CN103719535B - 一种噬菌蛭弧菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种噬菌蛭弧菌微胶囊，所述微胶囊的壁为明胶，颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，所述颗粒粒径大小为3～12μm，分布基本均匀，且其中，噬菌蛭弧菌的含量为3.69×107pfu/g～3.70×107pfu/g，大肠杆菌DH5α的含量为8.6×109cfu/g～2.10×1010cfu/g。本发明还提供了该微胶囊的制备方法，其包括步骤：1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备；2)噬菌蛭弧菌培养液的制备；和3)将步骤1)的大肠杆菌DH5α菌悬液和步骤2)的噬菌蛭弧菌培养液与无菌明胶溶液均匀混合后，进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊。该微胶囊明显增加水产养殖业中的抗感染效果。
Description
技术领域
本发明属于水产饲用微生物添加剂技术领域，尤其涉及一种噬菌蛭弧菌微胶囊及其制备方法。
背景技术
近年来，集约化水产养殖业的快速发展导致作为水产动物疾病治疗剂和生长促进剂的抗生素过度滥用，使水产品安全受到日益严峻的挑战，并引起了一系列环境、卫生和社会问题。目前，欧洲、美国、日本等发达国家已明令禁用抗生素作为饲料添加剂，并在积极地寻找抗生素的替代品。因此，水产养殖业迫切需要既能满足无公害要求又能使水产动物快速、健康生长的新型饲料添加剂。众多研究表明，益生菌作为饲料添加剂饲喂水产养殖动物，能够有效控制水产动物病原菌的增殖、促进动物生长作用，同时不会出现耐药性，也不存在有害残留或污染等副作用，有望成为替代抗生素、控制动物疾病的最有效的工具之一。
其中噬菌蛭弧菌是一种具有独特噬菌特性的弧形或杆形细菌，是养殖水体环境致病菌滋生的天然生物控制因子，能够有效地控制养殖水体的亚硝酸盐和氨氮的含量，对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。然而，我国噬菌蛭弧菌制剂绝大多数为液体制剂和冻干粉剂，但液体制剂普遍存在菌数下降快，贮藏期短，运输不便，容易受到消化道内高酸、高酶环境的影响而死亡等很多缺陷，冻干粉剂生产成本高，难以满足水产养殖业的要求。
申请号为201110088162.1、名称为一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法的中国发明专利披露了一种粉状噬菌蛭弧菌制剂，但是该制剂同样地易受消化道内高酸、高酶环境的影响，而影响抗感染效果。
发明内容
为克服现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种性价比高的噬菌蛭弧菌新型制剂，即，噬菌蛭弧菌微胶囊，作为水产养殖业的饲料添加剂。
本发明的微胶囊技术采用的是喷雾干燥法，这是以单一工序将溶液、乳液、悬浮液或浆状物经雾化器作用，喷成非常细微的雾滴，并依靠干燥介质(热空气、冷空气、烟道气或惰性气体)与雾滴均匀混合，进行热交换和质交换，使得溶剂气化或使得熔融物固化，最终加工成粉状干燥制品的一种干燥法，其操作费用低，生产效率高，生产过程简单，产品的分散性和溶解性较好，是食品或食品添加剂行业普遍采用的生产方法之一。例如，程艳薇等利用喷雾干燥技术生产了嗜酸乳杆菌菌粉，为生产泡椒的稳定与缩短发酵时间提供了有力的保障，戚薇等采用喷雾干燥的方法制备了凝结芽孢杆菌微胶囊，大大提高了凝结芽孢杆菌的保藏期。
本发明所用噬菌蛭弧菌微胶囊有效含菌量的测定方法为：无菌操作取噬菌蛭弧菌微胶囊0.01g于10ml无菌蒸馏水中，于37℃水浴溶解后采用自来水双层琼脂平板进行有效含菌量的测定(pfu/g)。
本发明噬菌蛭弧菌微胶囊的形态观察方法：用双面胶将噬菌蛭弧菌微胶囊固定于扫描电子显微镜的样品台上，然后在离子溅射仪中镀一薄层金，最后用扫描电子显微镜观察其形态并拍照。
本发明一方面提供了一种噬菌蛭弧菌微胶囊，该微胶囊的壁为明胶，该微胶囊的颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，微胶囊颗粒粒径大小为3～12μm，分布基本均匀，且其中噬菌蛭弧菌的含量为3.69×107pfu/g～3.70×107pfu/g，大肠杆菌DH5α的含量为8.6×109cfu/g～2.10×1010cfu/g。
本发明另一方面提供了一种噬菌蛭弧菌微胶囊的制备方法，其包括如下步骤：
1)在无菌条件下取-70℃甘油保藏的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h后于6000r/min离心20min，用无菌生理盐水洗涤3次，制成2.0×1010cfu/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液。
2)取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104pfu/ml的噬菌蛭弧菌接种于pH7.2的10倍稀释的普通营养肉汤中制成噬菌蛭弧菌培养液，同时在每100ml所述噬菌蛭弧菌培养液中加入步骤1)的大肠杆菌DH5α菌悬液100μl，于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌的活菌含量为4.0×105pfu/ml。
3)将步骤2)的噬菌蛭弧菌培养液与无菌明胶溶液均匀混合后，进行喷雾干燥，最终制备成微胶囊其中，明胶的浓度为1-6％，空气流量设置为650-850L/h，进料速度设置为6-14ml/min，进风温度为120℃-160℃。
明胶是一种亲水性高分子胶体，来源广泛，价格低廉，乳化性、成膜性能好，理化性能稳定，且不易与油脂类分子发生反应，因此经常会被用作微胶囊壁材，明胶是一种良好的喷雾干燥热保护剂。本发明还发现明胶还可以作为噬菌蛭弧菌微胶囊制备的抗热保护剂。本发明披露的喷雾干燥法制备噬菌蛭弧菌微胶囊的明胶溶液浓度为1-6％，优选为2％。该明胶溶液浓度使得噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量最大化。
空气流量的大小决定进料速度和壁材的流化状态，因而是影响喷雾干燥质量和微胶囊颗粒均匀性的重要参数。因此，在喷雾干燥工艺中确定合适的空气流量既能够防止壁材过多地吸附于柱筒壁上，又可以保证壁材充分流化。空气流量对微胶囊颗粒的壁厚大小具有明显的影响。根据本发明的实施例，本发明的噬菌蛭弧菌微胶囊制备方法的喷雾干燥步骤中的空气流量为650-850L/h，最优选为750L/h时的颗粒形态比较均一。
进料速度是影响噬菌蛭弧菌喷雾干燥工艺优劣的关键参数之一，会对噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量产生影响者。根据本发明的实施例，最适进料速度为6-14ml/min，最优选为8ml/min。在这些条件下，噬菌蛭弧菌微胶囊的质量高，尤其是有效含菌量高。
进风温度是影响噬菌蛭弧菌喷雾干燥工艺优劣的关键参数之一，会对噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量产生影响者。根据本发明的实施例，本发明的喷雾干燥法制备噬菌蛭弧菌微胶囊的方法，其喷雾干燥步骤中，最适进风温度为120℃-160℃，最优选为140℃。
根据本发明最优选是的实施例，当明胶浓度为2％、空气流量为750L/h、进料速度为8ml/min、进风温度为140℃时，噬菌蛭弧菌F16微胶囊的有效含菌量最高。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明：
图1为柱状图，显示了本发明明胶溶液浓度对噬菌蛭弧菌微胶囊有效含菌量的影响；
图2为柱状图，显示了空气流量对噬菌蛭弧菌微胶囊有效含菌量的影响；
图3为柱状图，显示了进料速度对噬菌蛭弧菌微胶囊有效含菌量的影响；
图4为柱状图，显示了进风温度对噬菌蛭弧菌微胶囊有效含菌量的影响；
图5为本发明的噬菌蛭弧菌微胶囊在电子显微镜下的形态；
图6为噬菌蛭弧菌微胶囊对异育银鲫抗嗜水气单胞菌S1感染的效果。
具体实施方式
实验材料
噬菌蛭弧菌F16、嗜水气单胞菌S1，购于国家水生动物病原库；大肠杆菌DH5α，购于天根生物基因技术有限公司。蛭菌110，为噬菌蛭弧菌液体制剂，购于南京仕必得生物技术有限公司；粉状噬菌蛭弧菌制剂，以沸石粉作为赋型载体，根据第201110088162.1号中国专利制备而成；异育银鲫，平均体重为46.5±2.3g，购于江苏南通农场。
明胶、普通营养肉汤、琼脂条、无菌蒸馏水和无菌生理盐水，购于上海国药集团化学试剂有限公司；pH7.2的10倍稀释的普通营养肉汤(1/10营养肉汤)、pH7.2的普通营养肉汤、终浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％的明胶溶液、自来水双层琼脂平板，底层琼脂浓度1.5％，上层软琼脂浓度0.6％，均在1×105Pa高压湿热灭菌20min后备用；温控摇床，购于美国Thermo Forma公司；生化培养箱，购于上海一恒生物科技有限公司；全自动灭菌锅和高速离心机，购于日本三洋公司；漩涡振荡仪，购于上海淇特分析仪器有限公司；小型喷雾干燥仪SY-6000，购于上海世远生物设备工程有限公司。
技术参数
1、最大蒸发水量：1800ml/h；水；
2、进风温度：30～250℃±1℃；
3、出风温度：30～120℃；
4、鼓风机干燥空气流量：正常空气流量70m3/h(最大330m3/h)；压力686Pa；
5、鼓风机功率：0.1KW/220V；
6、管道电加热器能力：3.2KW；
7、进风温度加热控制：Pt-100，智能PID控制
8、空气压缩机：0.25KW，最大产气量4.2m3/h,工作压力2～5bar；
9、喷雾系统：带有标准0.7mm口径双流体喷嘴(内部混合)，也可选择其他尺寸的喷嘴；
10、平均干燥时间：1.0～1.5秒；
11、自动排堵装置：自动通针排堵疏通频率可调，周期设定范围为0～60秒/次；
12、与产品接触材料：耐酸316L不锈钢，3.3硼硅玻璃；
13、尺寸(W×D×H)：700×650×1100mm；
14、电源电压：220/230V，50～60Hz；
15、整机额定功率：3.8KW；
16、重量：58kg
制备过程
1、准备原料：即准备噬菌蛭弧培养液、无菌明胶溶液；
2、调配：即噬菌蛭弧培养液与无菌明胶溶液按照一定的比例混合；
3、均质：即将噬菌蛭弧培养液与无菌明胶溶液的混合物在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并插入喷雾干燥机的进料管；
4、喷雾干燥：即先打开空气压缩机(上海复宏机电有限公司生产)，将压缩机的压力调到0.6～0.8MPa，待压缩机内部压力达到这一数值时，气压稳定，打开喷雾干燥机的开关，然后分别设置喷雾干燥的通针频率、进料速度、进风温度和空气流量参数，其中，通针的作用是防止进料堵塞了喷气孔，所以需要根据原料的不同粘稠度调节合适的通针频率；
5、收集微胶囊粉末，收集器收集喷雾干燥产生的微胶囊粉末，并用无菌条件下将微胶囊粉末从收集器中取出；
6、检测，即检测微胶囊的颗粒粒径，形态及含菌量。
图5显示了本发明示例性噬菌蛭弧菌微胶囊在电子显微镜下的镜像，噬菌蛭弧菌微胶囊的颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，颗粒粒径分布基本均匀，大小为3～12μm。
大肠杆菌DH5α菌悬液的制备
在无菌条件下取-70℃甘油保藏的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h后于6000r/min离心20min，用无菌生理盐水洗涤3次，制成2.0×1010cfu/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液。
噬菌蛭弧菌F16培养液的制备
取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104pfu/ml的噬菌蛭弧菌F16接种于100ml pH7.2的10倍稀释的普通营养肉汤中，同时加入100μl/100ml大肠杆菌DH5α菌悬液，于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养48h后噬菌蛭弧菌F16的活菌含量为4.0×105pfu/ml，于4℃冰箱保存。
实施例1
明胶浓度对噬菌蛭弧菌F16微胶囊有效菌含量的影响：无菌操作取噬菌蛭弧菌F16培养液1mL加入终浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进风温度130℃、进料速度10ml/min、空气流量700L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同明胶浓度下制备的噬菌蛭弧菌F16微胶囊进行有效含菌量的测定。实验结果见图1。
图1的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为明胶溶液浓度。从该柱状图可以看出，当明胶浓度为2％时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量最高。具体表现在：当明胶浓度为1％时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量的对数值比明胶浓度为2％时降低了11.45％(P<0.05)；当明胶浓度分别为3％、4％、5％和6％时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量的对数值比明胶浓度为2％时也分别降低了8.96％(P<0.05)、10.72％(P<0.05)和18.80％(P<0.05)。
实施例2
空气流量对噬菌蛭弧菌F16微胶囊有效含菌量的影响：无菌操作取噬菌蛭弧菌F16培养液1mL加入终浓度为2％的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在空气流量分别为600、650、700、750、800L/h以及进风温度130℃、进料速度10ml/min、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同空气流量下制备的噬菌蛭弧菌F16微胶囊进行有效含菌量的测定。实验结果见图2。
图2的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为进风温度。从该柱状图可以看出，当空气流量为750L/h时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量最高。具体表现在：当空气流量为650L/h和700L/h时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量的对数值比空气流量为750L/h时降低了11.13％(P<0.05)和4.08％(P<0.05)；当空气流量为800L/h和850L/h时，噬菌蛭弧菌F16微胶囊的有效含菌量的对数值比空气流量为750L/h时也分别降低了18.59％(P<0.05)和25.21％(P<0.05)。
实施例3
进料速度对噬菌蛭弧菌F16微胶囊有效含菌量的影响：无菌操作取噬菌蛭弧菌F16培养液1mL加入终浓度为2％的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进料速度分别为6、8、10、12、14ml/min以及进风温度130℃、空气流量750L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同进料速度下制备的噬菌蛭弧菌F16微胶囊进行有效含菌量的测定。实验结果见图3。
图3的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为进料速度。从该柱状图可以看出，当进料速度为8ml/min时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量最高。具体表现在：当进料速度为6ml/min时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量的对数值比进料速度为8ml/min时降低了11.87％(P<0.05)；当进料速度为10ml/min、12ml/min和14ml/min时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量较进料速度为8ml/min时也分别降低了0.84％(P<0.05)、2.65％(P<0.05)和2.37％(P<0.05)。
实施例4
进风温度对噬菌蛭弧菌F16微胶囊有效含菌量的影响：无菌操作取噬菌蛭弧菌F16培养液1mL加入终浓度为2％的无菌明胶溶液中，然后在磁力搅拌器上于30℃、100r/min充分混合均匀，并在进风温度分别为120℃、130℃、140℃、150℃、160℃以及进料速度10ml/min、空气流量750L/h、通针频率10s等条件下进行喷雾干燥，分别对不同进风温度下制备的噬菌蛭弧菌F16微胶囊进行有效含菌量的测定。实验结果见图4。
图4的柱状图，纵坐标为细菌含量对数值，横坐标为空气流量。从该柱状图可以看出，当进风温度为120℃和130℃时，噬菌蛭弧菌微胶囊的有效含菌量随进风温度的升高而逐渐增加，其有效含菌量的对数值分别比进风温度为140℃时降低19.68％(P<0.05)和5.42％(P<0.05)；当进风温度为150℃和160℃时，噬菌蛭弧菌F16微胶囊的有效含菌量随进风温度的升高而逐渐减少，其有效含菌量的对数值比进风温度为140℃时分别降低了12.15％(P<0.05)和17.83％(P<0.05)。
实施例5：噬菌蛭弧菌F16微胶囊对异育银鲫抗嗜水气单胞菌感染的效果实验
实验设1个空白对照组和3个实验组，每组设3个平行，各随机投放异育银鲫20尾。空白对照组异育银鲫投喂基础饲料，3个实验组异育银鲫分别投喂含1×104pfu/g饲料的噬菌蛭弧菌F16微胶囊、蛭菌110和粉状噬菌蛭弧菌制剂的试验饲料，连续投饲14天，日投饲量为异育银鲫总体重的1％。之后参照Schadich等(Schadich E.,Cole A.L.J..Pathogenicity ofAeromonas hydrophila,Klebsiella pneuoniae,and Proteus mirabilisto brown tree frogs(Litoria ewingii)[J].Comparative Medicine,2010,60(2):114-117.)的方法用嗜水气单胞菌S1对每组异育银鲫进行人工浸浴创伤感染，其中嗜水气单胞菌S1的终浓度为6.0×108cfu/mL，连续14天参照Bucke(Bucke D.Histology.in:Austin B.,Austin D.A.(Eds).Methods for the microbiological examination of fish andshellfish.John Wiley&Sons,New York,USA,1989.pp.69-97.)的方法检测并记录各组嗜水气单胞菌S1感染致死异育银鲫的死亡数目，计算成活率。实验期间水温控制在28℃，连续充氧，不定期换水、吸污。实验结果见图6。
图6显示了，噬菌蛭弧菌微胶囊对异育银鲫抗嗜水气单胞菌S1感染具有良好的效果。经人工感染后，各组异育银鲫均不同程度地出现死亡，而以1×104pfu/g饲料剂量投喂噬菌蛭弧菌F16微胶囊的异育银鲫在人工感染嗜水气单胞菌S1后14天的成活率较对照组异育银鲫的成活率提高了30％(P<0.05)，较以1×104pfu/g饲料剂量投喂蛭菌110的异育银鲫的成活率提高了13.3％(P<0.05)，较以1×104pfu/g饲料剂量投喂粉状噬菌蛭弧菌制剂的异育银鲫的成活率提高了8.3％(P<0.05)，说明噬菌蛭弧菌F16微胶囊能够显著增加噬菌蛭弧菌液体制剂的抗病效果。
但是，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
Claims (8)
1.一种噬菌蛭弧菌微胶囊，其中，所述微胶囊的壁为明胶，颗粒呈球形，表面有凹陷，但没有孔和裂纹，所述颗粒粒径大小为3～12μm，分布基本均匀，且其中，噬菌蛭弧菌的含量为3.69×107pfu/g～3.70×107pfu/g，大肠杆菌DH5α的含量为8.6×109cfu/g～2.10×1010cfu/g；所述微胶囊采用如下步骤制得：
1)在无菌条件下取-70℃甘油保藏的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中，于30℃，在200r/min摇床振荡培养后，离心，并用无菌生理盐水洗涤，制成含大肠杆菌DH5α2.0×1010cfu/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液；
2)取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104pfu/ml的噬菌蛭弧菌接种于pH7.2的10倍稀释的普通营养肉汤中制成噬菌蛭弧菌培养液，同时在每100ml所述噬菌蛭弧菌培养液中加入步骤1)的大肠杆菌DH5α菌悬液100μl，于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌的活菌含量为4.0×105pfu/ml；
3)将步骤2)的噬菌蛭弧菌培养液与浓度为1-6％的无菌明胶溶液均匀混合后，在空气流量设置为650-850L/h，进料速度设置为6-14ml/min，进风温度为120℃-160℃的条件下，进行喷雾干燥。
2.一种噬菌蛭弧菌微胶囊的制备方法，其包括如下步骤：
1)在无菌条件下取-70℃甘油保藏的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中，于30℃，在200r/min摇床振荡培养后，离心，并用无菌生理盐水洗涤，制成含大肠杆菌DH5α2.0×1010cfu/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液；
2)取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104pfu/ml的噬菌蛭弧菌接种于pH7.2的10倍稀释的普通营养肉汤中制成噬菌蛭弧菌培养液，同时在每100ml所述噬菌蛭弧菌培养液中加入步骤1)的大肠杆菌DH5α菌悬液100μl，于30℃、200r/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌的活菌含量为4.0×105pfu/ml；
3)将步骤2)的噬菌蛭弧菌培养液与浓度为1-6％的无菌明胶溶液均匀混合后，在空气流量设置为650-850L/h，进料速度设置为6-14ml/min，进风温度为120℃-160℃的条件下，进行喷雾干燥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌DH5α在所述摇床振荡培养18h后用6000r/min离心20min，并用所述无菌生理盐水洗涤3次。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述明胶溶液的浓度为2％。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述空气流量为750L/h。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述进料速度为8ml/min。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述进风温度为140℃。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述明胶溶液的浓度为2％、所述空气流量为750L/h、所述进料速度为8ml/min、且所述进风温度为140℃。
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