明胶溶液均匀混合；

2）将步骤（1）所获得混合物进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊粉末，其特征在于，在所述步骤2）喷雾干燥步骤中，空气流量为600-800L/h。

明胶是一种亲水性高分子胶体，来源广泛，价格低廉，乳化性、成膜性能好，理化性能稳定，且不易与油脂类分子发生反应，因此经常会被用作微胶囊壁材，明胶是一种良好的喷雾干燥热保护剂，本发明披露的喷雾干燥法制备解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的明胶溶液浓度为2-6%，优选为3%。该明胶溶液浓度使得解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量最大化。

进风温度和进料速度是影响解淀粉芽孢杆菌Sh1喷雾干燥工艺优劣的关键参数，进料速度和进风温度都会对解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效效含菌量产生影响，且前者的影响要大于后者。本发明的喷雾干燥法制备解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的方法，其喷雾干燥步骤中，最适进风温度为110℃-170℃，最优选为155℃；最适进料速度为6-14ml/min，最优选为8ml/min。在这些条件下，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的质量高，尤其是有效含菌量高。

空气流量的大小决定进料速度和壁材的流化状态，因而是影响喷雾干燥质量和微胶囊颗粒均匀性的重要参数。因此，在喷雾干燥工艺中确定合适的空气流量既能够防止壁材过多地吸附于柱筒壁上，又可以保证壁材充分流化。空气流量对微胶囊颗粒的壁厚大小具有明显的影响。本发明的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊制备方法的喷雾干燥步骤中的空气流量为600-800L/h，最优选为700L/h时的颗粒形态比较均一。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明：

图1为柱状图，显示了本发明明胶溶液浓度对解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊有效含菌量的影响；

图2为柱状图，显示了进风温度对解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊有效含菌量的影响；

图3为柱状图，显示了进料速度对解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊有效含菌量的影响；

图4为柱状图，显示了空气流量对解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊有效含菌量的影响；

图5为本发明的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊制剂在显微镜下的形态。

具体实施方式

图1的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为明胶溶液浓度。从该柱状图可以看出，当明胶溶液浓度为3%时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量最高。当明胶溶液浓度为2%时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量的对数值比明胶溶液浓度为3%时降低了6.92%（P<0.05）；当明胶溶液浓度分别为4%、5%和6%时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量随明胶溶液浓度的增加而逐渐降低，其有效含菌量的对数值比明胶溶液浓度为3%时也分别降低了2.16%（P<0.05）、5.11%（P<0.05）和8.74%（P<0.05）。

图2的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为进风温度。从该柱状图可以看出，当进风温度为150℃时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量最高。当进风温度为110℃、120℃、130℃和140℃时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量随进风温度的升高而逐渐增加，其有效含菌量的对数值分别相当于进风温度为150℃时的89.37%（P<0.05）、91.30%（P<0.05）、97.56%（P<0.05）和98.78%（P>0.05）；当进风温度为160℃和170℃时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量随进风温度的升高而逐渐减少，其有效含菌量的对数值比进风温度为150℃时分别降低了4.87%（P<0.05）和8.75%（P<0.05）。

图3的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为进料速度。从该柱状图可以看出，当进料速度为10ml/min时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量最高。当进料速度为6ml/min和8ml/min时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量的对数值比进料速度为10ml/min时分别降低了16.39%（P<0.05）和4.21%（P<0.05）；当进料速度为12ml/min和14ml/min时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量较进料速度为10ml/min时也分别降低了7.53%（P<0.05）和14.06%（P<0.05）。

图4的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为空气流量。从该柱状图可以看出，当空气流量为700L/h时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量最高。当空气流量为600L/h和650L/h时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量的对数值比空气流量为700L/h时降低了17.83%（P<0.05）和4.21%（P<0.05）；当空气流量为750L/h和800L/h时，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的有效含菌量的对数值比空气流量为700L/h时也分别降低了7.53%（P<0.05）和32.45%（P<0.05）。

图5显示了解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的微胶囊在显微镜下的镜像，解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的微胶囊颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，颗粒粒径分布基本均匀，平均大小为9.22μm。

材料与方法

实验材料

解淀粉芽孢杆菌Sh1，为优良的水霉拮抗菌，保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏编号：CCTCC No.M2010129）；无菌生理盐水（0.85%）；明胶、普通营养琼脂培养基、营养肉汤，均购于国药集团（上海）化学试剂有限公司，以上培养基均于121℃灭菌20min；小型喷雾干燥机，购于上海世远生物工程有限公司。

技术参数

1、最大蒸发水量：1800ml/h；水；

2、进风温度：30～250℃±1℃；

3、出风温度：30～120℃；

4、鼓风机干燥空气流量：正常空气流量70m3/h（最大330m3/h）；压力686Pa；

5、鼓风机功率：0.1KW/220V；

6、管道电加热器能力：3.2KW；

7、进风温度加热控制：Pt-100，智能PID控制

8、空气压缩机：0.25KW，最大产气量4.2m3/h,工作压力2～5bar；

9、喷雾系统：带有标准0.7mm口径双流体喷嘴（内部混合），也可选择其他尺寸的喷嘴；

10、平均干燥时间：1.0～1.5秒；

11、自动排堵装置：自动通针排堵疏通频率可调，周期设定范围为0～60秒/次；

12、与产品接触材料：耐酸316L不锈钢，3.3硼硅玻璃；

13、尺寸(W×D×H）：700×650×1100mm；

14、电源电压：220/230V，50～60Hz；

15、整机额定功率：3.8KW；

16、重量：58kg

制备过程

1、准备原料：即准备解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液、无菌明胶溶液；2、调配：即解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液与无菌明胶溶液按照一定的比例混合；3、均质：即将解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液与无菌明胶溶液的混合物在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并插入喷雾干燥机的进料管；4、喷雾干燥：即先打开空气压缩机（上海复宏机电有限公司生产），将压缩机的压力调到0.6~0.8MPa，待压缩机内部压力达到这一数值时，气压稳定，打开喷雾干燥机的开关，然后分别设置喷雾干燥的通针频率、进料速度、进风温度和空气流量参数，其中，通针的作用是防止进料堵塞了喷气孔，所以需要根据原料的不同粘稠度调节合适的通针频率；5、收集微胶囊粉末，收集器收集喷雾干燥产生的微胶囊粉末，并用无菌条件下将微胶囊粉末从收集器中取出；6、检测，即检测微胶囊的颗粒粒径，形态及含菌量。解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液的制备

将解淀粉芽孢杆菌Sh1接种于无菌营养肉汤中，于30℃、150r/min摇床振荡培养24h，然后将培养液于4℃、4000r/min离心20min，用无菌生理盐水洗涤2次后，用无菌生理盐水将解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液浓度调节为3.6×109cfu/mL，于4℃冰箱保存备用。

实施例1

无菌操作取解淀粉芽孢杆菌Sh1悬液1mL加入浓度分别为2%、3%、4%、5%、6%的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进风温度130℃、进料速度10ml/min、空气流量700L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同明胶溶液浓度下制备的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊进行有效含菌量的测定。

实施例2

无菌操作取解淀粉芽孢杆菌Sh1的悬液1mL加入浓度为3%的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进风温度分别为110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃以及进料速度10ml/min、空气流量700L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同进风温度下制备的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊进行有效含菌量的测定。

实施例3

无菌操作取解淀粉芽孢杆菌Sh1的悬液1mL加入浓度为3%的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进料速度分别为6、8、10、12、14ml/min以及进风温度150℃、空气流量700L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同进料速度下制备的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊进行有效含菌量的测定。

实施例4

无菌操作取解淀粉芽孢杆菌Sh1的悬液1mL加入浓度为3%的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在空气流量分别为600、650、700、750、800L/h以及进风温度150℃、进料速度10ml/min、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同空气流量下制备的解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊进行有效含菌量的测定。

解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的形态观察

用双面胶将解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊固定于扫描电子显微镜的样品台上，然后在离子溅射仪中镀一薄层金，最后用扫描电子显微镜观察其形态并拍照。

解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊有效含菌量的测定方法

无菌操作取解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊0.05g于9ml无菌蒸馏水中，于37℃水浴溶解后采用稀释涂布平板法进行有效含菌量的测定(cfu/g)。

表1解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊喷雾干燥工艺正交试验（L9(34)）因素水平

解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊喷雾干燥工艺的最佳组合为明胶溶液浓度为3.0%，进风温度为155℃，进料速度为8ml/min，空气流量为700L/h。解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊在该最佳条件下的有效含菌量为1.91×109cfu/g。极差分析结果（表2）表明，明胶溶液浓度、进风温度、进料速度、空气流量等四个因素对喷雾干燥工艺的影响程度为：明胶溶液浓度>进料速度>空气流量>进风温度。

表2解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊喷雾干燥工艺确定L9(34)正交试验设

计及极差分析

但是，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变形都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (8)

1.一种制备解淀粉芽孢杆菌Sh1微胶囊的方法，其包括如下步骤：

1）将解淀粉芽孢杆菌Sh1溶液、乳液、悬液或浆状物与明胶溶

液均匀混合；

2）将步骤（1）所获得混合物进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊；

其特征在于，在所述步骤2）喷雾干燥步骤中，空气流量为600-800L/h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述空气流量为700L/h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述步骤2）喷雾干燥步骤中，进风温度为110℃-170℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述进风温度为155℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在所述步骤2）喷雾干燥步骤中，进料速度为6-14ml/min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述进料速度为8ml/min。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述明胶溶液的浓度为2-6%。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述明胶溶液浓度为3%。

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