CN116077659A - 一种超小型Janus纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，具体公开了一种超小型Janus纳米粒子及其制备方法与应用，包括如下步骤：将三氟乙酸钠、三氟乙酸钆、油胺和1‑十八烯混合均匀，反应，得反应液1；将乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锰和油胺按摩尔比为2：1：40‑75混合均匀，加热溶解并脱气，然后将混合液在惰性氛围中快速加热，反应，得反应液2；将反应液2升温，然后将反应液1注入反应液2中，维持0.5‑1.5h，然后冷却，得反应液3；向反应液3中加入过量无水乙醇沉淀产物，离心分离后取沉淀，再将沉淀超声分散在有机分散液中，固液分离后取上清，即得。该超小型Janus纳米粒子具有MR成像、光热治疗和化学动力学治疗功能。

Description

一种超小型Janus纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，具体涉及一种超小型Janus纳米粒子及其制备方法与应用，该超小型Janus纳米粒子具有磁共振（MR）成像、光热治疗和化学动力学治疗功能。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
恶性肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，对癌症的准确诊断和高效治疗一直是研究的热点和难点。纳米材料有很好的生物膜穿透能力，具有光、磁等特性的纳米材料已成为最有潜力的癌症诊断和治疗手段之一。
随着纳米材料合成技术的高速发展，磁共振造影剂的纳米化研究成为当前广泛关注研究领域。开发新型高效的T1/T2双模磁共振成像造影剂，不仅可以解决目前顺磁性金属配合物T1造影增强剂毒性高、生物靶向性差的问题，还对解决磁性纳米材料T2造影剂存在的伪影现象具有重要意义。
制备Janus纳米粒子是材料科学的重要研究方向和难点方向。这种不对称的纳米粒子通常由两种或两种以上的功能组分组成，可以将多种功能部件整合到一个系统中，扩大在肿瘤治疗中的应用价值。现有的Janus纳米粒子的制备过程繁琐、步骤复杂且粒子通常具有较大的粒径，难以满足很多应用场所的需要。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种超小型Janus纳米粒子及其制备方法与应用，将具有T2磁共振成像功能、光热转化能力、化学动力学治疗能力的MnFe2O4纳米粒子和具有T1磁共振成像功能的NaGdF4纳米粒子结合在一起，制备了一种具有Janus结构的超小型纳米粒子。该纳米粒子在肿瘤治疗过程中可以实现T1/T2双模成像、光热治疗和化学动力学治疗效果。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种超小型Janus纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：将三氟乙酸钠、三氟乙酸钆、油胺和1-十八烯按摩尔比为0.95-1.05:0.95-1.05:3.75-7.5:3.75-7.5混合均匀，在70-110℃反应0.2-0.5 h，得反应液1；
将乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锰和油胺按摩尔比为2：0.8-1.2：40-75混合均匀，在70-110℃下加热溶解并脱气，然后将混合液在惰性氛围中快速加热至280-305℃，反应1.5-2.5h，得反应液2；
将反应液2升温至305-315℃，然后将反应液1注入反应液2中，维持0.5-1.5h，然后冷却，得反应液3；
向反应液3中加入过量无水乙醇形成沉淀产物，离心分离后取沉淀，再将沉淀超声分散在有机分散液中，固液分离后取上清，即得MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的分散液。
所述固液分离为离心分离。
优选的，乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锰和油胺按摩尔比为2：1：40-75。
油胺作的作用是表面活性剂，1-十八烯是溶剂。
制得反应液1的步骤的目的是溶解三氟乙酸钠和三氟乙酸钆，过程未发生反应。
以乙酰丙酮铁和乙酰丙酮锰作为前驱体，油胺作为表面活性剂与溶剂，在高温环境中，前驱体生长成核并成长为MnFe2O4纳米粒子。
反应液2的最终产物为MnFe2O4纳米粒子，当反应液1注入反应液2后，在高温环境下，前驱体三氟乙酸钠和三氟乙酸钆分解，随后在MnFe2O4纳米粒子表面发生异相成核生长过程，最终合成MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子。
反应液2和反应液3的合成过程中表面活性剂相同，反应温度相近，有利于最终产物的合成。
在70-110℃下加热溶解并脱气的作用是防止加热溶解过程中产生爆沸或燃烧现象。
将混合液在惰性氛围中快速加热至280-305℃（加热速度在4.5-9.0℃/min内即可），反应1.5-2.5h，得反应液2，此处的惰性氛围是为了防止加热过程中起火燃烧。
合成的纳米粒子表面具有表面活性剂油胺，整体呈现亲油性的特点，环己烷等物质作为有机分散液可以较好地溶解分散MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子。
在一些实施例中，所述所述三氟乙酸钆由三氟乙酸和氧化钆制备而成。
在一些实施例中，所述惰性氛围为氮气氛围。
在一些实施例中，所述加热溶解的温度为100-130℃。
优选的，所述脱气为真空脱气，真空脱气的时间为30-50min。
在一些实施例中，乙醇沉淀离心和环己烷分散洗涤重复三次。获得上清液后，加入无水乙醇，离心后会将产物沉淀，再次用环己烷分散。目的是为了洗涤沉淀。
在一些实施例中，还包括将MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的分散液分散在有机溶剂中的步骤。
在一些实施例中，还包括将MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子、NLG919和DSPE-PEG-NH2的混合溶液避光反应10-15h的步骤；
避光反应后，在60-70℃真空加热3-10min，然后加水溶解并超声处理，离心分离、洗涤、并分散在去离子水中，得到MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米材料。
优选的，还包括将EDC、NHS和HA按质量比为20-40:30-60:0.2-0.5混合溶解后，搅拌0.5-1.5h后，向其中加入所述MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子的步骤，搅拌反应5-10h，离心分离、洗涤、分散，即得MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子。
在一些实施例中，所述有机分散剂为环己烷、三氯甲烷或二氯甲烷。
第二方面，本发明提供一种超小型Janus纳米粒子，由所述制备方法制备而成，为MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，其长径为10-15nm。平均长径大小为13.06纳米，该粒径有利于细胞内化和肿瘤部位深度聚集。
第三方面，本发明提供所述超小型Janus纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
磁性超小型Janus纳米粒子MnFe2O4@NaGdF4具有出色的磁共振成像能力，在肿瘤治疗中可以实现T1/T2双模成像并实时监测治疗过程。MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子具有良好的光热性能，可以有效地将光辐射转化为热引发癌细胞死亡。杀伤肿瘤效果明确，而且绿色环保，无辐射，无化疗毒副作用。
此外，MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子能够消耗肿瘤细胞内过量表达的过氧化氢，并在酸性条件下催化H2O2生成羟基自由基（·OH），释放具有芬顿反应和类芬顿反应活性的Mn2+和Fe3+离子。·OH可以和生物大分子发生氧化反应，对细胞内脂质和DNA造成损伤，诱导细胞的凋亡或者坏死，基本上避免了传统化疗非特异性的副作用和光动力治疗中有限的光透射深度和氧依赖性造成的低效率。
本发明的超小型纳米粒子可以在不经修饰的情况下实现肿瘤组织的深层渗透，提高其在肿瘤部位的聚集能力，还可以能够在一段时间内被代谢清除，降低纳米材料的副作用。具有Janus结构的超小型纳米粒子不仅有着良好联合治疗效果，而且在体内代谢与清除等方面也有着固有的优势。
还可以根据需要对本发明的超小型纳米粒子进行后续化学改性，以获得新性能，例如通过双亲性分子改性增强其亲水性效果；担载有机小分子药物增加其靶向治疗效果等。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的透射电镜图。
图2为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的粒径分布图。
图3为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919和MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子的DLS粒径分布图。
图4为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子和MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA 纳米粒子的Zeta电位图。
图5为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子和MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA 纳米粒子的紫外可见吸收图。
图6为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA 纳米粒子在808 nm照射下温度变化曲线，其中，a为不同浓度的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA 纳米粒子的对比曲线；b为不同激光功率的对比曲线。
图7为本发明实施例1制备的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA 纳米粒子（200 µg mL-1）中加入2 mM H2O2和0.04 mM TMB后，TMB的吸收峰随时间的变化图。
图8为本发明实施例1不同浓度的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子对L929细胞存活率的影响。
图9为本发明实施例1不同浓度的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子在模拟肿瘤微环境中PTT和CDT联合治疗对HeLa细胞的存活率的影响。
图10为本发明实施例1MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子T1/T2双模成像的表征的1/T1与Gd离子浓度的关系图；
图11为本发明实施例1MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子T1/T2双模成像的表征的1/T2与Fe离子浓度的关系图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
试剂
油胺（Oleylamine（OM，C18:80-90%））购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十八烯（1-Octadecene (ODE,90%)）购自于北京百灵威科技有限公司；乙酰丙酮锰Mn(C5H7O2)2；乙酰丙酮铁Fe(C5H7O2)3、三氟乙酸钠（CF3COONa）、三氟乙酸（CF3COOH）购自于Adamas-beta公司；氧化钆（Gd2O3）购自于北京华威锐科化工有限公司；三氯甲烷购自于国药集团化学试剂有限公司。
通过一锅法合成MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，使用DSPE-PEG-NH2封装MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子和免疫检查点IDO抑制剂NLG919，随后利用酰胺键担载可以靶向肿瘤细胞CD44受体的透明质酸（HA）。在增加纳米粒子的水溶性和肿瘤靶向性的同时还能提高小分子药物的治疗效果。最终制得具有T1/T2双模成像、光热治疗、化学动力学治疗和免疫治疗效果的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子。
步骤1、制备MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子
步骤a：0.5 mmol三氟乙酸钠、0.5 mmol三氟乙酸钆、2.5 mL油胺和2.5 mL 1-十八烯(ODE)混合分散在单口烧杯中，加热搅拌到80℃，保持0.4 h，等待取用；
步骤b：将1 mmol 的乙酰丙酮铁、0.5 mmol 的乙酰丙酮锰、30 mL 油胺混合在100mL 的四口烧瓶中。在110℃下加热溶解并真空脱气40分钟。随后将混合物在氮气氛围下快速加热到300 ℃，并在此温度下保持2小时。随后升温至310℃，将步骤a中的混合物缓慢注射到烧瓶内，并在此温度下维持1小时。冷却到室温后，用过量乙醇沉淀产物，离心分离（4000 rpm，5 min），取沉淀。随后用10 mL的环己烷分散产物，超声2 min，离心分离（2000rpm，1 min），取上清。乙醇沉淀离心和环己烷分散洗涤重复三次，最终将产物分散在三氯甲烷溶液中，得到MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，其透射电镜图如图1所示，通过测量，其平均粒径为12.74 纳米，其粒径分布图如图2所示，图2表示的是纳米粒子的粒径在9.5-10.5nm，10.5-11.5nm，11.5-12.5nm，12.5-13.5nm，13.5-14.5 nm，14.5-15.5 nm的分布概率。
步骤2、制备MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子
取0.1 mmol的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子、1 mg NLG919、10 mg的DSPE-PEG-NH2（DSPE为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，PEG为聚乙二醇）分散于10 mL的三氯甲烷中，避光搅拌12小时。于65 ℃下真空加热5 min后，加水溶解并超声2 min，离心分离（12000 rpm，5 min）。将分离后的沉淀加水溶解洗涤，再次离心。重复三次，最终将产物分散在5 mL去离子水中，得到MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子；
步骤3、制备MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子
取16 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）、24 mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.5 mg HA混合溶解在10 mL去离子水中，在室温下搅拌1小时。将步骤2中合成的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子超声2 min后加入到上述混合溶液中，搅拌8小时，离心分离（12000 rpm，5 min）。将分离后的沉淀加水溶解洗涤，再次离心。重复三次，最终将产物分散在去离子水中。
对上述合成的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子和MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子进行水合粒径分析，如图3所示，连接HA后，水合粒径从106纳米增加至295纳米。
对上述中合成的纳米粒子进行Zeta电位分析，如图4所示，MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子的 Zeta电位为51.54 mV，在其表面修饰HA后，其Zeta电位下降至23.74 mV，表明MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子的成功合成。
对MnFe2O4@NaGdF4@NLG919和MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子进行紫外可见吸收光谱分析，如图5所示，其吸收可到近红外区，可用于808纳米光热治疗。
对合成的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子进行光热效果检测，取200 µL含不同浓度的纳米粒子的溶液（0，215，430，860 µg mL-1）放在1 mL离心管里，用808 nm激光（1 Wcm-2）照射5分钟，由红外热成像仪监测温度的变化，每隔50秒记录一次温度。随后改变激光照射功率（1 W cm-2，0.75 W cm-2，0.5 W cm-2），纳米粒子溶液的浓度为860 µg mL-1，由红外热成像仪监测温度的变化，同样每隔50秒记录一次温度。结果如图6所示，随着MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子浓度的增加，溶液的温度也随之升高；然后改变激光功率，随着激光功率的增大，溶液温度也会随着升高。
羟基自由基的检测：使用TMB作为底物检测材料·OH的产生效果。将MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子（200 µg mL-1）、H2O2（2 mmol L-1）和TMB（0.04 mmol L-1）溶解到磷酸盐缓冲溶液中（pH = 5.6），用紫外可见分光光度计来观察TMB在662 nm处的吸光度的变化。
如图7所示，随着反应时间的增加，TMB的吸收峰值增大，表明·OH的产生增加。
细胞培养及相容性的检测：将L929和Hela细胞放在含有1％（v/v）青霉素/链霉素和10％（v/v）胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中，并放置在37℃，5％CO2培养箱中培养。将L929细胞每孔8000个接种到96孔板中，并用含不同浓度（0、172、344、516、688、860 μg mL-1）的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子的高糖DMEM培养基孵育24小时。通过标准3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定法检测相对细胞活力。
如图8所示，MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子对L929细胞无明显毒性，表明其体外生物相容性良好。
MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子体外化学动力学治疗效果的评估：将HeLa细胞（每孔8000个细胞）接种到96孔板中孵育24小时。随后，将含不同浓度（0、172、344、516、688、860 μg mL-1）的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子加入96孔板中。随后在37℃，5％CO2下再孵育4小时。使用新鲜的DMEM培养基替换原来培养基，将细胞在37 ℃，5％CO2下进一步培养24小时。最后，使用MTT测定评估细胞活力。
MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子模拟肿瘤微环境的体外化学动力学治疗效果的评估：将HeLa细胞（每孔8000个细胞）接种到96孔板中孵育24小时。随后，将含不同浓度（0、172、344、516、688、860 μg mL-1）的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子加入96孔板中，并加入 100 μM H2O2。随后在37℃，5％CO2下再孵育4小时。使用新鲜的DMEM培养基替换原来培养基，将细胞在37 ℃，5％CO2下进一步培养24小时。最后，使用MTT测定评估细胞活力。
MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子体外光热治疗联合光动力治疗效果的评估：将HeLa细胞（每孔8000个细胞）接种到96孔板中孵育24小时。随后，将含不同浓度（0、172、344、516、688、860 μg mL-1）的MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子加入96孔板中，并加入100 μM H2O2。随后在37℃，5％CO2下再孵育4小时。使用新鲜的DMEM培养基替换原来培养基，用808 nm激光（1 W cm-2）照射Hela细胞5分钟。然后，将细胞在37 ℃，5％CO2下进一步培养24小时。最后，使用MTT测定评估细胞活力。
如图9所示，在MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子体外化学动力学治疗效果的评估中，HeLa细胞存活率为54％。而在模拟肿瘤微环境中，PTT和CDT联合治疗使HeLa细胞存活率降低至19％左右，单独的CDT治疗的HeLa细胞存活率为28％。证明了联合治疗的效果比单独的治疗效果好很多。
磁共振（MR）成像：用计算机断层扫描技术检测不同浓度的MnFe2O4@NaGdF4的T1/T2双模成像效果。并取不同浓度下成像图像作为对照。
如图10和图11所示，实施案例合成的纳米粒子可用于MR双模成像，可作为一种MR双模成像造影剂应用在生物成像中。
实施例2
MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子的制备方法：
取0.1 mmol的实施例1中合成的MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子、1.5 mg NLG919、5 mg的DSPE-PEG-NH2分散于10 mL的三氯甲烷中，避光搅拌12小时。于60 ℃下真空加热10min后，加水溶解并超声2 min，离心分离（12000 rpm，5 min）。将分离后的沉淀加水溶解洗涤，再次离心。重复三次，最终将产物分散在5 mL去离子水中，得到MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米材料。
实施例3
MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子的制备方法：
取20 mg EDC、30 mg NHS、0.2 mg HA混合溶解在10 mL去离子水中，在室温下搅拌2小时。将0.1 mmol MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米粒子超声2 min后加入到上述混合溶液中，搅拌5小时，离心分离（12000 rpm，5 min）。将分离后的沉淀加水溶解洗涤，再次离心。重复三次，最终将产物分散在去离子水中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将三氟乙酸钠、三氟乙酸钆、油胺和1-十八烯按摩尔比为0.95-1.05:0.95-1.05:3.75-7.5:3.75-7.5混合均匀，在70-110℃反应0.2-0.5 h，得反应液1；
将乙酰丙酮铁、乙酰丙酮锰和油胺按摩尔比为2：0.8-1.2：40-75混合均匀，在70-110℃下加热溶解并脱气，然后将混合液在惰性氛围中快速加热至280-305℃，反应1.5-2.5h，得反应液2；
将反应液2升温至305-315℃，然后将反应液1注入反应液2中，维持0.5-1.5h，然后冷却，得反应液3；
向反应液3中加入过量无水乙醇形成沉淀产物，再将沉淀产物分散在有机分散液中，固液分离后取上清，即得MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的分散液。
2.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述三氟乙酸钆有三氟乙酸和氧化钆制备而成。
3.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述惰性氛围为氮气氛围，所述加热溶解的温度为100-130℃。
4.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述脱气为真空脱气，真空脱气的时间为30-50min。
5.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：乙醇沉淀离心和环己烷分散洗涤重复三次。
6.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：还包括将MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子的环己烷分散液分散在有机溶剂中的步骤。
7.根据权利要求1所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：还包括将MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子、NLG919和DSPE-PEG-NH2的混合溶液避光反应10-15h的步骤；
避光反应后，在60-70℃真空加热3-10min，然后加水溶解并超声处理，离心分离、洗涤、并分散在去离子水中，得到MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米材料。
8.根据权利要求7所述的超小型Janus纳米粒子的制备方法，其特征在于：还包括将EDC、NHS和HA按质量比为20-40:30-60:0.2-0.5混合溶解后，搅拌0.5-1.5h后，向其中加入所述MnFe2O4@NaGdF4@NLG919纳米材料的步骤，搅拌反应5-10h，离心分离、洗涤、分散，即得MnFe2O4@NaGdF4@NLG919@HA纳米粒子。
9.一种超小型Janus纳米粒子，其特征在于：由权利要求1-8任一所述制备方法制备而成，该纳米粒子为MnFe2O4@NaGdF4纳米粒子，其长径为10-15nm。
10.权利要求9所述超小型Janus纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
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