CN103623436B - 生物相容性磁性稀土纳米颗粒、其制备及磁共振成像应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有两个以上能够与纳米颗粒结合的络合基团的生物相容性配体修饰的生物相容性磁性稀土纳米颗粒、其制备方法及磁共振成像及磁共振/光学成像应用。本发明所采用的技术方法具有工艺简单、操作简便的特点。采用该技术制备的磁性纳米颗粒粒径均一可控、结晶度高、生物相容性好，并可通过掺杂不同稀土元素使纳米颗粒具有荧光或上转换荧光性质。最重要的是，所得到的磁性纳米颗粒样品在生理缓冲液中表现出良好的胶体稳定性，长期放置后依然保持高的水相分散性和磁学性质，因此，采用该技术方法制备的生物相容性磁性纳米颗粒适于规模化和商业化生产，在磁共振成像领域具有广阔的应用前景和市场前景。
Description
技术领域
本发明属于材料化学、纳米科学及其生物医学领域，特别涉及利用高温反应法和“配体置换”法制备高结晶度、能在生理缓冲液中高度溶解并稳定分散的生物相容性磁性稀土纳米颗粒。
背景技术
磁性稀土纳米颗粒在核磁共振造影(MRI)、细胞分离与标记以及靶向药物载体等生物医学领域有着广泛的应用前景。然而，纳米颗粒的磁响应特性、生物相容性以及在生理条件下的稳定性一直制约着磁性纳米颗粒在上述领域中的应用。
目前，磁性纳米颗粒的化学制备方法主要包括：共沉淀法、高温反应法、微乳液法、超声化学法等。其中高温反应法包括高温热分解法及高温复分解反应法，其特点是在非水体系中进行制备反应，同时反应温度高于水的常压沸点温度。共沉淀法制备得到的纳米颗粒尺寸分布宽，产物组成不够明确；微乳液法制备的纳米颗粒结晶度差，磁响应弱；超声化学法在纳米颗粒的尺寸和形貌控制方面较差。近年来兴起的高温反应法则克服了上述制备方法的缺点。由于高温反应法采用较高的反应温度，有利于控制纳米颗粒的成核和生长过程，因此所得到的纳米颗粒结晶度高，尺寸分布窄。然而，高温反应法制备纳米颗粒一般要采用带有长烷基链的饱和脂肪酸和/或胺分子以及不饱和脂肪酸和/或胺(如：油酸、油胺)作稳定剂。这种修饰使得到的纳米颗粒一般只能溶解或分散在非极性或弱极性的有机介质中，因此，不能在单颗粒尺度上被用于生物医学领域。通过后期配体置换可以使表面具有疏水结构的纳米颗粒具有水溶性，同时在纳米颗粒表面引入活性功能基团，使纳米颗粒表面可以共价耦联上具有生物靶向的生物分子，如抗体、受体、核酸和多肽等，并且通过改变与纳米颗粒结合的配位基团的种类和数量有望提高纳米颗粒在生理缓冲液中的分散性和胶体稳定性。
稀土纳米颗粒特殊的磁学性质及光学性质使其在生物分析及生物医学领域展示出广阔的应用前景。最近，稀土纳米颗粒的制备已经取了一系列的研究成果(Nature 2008，463，1323；Adv.Mater.2008，20，4765；Chem.Mater.2009，21，717；Chem.Mater.2011，23，3714)，然而这些纳米颗粒不能直接作为磁共振造影剂及分子影像探针。为了进一步将其应用于生物分析领域如磁共振造影、肿瘤标记和成像，生物体内造影成像等领域，纳米颗粒不仅需要具有生物相容性，同时还需要在生理缓冲液中表现出稳定分散特性。而磁共振分子影像探针的构建还需要纳米颗粒表面具有可反应基团以便进一步共价耦联生物靶向分子如抗体，受体，核酸和多肽等。目前文献报道的水溶性稀土纳米颗粒，由于其表面配体与纳米颗粒配位能力不足，结合力差，因此在生理缓冲液中胶体稳定性不高，易发生聚集和沉淀。因此无法用于构建适于生物体内应用的分子影像探针。而本发明涉及的生物相容性稀土纳米颗粒在生理缓冲液中能够高度溶解并稳定分散，不仅适用于生物体内外应用，而且还可以通过耦联生物靶向分子构建分子探针，并在生物体内实现对病灶区域的靶向磁共振及光学成像。
发明内容
本发明是通过高温反应制备出结晶度高，粒度分布窄，粒径尺寸可调的磁性稀土纳米颗粒或磁性/荧光稀土纳米颗粒；再通过利用含有两个以上络合基团的生物相容性配体(双齿或多齿配体)进行配体交换，制备在生理缓冲液中能够高度溶解并稳定分散的稀土纳米颗粒；选用生物相容性高分子的链段上一端具有所述的两个以上的络合基团，另一端具有一个以上能够与生物分子共价耦联的基团进行配体交换，得到具有表面活性功能基团的生物相容性稀土纳米颗粒；通过表面活性功能基团与生物分子的耦联制备具有靶向性的纳米颗粒，从而实现以下发明目的：
本发明的目的之一是提供一种表面为双齿或多齿生物相容性配体修饰的磁性稀土纳米颗粒及兼具磁性和荧光的稀土纳米颗粒。
本发明的目的之二是提供的生物相容性磁性稀土纳米颗粒干粉样品长期保存后仍能完全溶于水及生理缓冲液中，形成稳定胶体溶液。
本发明的目的之三是提供的生物相容性磁性稀土纳米颗粒在生理缓冲液中具有高度稳定性。
本发明的目的之四在于提供的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，其表面聚合物修饰层所携带的功能基团可直接被用于磁性稀土纳米颗粒与生物分子的共价耦联。
本发明的目的之五是提供的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，其尺寸可以通过反应条件进行调控。
本发明的目的之六是提供一种在生理缓冲液中高度溶解并稳定分散的生物相容性稀土纳米颗粒的“配体置换”制备方法。
本发明的目的之七是提供一种以生物相容性磁性稀土纳米颗粒作为造影剂或分子影像探针应用于磁共振成像诊断及磁共振/光学成像。
本发明的一个方面涉及一种生物相容性磁性稀土纳米颗粒，所述生物相容性磁性稀土纳米颗粒的表面修饰有生物相容性高分子，所述生物相容性高分子的高分子链段上带有两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团，其中生物相容性高分子占生物相容性磁性纳米颗粒的质量百分含量是2～90％。
本发明的生物相容性稀土纳米颗粒在生理缓冲液中能够高度溶解并稳定分散，一般具有顺磁性，稀土纳米颗粒的粒径是1～200纳米，粒子尺寸的相对标准偏差小于10％，在磁性纳米颗粒表面修饰有生物相容性高分子。
修饰在表面上的生物相容性高分子占生物相容性磁性纳米颗粒的质量百分含量是2～90％，优选10～80％，更优选20～70％，以获得具有良好的生物相容性的磁性纳米颗粒。
所述的生物相容性高分子的分子量在200～20000，优选600～6000；主要选自线型、支化的聚乙二醇(PEG)，也包括线型、支化的聚乙二醇与聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMA)、聚乙烯胺(PEI)、聚丙氨酸、聚赖氨酸、聚亮氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚乳酸(PLA)形成的嵌段共聚物中的至少一种。
所述的生物相容性高分子的链段上带有两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团，这些基团选自由磷酸基团、羧基、胺基、羟基和巯基组成的组。
所述的生物相容性高分子除在高分子链段上带有两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团外，还可以在高分子链段的另一端具有一个以上能够与生物分子共价耦联的基团。所述的生物相容性高分子的链段上所带有的一个以上能够直接实现与生物分子进行共价耦联的基团选自由羧基、胺基、马来酰亚胺基、呋喃基、巯基、生物素和亲和素基团组成的组。
所述的磁性纳米颗粒主要是钆的无机化合物颗粒，也包括镨、钕、钷、钐、铕、铽、镝、钬、铒及铥的化合物颗粒。例如氧化物颗粒、氟化物颗粒及氟化物复盐颗粒。
本发明的生物相容性磁性纳米颗粒的干粉样品溶于生理缓冲液时的溶解度为0.1g/L～60g/L，且所得溶液放置半年后仍无沉淀析出。
本发明所述生理缓冲液包括磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、无菌磷酸生理缓冲液(D-PBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)或Earle’s平衡盐溶液(EBSS)。
本发明所述磁性纳米颗粒表面携带有在温和条件下可进一步反应的马来酰亚胺基、巯基、羧基或胺基。利用该功能基团可将本发明所述的生物相容性磁性纳米颗粒与生物分子进行共价耦联。
本发明所述的生物分子包括抗体、氨基酸、多肽、蛋白、生物素、亲和素、核酸的胺基衍生物或羧基衍生物等。
相比于采用含有单一络合基团的生物相容性分子配体(单齿配体)修饰的水溶性稀土纳米颗粒，本发明的含有两个以上络合基团的生物相容性分子配体(双齿或多齿配体)修饰的磁性稀土纳米颗粒结晶度高、生理缓冲液中能够高度溶解并稳定分散，而且具有生物相容性和靶向性，从而克服了单齿配体修饰的稀土纳米颗粒在生理缓冲液中纳米颗粒胶体稳定性不高、无生物靶向性等不足。
本发明的第二方面涉及制备本发明的生物相容性磁性稀土纳米颗粒的方法。
本发明的生物相容性磁性稀土纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
(1)采用高温反应法，利用高沸点非极性溶剂作为反应介质，得到磁性稀土纳米颗粒；
(2)将上述磁性稀土纳米颗粒与含有两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团及任选的一个以上能够与生物分子共价耦联的基团的生物相容性高分子进行配体交换反应，从而获得所述生物相容性磁性稀土纳米颗粒。
具体而言，本发明的在生理缓冲液中能够高度溶解并稳定分散的生物相容性磁性纳米颗粒的制备方法是采用纳米颗粒成核与生长动力学可控的高温反应法和与含有双齿或多齿配体的络合基团和功能基团的生物相容性配体的“配体置换”法，包括以下步骤：
(1)在反应容器中将有机金属化合物或无机金属盐化合物前驱体(如氯化钆等)溶于高沸点混合溶剂(如油酸/十八烯混合溶剂)中形成混合反应溶液，其中，反应液中有机金属化合物或无机金属盐化合物的浓度为0.001mol/L～0.2mol/L，优选浓度为0.01～0.1mol/L；配位溶剂(如油酸等)的质量百分含量为0.4％～80％，优选4％～40％；向混合溶液中加入含有氟化物(如氟化铵)的溶液，形成纳米晶核；
(2)通入惰性气体排除反应体系中的氧气，将步骤(1)的反应液加热反应，得到粒度分布窄、粒径尺寸可控的纳米颗粒；反应温度控制在120～350℃，优选180～330℃；反应时间为0.2～50小时，优选0.5～25小时；
(3)将步骤(2)中的反应液冷却至室温，加入体积为反应液体积1～20倍的有机溶剂(乙醚、石油醚、甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合物等)沉淀出纳米颗粒，并用同样的有机溶剂洗涤纳米颗粒3～5次，通过离心分离得到纳米颗粒；
(4)将步骤(3)所得纳米颗粒溶液用有机溶剂(二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜或它们的混合物等)溶解，纳米颗粒的浓度为0.001mol/L～0.2mol/L，优选浓度为0.01～0.1mol/L，将含有生物相容性高分子的有机溶液(溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜或它们的混合物等)反应1～100小时，优选2～40小时；真空干燥后即可得到易于存储和运输的生物相容性磁性纳米颗粒干粉；
(5)将步骤(4)所得生物相容性纳米颗粒溶液用有机溶剂(环己烷、正己烷、石油醚、乙醚或它们的混合物等)沉淀，并用同样的有机溶剂洗涤纳米颗粒3～5次，真空干燥后即可得到易于存储和运输的生物相容性顺磁性纳米颗粒干粉；
(6)将步骤(5)所得生物相容性磁性纳米颗粒干粉样品溶于生理缓冲液中得到稳定的胶体溶液。
所述的高沸点非极性溶剂的沸点为160-370℃，包括苯醚、二苄基醚、1-十八烯、三辛基膦、三辛胺、油胺和油酸；
所述的有机金属化合物包括稀土元素(包括镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒及铥)的乙酰丙酮盐、醋酸盐、草酸盐及柠檬酸盐。
所述的无机金属盐化合物包括稀土元素(包括镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒及铥)的水合及无水氯化盐、硝酸盐和硫酸盐。
所述的生物相容性高分子的分子量在200～20000，优选600～6000；主要选自线型、支化的聚乙二醇，也包括线型、支化的聚乙二醇与聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、聚丙氨酸、聚赖氨酸、聚亮氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚乳酸形成的嵌段共聚物中的一种。上述生物相容性高分子的结构特征是在高分子链段上带有两个及以上络合基团，络合基团为羧基、胺基、羟基、巯基及磷酸基团；并含有一个及以上活性功能基团，活性功能基团为呋喃基、马来酰亚胺基、巯基、羟基、羧基或胺基基团。
本发明可通过改变反应条件，包括溶剂种类与比例、反应前驱体比例等制备得到球形、圆盘状或六方柱状等不同形状的纳米颗粒。
本发明可通过改变反应条件，包括金属前驱体的浓度、反应时间、生物相容性高分子的分子量和浓度，以及采用种子诱导生长的方法制备得到不同粒径的纳米颗粒。
本发明的第三方面涉及本发明的生物相容性磁性稀土纳米颗粒在磁共振及磁共振/光学成像中的应用。
本发明所描述的生物相容性磁性纳米颗粒与生物分子的共价耦联，可采用常规方法，如：
(1)将表面带有羧基的生物相容性磁性纳米颗粒或生物分子溶于pH值为5.0～6.5的生理缓冲液中配成溶液，然后向该溶液中加入EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)将羧基进行活化，混匀，室温下反应10～20min；
(2)向步骤(1)的反应液中加入表面带有氨基，pH值为7.5～8.0的生物分子或生物相容性磁性纳米颗粒的生理缓冲溶液，使反应液的pH值高于7.0，混匀，室温下反应2～4h。
或采用“点击化学”方法，如：
(1)将抗体与还原剂(NaBH4，TCEP等)室温共孵育15～45min，将抗体中二硫键部分还原为巯基；
(2)将表面修饰有活性功能基团(如马来酰亚胺基)的纳米颗粒与部分还原后的抗体共孵育20～60min，使抗体与纳米粒子耦联，高速离心方法收集抗体标记的纳米颗粒，将抗体-纳米粒子耦联物重新分散于生理缓冲溶液中。
所述的生物分子包括抗体、氨基酸、多肽、蛋白、生物素、亲和素、核酸及核酸衍生物等。
本发明所述的生物相容性磁性纳米颗粒的磁学性质稳定，摩尔弛豫率高，且与生物分子的耦联物具有高度的生物学活性，在临床诊断及生物标记和分析检测领域具有巨大的应用价值。
本发明利用生物相容性磁性稀土纳米颗粒构建磁共振成像造影剂及分子影像探针的技术方法具有工艺简单、操作简便、生物相容性好及摩尔弛豫率高的特点，即通过高温反应和“配体置换”反应所制备生物相容性磁性稀土纳米颗粒结晶度高、粒度分布窄、尺寸可调、在生理缓冲液中高度溶解并稳定分散，且表面带有功能基团，可进一步进行生物耦联。颗粒干粉样品良好的溶解性为存储和运输提供了巨大的方便，适于规模化和商业化生产，具有广阔的应用前景和市场前景。
附图说明
图1.本发明实施例1所得NaGdF4纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。
图2.本发明实施例1所得NaGdF4纳米颗粒的电子衍射照片。
图3.本发明实施例2所得NaGdF4纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。
图4.本发明实施例3所得NaGdF4纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。
图5.本发明实施例15所得NaGdF4:Yb/Er纳米颗粒的上转换荧光发射光谱(A)和照片(B)。
图6.本发明实施例20所得样品的透射电镜照片。
图7.本发明实施例26所得耦联物及其对照的紫外吸收(A)和荧光光谱图(B)。
图8.本发明实施例28所得生物相容性NaGdF4纳米颗粒T1加权像磁共振成像图。
图9.本发明实施例28所得生物相容性NaGdF4纳米颗粒摩尔弛豫率。
图10.本发明实施例29NaGdF4-EGFR-FITC耦联物与人表皮癌细胞特异性结合的荧光显微照片(A)及阴性对照细胞的荧光显微照片(B)。
具体实施方式
以下实施例用以举例说明本发明，以便于本领域技术人员更好地理解和实施本发明。但是，应理解的是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
将0.742g六水合氯化钆、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到350℃反应10h后停止反应。待反应液冷却至室温后，用乙醇沉淀出NaGdF4纳米颗粒并洗涤三次，离心分离得到纳米颗粒。将所得晶体溶于甲苯中，利用透射电镜(TEM)表征，附图1为NaGdF4顺磁性纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。由电镜照片可知，生物相容性磁性纳米颗粒为球形粒子，平均粒径为19.8纳米，粒径相对标准偏差为10％，单分散性好。附图2中的电子衍射照片表明纳米颗粒结晶度高。
实施例2
将0.742g六水合氯化钆、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到280℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaGdF4纳米颗粒平均粒径为14.8纳米。附图3为NaGdF4顺磁性纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。
实施例3
将0.742g六水合氯化钆、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到250℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaGdF4纳米颗粒平均粒径为5.4纳米。附图4为NaGdF4顺磁性纳米颗粒的透射电镜照片(A)及其粒径分布柱状图(B)。
实施例4
将0.768g六水合氯化钆、4mL油胺及12mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaGdF4纳米颗粒平均粒径为11.8纳米。
实施例5
将0.723g六水合氯化镨、4mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaPrF4纳米颗粒平均粒径为13.5纳米。
实施例6
将0.728g六水合氯化钕、4mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaNdF4纳米颗粒平均粒径为14.7纳米。
实施例7
将0.734g六水合氯化钷、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaPmF4纳米颗粒平均粒径为12.8纳米。
实施例8
将0.740g六水合氯化钐、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaSmF4纳米颗粒平均粒径为15.9纳米。
实施例9
将0.744g六水合氯化铕、6mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaEuF4纳米颗粒平均粒径为15.2纳米。
实施例10
将0.758g六水合氯化铽、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaTbF4纳米颗粒平均粒径为17.4纳米。
实施例11
将0.758g六水合氯化镝、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到240℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaDyF4纳米颗粒平均粒径为13.1纳米。
实施例12
将0.758g六水合氯化钬、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaHoF4纳米颗粒平均粒径为16.2纳米。
实施例13
将0.764g六水合氯化铒、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaErF4纳米颗粒平均粒径为14.3纳米。
实施例14
将0.780g六水合氯化铥、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaTmF4纳米颗粒平均粒径为15.9纳米。
实施例15
将0.682g六水合氯化钆、0.157g六水合氯化镱、0.044g六水合氯化铒、8mL油酸溶解于30mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，真空加热脱水(90℃)5小时，反应液冷却至室温。将0.45g氢氧化钠和0.6g氟化铵溶于10mL甲醇中，加入上述反应液中。通入氮气加热到270℃反应10h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaGdF4:Yb/Er纳米颗粒平均粒径为18.4纳米，具有上转换荧光性质，980nm近红外激光激发下纳米颗粒的上转换荧光发射峰在524nm，541nm和656nm，如图5所示。
实施例16
将0.496g三氟乙酸钆、0.136g三氟乙酸钠、8mL油酸及8mL油胺溶解于20mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，通入氮气除氧30分钟，加热到280℃反应8h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaGdF4纳米颗粒平均粒径为12.1纳米。
实施例17
将0.501g三氟乙酸镝、0.136g三氟乙酸钠、10mL油酸及10mL油胺溶解于20mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，通入氮气除氧30分钟，加热到280℃反应8h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得NaDyF4纳米颗粒平均粒径为13.7纳米。
实施例18
将0.496g三氟乙酸钆、8mL油酸及8mL油胺溶解于20mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，通入氮气除氧30分钟，加热到280℃反应8h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得GdF3纳米颗粒平均粒径为9.6纳米。
实施例19
将0.501g三氟乙酸镝、10mL油酸及10mL油胺溶解于20mL十八烯中，然后将上述溶液转入100mL的三口烧瓶中，通入氮气除氧30分钟，加热到280℃反应8h后停止反应。其余操作均同实施例1，所得DyF3纳米颗粒平均粒径为8.9纳米。
实施例20
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4纳米颗粒四氢呋喃溶液加入5mL质量百分浓度为1％的双齿磷酸-PEG2000(PEG2000-dp，由北京万德高科技发展有限公司生产)四氢呋喃溶液中，搅拌反应4小时。用环己烷沉淀出生物相容性NaGdF4纳米颗粒并洗涤三次，离心分离得到纳米颗粒。配体交换后，NaGdF4纳米颗粒核磁共振实验显示，油酸特征信号消失，PEG特征信号出现，表明双齿-PEG配体将NaGdF4纳米颗粒表面油酸配体完全取代。
将所得粒子溶于去离子水中，透析24小时，将所得溶液用丙酮进行沉淀和洗涤，真空干燥后即可得到易于存储和运输的干粉。将干粉分别溶于去离子水和0.01M PBS(磷酸盐缓冲生理盐水，pH＝7.4)中配成5g/L的溶液利用透射电镜和激光光散射表征，附图6为生物相容性NaGdF4纳米颗粒的透射电镜照片。由电镜照片和光散射结果可知，生物相容性NaGdF4纳米颗粒的在去离子水和生物缓冲液中具有高度的分散性。长期光散射跟踪表征，表明双齿磷酸-PEG包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有长期胶体稳定性。热失重实验表明，所得生物相容性纳米颗粒表面修饰的生物相容性高分子的质量百分含量约为50％。
实施例21
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaDyF4纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入5mL质量百分浓度为1％的四齿磷酸-PEG2000(PEG2000-tp，由北京万德高科技发展有限公司生产)四氢呋喃溶液中，搅拌反应4小时。其余操作均同实施例20。所得四齿磷酸-PEG2000包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例22
将1mL实施例15中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4:Yb/Er纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入5mL质量百分浓度为1％的双齿磷酸-PEG2000四氢呋喃溶液中，搅拌反应4小时。其余操作均同实施例20。所得双齿磷酸-PEG2000包被的生物相容性NaGdF4:Yb/Er纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例23
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入5mL质量百分浓度为1％的磷酸-PEG-马来酰亚胺(Mal-PEG2000-dp，由北京万德高科技发展有限公司生产)的四氢呋喃溶液中，搅拌反应4小时。其余操作均同实施例20。所得磷酸-PEG-马来酰亚胺包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例24
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入5mL质量百分浓度为1％的磷酸-PEG-羧酸(HOOC-PEG2000-dp，由北京万德高科技发展有限公司生产)的四氢呋喃溶液中，搅拌反应4小时。其余操作均同实施例20。所得磷酸-PEG-羧酸包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例25
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入10mL质量百分浓度为1％的分子量为1800的聚丙烯酸(PAA)四氢呋喃溶液中，搅拌反应8小时。其余操作均同实施例20。所得PAA包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例26
将1mL实施例1中得到的质量百分浓度为1％的NaGdF4纳米颗粒四氢呋喃溶液，加入10mL质量百分浓度为1％的嵌段共聚物PAA-PEG(PAA-b-PEG2000，由北京万德高科技发展有限公司生产)四氢呋喃溶液中，搅拌反应8小时。其余操作均同实施例20。所得PAA-PEG包被的生物相容性NaGdF4纳米颗粒具有水相分散性和胶体稳定性。
实施例27
0.5mL 2mg/mL的荧光素(FITC)标记抗EGFR(Epidermal growthfactor receptor，表皮生长因子受体)单克隆抗体的PBS(pH＝7.0)溶液中加入0.1mL 10mg/mL的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)的PBS(pH＝7.0)溶液，室温孵育30分钟，超滤离心除去TCEP。将实施例13中真空干燥后得到的NaGdF4干粉样品溶于0.01M Tris(pH＝7.2)中配成5g/L的溶液，按照纳米颗粒与抗体优选比例1∶10，加入TCEP部分还原的EGFR抗体溶液，室温下反应30分钟。对照实验即生物相容性NaGdF4磁性纳米颗粒与抗体的混合实验的实验条件与上述耦联反应相比，采用未还原的EGFR抗体，其余实验条件完全相同。反应结束后，耦联产物和对照实验样品进行离心洗涤纯化，最后分散于缓冲液中。附图7为耦联物及其对照物的紫外-可见吸收(A)及荧光光谱(B)表征。通过对比发现，耦联物的荧光分子的吸收和发射信号明显，而对照物无明显吸收及荧光信号，因此可以推断耦联物中抗体与生物相容性NaGdF4纳米颗粒通过共价键耦联，且纳米颗粒抗非特异性吸附能力强。
实施例28
将实施例24中真空干燥后得到的生物相容性NaGdF4干粉样品溶于0.01M PBS(pH＝6.5)中配成5g/L的溶液，取该溶液0.5mL，加入2μMEDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和5μM Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，室温下反应15min后，加入0.5mL 2mg/mL的抗EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)单克隆抗体的PBS(pH＝8.0)溶液，室温反应4h。对照实验即生物相容性NaGdF4磁性纳米颗粒与抗体的混合，与上述耦联反应相比，除了不加EDC·HCl和Sulfo-NHS之外，其余实验条件完全相同。反应结束后，耦联产物和对照实验样品进行离心洗涤纯化，最后分散于缓冲液中。
实施例29
将实施例20中真空干燥后得到的生物相容性NaGdF4纳米颗粒干粉样品溶于去离子水中，配制钆离子浓度依次为0.01、0.05、0.1、0.5和1mM的溶液，利用3T医用磁共振成像设备检测纳米晶磁共振信号增强效果。附图8为纳米颗粒T1加权磁共振成像照片，附图9为纳米颗粒摩尔弛豫率拟合，线性拟合所得实施例20所得生物相容性NaGdF4纳米颗粒的纵向摩尔弛豫率为8.78mM-1·s-1。
实施例30
将实施例22中真空干燥后得到的生物相容性NaGdF4纳米颗粒纳米颗粒干粉样品溶于去离子水中，配制钆离子浓度依次为0.01、0.05、0.1、0.5和1mM的溶液，利用3T医用磁共振成像设备检测纳米晶磁共振信号增强效果。线性拟合所得实施例20所得生物相容性NaGdF4纳米颗粒的纵向摩尔弛豫率为6.51mM-1·s-1。
实施例31
将实施例27中得到NaGdF4纳米颗粒与FITC标记EGFR抗体耦联物溶于0.01M PBS(pH＝7.2)，与EGFR高表达的A431细胞(人表皮癌细胞)37℃共孵育45分钟。对照实验采用EGFR低表达的A435细胞(人乳腺癌细胞)，其余实验条件完全相同。与细胞结合完毕后，移去耦联物溶液，用0.01M(pH＝7.2)洗涤细胞3次，利用荧光显微镜观察耦联物与细胞的特异性结合。附图10为耦联物与A431细胞结合的荧光显微照片(A)和阴性对照细胞的荧光显微照片(B)。
Claims (7)
1.一种生物相容性磁性稀土纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在反应容器中将有机金属化合物或无机金属盐化合物前驱体溶于高沸点混合溶剂中形成混合反应溶液，其中，高沸点溶剂是沸点为160～370℃的高沸点非极性溶剂，选自苯醚、二苄基醚、1-十八烯、三辛基膦、三辛胺、油胺和油酸，所述的有机金属化合物是稀土元素的乙酰丙酮盐、醋酸盐、草酸盐或柠檬酸盐，所述的无机金属盐化合物是稀土元素的水合及无水氯化盐、硝酸盐或硫酸盐，反应液中含有浓度为0.001mol/L～0.2mol/L的有机金属化合物或无机金属盐化合物和质量百分含量为0.4％～80％的配位溶剂，所述配位溶剂为带有C4-C24烷基链的饱和脂肪酸和/或胺及不饱和脂肪酸和/或胺；向混合溶液中加入含有氟化物的溶液，形成纳米晶核；
(2)通入惰性气体排除反应体系中的氧气，将步骤(1)的反应液加热反应，得到粒度分布窄、粒径尺寸可控的纳米颗粒；反应温度控制在120～350℃；反应时间为0.2～50小时；
(3)将步骤(2)中的反应液冷却至室温，加入体积为反应液体积1～20倍的有机溶剂沉淀出纳米颗粒，并用同样的有机溶剂洗涤纳米颗粒3～5次，通过离心分离得到纳米颗粒；
(4)将步骤(3)所得纳米颗粒溶液用有机溶剂溶解，纳米颗粒的浓度为0.001mol/L～0.2mol/L，然后与含有含两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团及任选的一个以上能够与生物分子共价耦联的基团的生物相容性高分子的有机溶液反应1～100小时；真空干燥后即可得到易于存储和运输的生物相容性磁性纳米颗粒干粉；其中所述的生物相容性高分子的分子量为200～20000，是选自线型、支化的聚乙二醇，线型、支化的聚乙二醇与聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺、聚丙氨酸、聚赖氨酸、聚亮氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚乳酸形成的嵌段共聚物中的至少一种，所述的络合基团选自由磷酸基团、羧基、胺基、羟基和巯基组成的组，并且所述的能够与生物分子共价耦联的基团选自由马来酰亚胺基、羧基、胺基、呋喃基、巯基、生物素和亲和素基团组成的组；
(5)将步骤(4)所得生物相容性纳米颗粒溶液用有机溶剂沉淀，并用同样的有机溶剂洗涤纳米颗粒3～5次，真空干燥后即可得到易于存储和运输的生物相容性顺磁性纳米颗粒干粉；
(6)将步骤(5)所得生物相容性磁性纳米颗粒干粉样品溶于生理缓冲液中得到稳定的胶体溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述的氟化物是氟化铵。
3.一种通过权利要求1或2所述的方法制备的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，所述生物相容性磁性稀土纳米颗粒的表面修饰有生物相容性高分子，所述生物相容性高分子的高分子链段上带有两个以上能够与稀土纳米颗粒结合的络合基团，其中生物相容性高分子占生物相容性磁性纳米颗粒的质量百分含量是2～90％。
4.根据权利要求3所述的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，其中所述的生物相容性高分子的链段上一端具有所述的两个以上的络合基团，另一端具有一个以上能够与生物分子共价耦联的基团。
5.根据权利要求3或4所述的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，其中所述的生物相容性磁性纳米颗粒的干粉样品可溶解于水及生理缓冲液中，溶解度为0.1g/L～60g/L，且所得溶液放置半年后无沉淀析出。
6.根据权利要求3或4所述的生物相容性磁性稀土纳米颗粒，其中所述的稀土纳米颗粒选自镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒及铥的氧化物颗粒、氟化物颗粒及氟化物复盐颗粒；纳米颗粒的粒径是1～200纳米。
7.根据权利要求3或4所述的生物相容性磁性稀土纳米颗粒在非疾病诊断和治疗用途的磁共振及磁共振/光学成像中的应用。
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