CN103623137B - 一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用。本发明中药组合物由赤芍、黄芪、生地黄等12味中药组成，化瘀通络，益气养阴，临床研究表明，本发明中药组合物能够有效治疗细胞损伤。

Description

一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地涉及一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用。

背景技术

细胞损伤主要体现在细胞膜的破坏、活性氧类物质和胞浆内游离钙增多、缺氧、化学毒害和遗传物质变异等几方面，它们互相作用或是互为因果，导致细胞损伤的发生与发展。（一）细胞膜的破坏，机械力的直接作用、酶性溶解、缺氧、活性氧类物质、细菌毒素、病毒蛋白、补体成分、化学损伤等都可破坏细胞膜结构的完整性和通透性，影响细胞膜的信息和物质交换、免疫应答、细胞分裂与分化等功能。细胞膜受到破坏的机制在于进行性膜磷脂减少，磷脂降解产物堆积，以及细胞膜与细胞骨架分离使细胞膜易受拉力损害等。细胞膜破坏是细胞损伤特别是细胞不可逆性损伤的关键环节。（二）活性氧类物质的损伤，活性氧类物质（activated oxygen species ,AOS）又称反应性氧类物质，包括处于自由基状态的氧（如超氧自由基 和羟自由基OH），以及不属于自由基的过氧化氢H₂ O₂。自由基（free radicals）是原子最外层偶数电子失去一个电子后形成的具有强氧化活性的基团。细胞内同时存在生成AOS的体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系。正常小量生成的AOS，会被超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶及维生素E等细胞内外抗氧化剂清除。在缺氧、缺血、细胞吞噬、化学性放射性损伤、炎症以及老化等的氧化还原过程中，AOS生成增多，脂质、蛋白质和DNA过氧化，分别引起膜相结构膜质双层稳定性下降，DNA单链破坏与断裂，促进含硫蛋白质相互交联，并可直接导致多肽破裂。AOS的强氧化作用是细胞损伤的基本环节。（三）细胞浆内高游离钙的损伤磷脂、蛋白质、ATP和DNA等会被胞浆内磷脂酶、蛋白酶、ATP酶和核酸酶等降解，此过程需要游离钙的活化。正常时细胞内游离钙与钙转运蛋白结合贮存于内质网、线粒体等处钙库内，胞浆处于低游离钙状态。细胞膜ATP钙泵和钙离子通道，参与胞浆内低游离钙浓度的调节。细胞缺氧、中毒时，ATP减少，Na+/Ca2+交换蛋白直接或间接激活胞浆内游离钙使之继发增多，促进上述酶类活化而损伤细胞。细胞内钙浓度往往与细胞结构和功能损伤程度呈正相关，大量钙的流入导致的细胞内高游离钙（钙超载）是许多因素损伤细胞的终未环节，并且是细胞死亡最终形态学变化的潜在介导者。（四）缺氧的损伤，细胞缺氧会导致线粒体氧化磷酸化受抑，ATP形成减少，细胞膜钠-钾泵、钙泵功能低下，胞浆内蛋白质合成和脂肪运出障碍，无氧糖酵解增强，造成细胞酸中毒，溶酶体膜破裂，DNA链受损。缺氧还使活性氧类物质增多，引起脂质崩解和细胞骨架破坏。轻度短暂缺氧可使细胞水肿和脂肪变，重度持续缺氧可引发细胞坏死。在一些情况下，缺血后血流的恢复会引起存活组织的过氧化，反而加剧组织损伤，称为缺血再灌注损伤。（五）化学性损伤，许多化学物质包括药物都可造成细胞损伤。化学性损伤可为全身性或局部性两种类型，前者如氯化物中毒，后者如接触强酸强碱对皮肤粘膜的直接损伤。一些化学物质的作用还有器官特异性，如CC1₄引起的肝损伤。化学性损伤的途径有：①化学物本身具有直接细胞毒作用。例如氰化物能迅速封闭线粒体的细胞色素氧化酶系统而致猝死；氯化汞中毒时，汞与细胞膜含疏蛋白结合而损害ATP酶依赖性膜转运功能；化学性抗肿瘤药物和抗生素也可通过类似的直接作用伤及细胞。②代谢产物对靶细胞的细胞毒作用。肝、肾、骨髓、心肌常是毒性代谢产物的靶器官，如CCl4本身并无活性，其在肝细胞被转化为毒性自由基CCl3后，便可引起滑面内质网肿胀，脂肪代谢障碍。③诱发过敏反应等免疫损伤，如青霉素引发I型变态反应。④诱发DNA损伤（见遗传变异）。化学物质和药物的剂量、作用时间、吸收蓄积和代谢排出的部位以及代谢速率的个体差异等，分别影响化学性损伤的程度、速度与部位。（六）遗传变异，化学物质和药物、病毒、射线等均可损伤核内DNA，诱发基因突变和染色体畸变，使细胞发生遗传变异（genetic variation）。通过引起：①结构蛋白合成低下，细胞缺乏生命必需的蛋白质；②阻止重要功能细胞核分裂；③合成异常生长调节蛋白；④引发先天性或后天性酶合成障碍等环节，使细胞因缺乏生命必需的代谢机制而发生死亡。

疾病机理：1.皮肉筋骨病机，皮肉为人之外壁，内充卫气，用于卫外，属肺所主。筋，是指筋络、筋膜、肌腱、韧带、肌肉、 关节囊、关节软骨等的总称。用以连属关节，络缀形体，主司关节运动，属肝所主。骨，属肾所主，是奇恒之府’为立身之主干，为髓之府。因此，肢体的运动，有赖于筋骨、气血、肝肾的功能正常。皮肉筋骨的损伤，在伤科疾患中最为多见，一般分为“伤皮肉”、“伤筋”、“伤骨”，但又互相联系。伤皮肉，则人体卫外门户洞开，外邪容易侵入；或气血瘀滞，郁而化热，以致瘀热为毒；亦可由皮肉失养，导致肢体痿弱或功能障碍。伤筋的临床表现、病理变化复杂多端，如筋急、筋缓、筋缩、筋挛、筋痿、筋结、筋惕等。伤骨包括骨折、脱位，多因间接暴力或直接暴力所致。但筋骨损伤不是独立存在，伤筋能损骨，损骨亦能伤筋。2.气血精津病机，气血与损伤的关系是损伤病机的核心内容。伤气一般可分为气滞与气虚，但损伤严重者可出现气闭、气脱等证。伤血一般分为出血和瘀血两种，其病理现象主要有血瘀、血虚和血热等。但气血之间有着不可分割的关系。《素问·阴阳应象大论》说：“气伤痛，形伤肿”，痛是气滞的主要证候，其特点为外无肿形，痛无定处，范围较广，体表无明显压痛点；肿是血瘀的常见表现，其特点是局部肿胀疼痛，痛有定处，局部压痛明显，出现青紫、瘀斑等．临床上海多气血两伤，肿痛并见，但有偏胜。精是构成人体和维持生命活动的基本物质，即肾的先天之精与水谷后天之精。津液是人体内一切正常水液的总称，主要是指体液而言。清而稀薄者称为津，浊而浓稠者称为液。津液有滑利关节，润泽皮肉、筋骨，濡养脑髓和骨髓作用。损伤积瘀生热，可灼伤津液，重伤久病，常能严重耗伤阴液，而津液大量丢失，可致“气随液脱”。精气生而津液成，则表现为神；若精气伤、津液损，则失神，临床表现为危候。3.脏腑经络病机，脏腑是化生气血、通调经络、濡养皮肉筋骨，主持人体生命活动的主要器官。经络是运行全身气血，联络脏腑肢节，沟通上下内外，调节体内各部分的通路。

本发明公开了一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用，本发明中药组合物由赤芍、黄芪、生地黄等12味中药组成，具有化瘀通络，益气养阴，临床研究表明，本发明中药组合物能够有效治疗细胞损伤。

发明内容

本发明目的是提供一种中药组合物在制备治疗细胞损伤药物中的应用；

本发明优选为，该中药组合物在制备保护血管内皮细胞损伤的药物中的应用；

本发明还优选为，提供了该药物在制备降低粘附分子粘附于血管引起的细胞损伤药物中的应用。

本发明还优选为，提供了该药物在制备降低粘附分子粘附于血管引起的细胞损伤药物中的应用，其中所述粘附分子为细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、E-选择素。

本发明所述中药可以被有相同或相似功效果的中药代替，并且这些药材均可以按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》炮制。

所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

赤芍180-230份、黄芪280-330份、生地黄180-230份、蒲黄130-170份、女贞子180-230份、墨旱莲180-230份、银杏叶280-330份、大黄80-130份、三七80-130份、地龙80-130份、决明子280-330份、葛根180-230份。

优选地，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：

赤芍180份、黄芪330份、生地黄180份、蒲黄170份、女贞子180份、墨旱莲230份、银杏叶280份、大黄130份、三七80份、地龙130份、决明子280份、葛根230份。

或：

赤芍230份、黄芪280份、生地黄230份、蒲黄130份、女贞子230份、墨旱莲180份、银杏叶330份、大黄80份、三七130份、地龙80份、决明子330份、葛根180份。

或：

赤芍200份、黄芪300份、生地黄200份、蒲黄150份、女贞子200份、墨旱莲200份、银杏叶300份、大黄100份、三七100份、地龙100份、决明子300份、葛根200份。

或：

赤芍220份、黄芪290份、生地黄190份、蒲黄160份、女贞子220份、墨旱莲190份、银杏叶290份、大黄90份、三七90份、地龙120份、决明子320份、葛根220份。

本发明中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。

本发明中药组合物胶囊剂的制备方法：

（1）、按比例称取蒲黄，以4-8倍量60-80％乙醇为溶剂，先用适量溶剂浸润药材，密闭10-30分钟后装渗漉柱，加剩余溶剂浸泡20-36小时，渗漉，收集渗漉液，备用；

（2）、按比例称取生地黄、地龙，第一次加8-10倍量水，浸泡10-30分钟，加热煎煮1-2小时，过滤；第二次加6-9倍量的水，煎煮1-2小时，过滤，滤液合并，浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20，放冷，加适量乙醇使含醇量达50-70％，充分搅拌，冷藏20-36小时，过滤，滤液备用；

（3）、按比例称取黄芪、赤芍，加6-10倍量40-60％乙醇，浸泡10-30分钟，回流提取2-3次，每次1-3小时，过滤，滤液合并，备用；

（4）、按比例称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子，加6-9倍量70-90％乙醇，浸泡10-30分钟，回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，滤液合并，备用；

（5）、将步骤（1）、（2）、（3）和（4）所得提取液合并，减压回收乙醇，继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏；

（6）、按比例称取三七，粉碎成100-120目粉，加入上述清膏中，搅拌均匀，真空干燥，干浸膏粉碎成80-120目粉，备用；

（7）、取干膏粉和淀粉，混和均匀，用70-90%乙醇为粘合剂制软材，筛网制粒，整粒，装胶囊，即得。

本发明中药组合物中，作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》（1977年7月，第一版，上海科学技术出版社）和《中国药典》（2005年版，化学工业出版社）。

本发明中药组合物还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂等。

本发明的应用中，所述中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

试验例一 为阐明本发明中药组合物治疗细胞损伤的活性，用按实施例1方法所制得的药物（以下称本发明药物）进行了下列试验。

1、临床资料

1.1 诊断标准采用2005年中国成人细胞损伤防治指南标准进行分级。Ⅰ级:坐位收缩压(SBP) 140-159 mmHg，坐位舒张压(DBP) 90-99mrnHg；Ⅱ级：坐位SBP160-179 mmHg，坐位DBP100- 109 mmHg；Ⅲ级：坐位SBP≥180 mmHg，坐位DBP≥110 mmHg；单纯性收缩细胞损伤：坐位SBP≥140 mmHg，坐位DBP<90 mmHg(1mmHg=0.1333kPa，下同)。

1.2 中医辨证标准参照《中药新药治疗细胞损伤病的临床研究指导原则》及《中医病证诊断疗效标准》。阴虚阳亢型表现为眩晕、头痛、腰膝酸软、耳鸣健忘、五心烦热、心悸失眠，舌质红、苔薄白或少苔，脉弦细数。

1.3 细胞损伤病入选标准

轻、中度(Ⅰ-Ⅱ级)原发性细胞损伤患者，初诊发现未用药或近一周未用降压药，排除继发性细胞损伤；重度细胞损伤坐位DBP≥110 mmHg或SBP≥180 mmHg，心、肝、肾功能不全，血糖未控制者。

1.4 病例选择

110例患者随机分为对照组和治疗组，对照组54例，男30例，女24例，平均年龄52.3岁；治疗组56例，男28例，女28例，平均年龄53.4岁。两组比较，无显著性差异，具有可比性。

2、方法

2.1 治疗方法

对照组：服用氨氯地平（辉瑞制药有限公司生产）5mg/片，每日一次口服。治疗组：在对照组基础上加服本发明药物，3-4粒/次，每日三次。

2.2 测定指标

观察治疗前后血压，临床症状体征，血尿、粪常规及不良反应等。

2.3 统计学方法：采用t检验，Ridit检验。

3、结果

3.1降压疗效标准

降压疗效标准参照《中药新药临床研究指导原则》中细胞损伤评定疗效标准。（1）显效：坐位DBP下降≥10 mmHg并降至正常或SBP下降≥20mmHg； (2)有效：坐位DBP下降虽未达到≥10 mmHg,但降至正常，或SBP下降10-19 mmHg； (3)无效：未达到上述标准。

3.2总有效率结果（见表1）

表1 两组间疗效比较 （例，%）

组别	例数	显效	有效	无效	总有效率
						对照组	54	27（50.0）	10（18.5）	17（31.5）	37（68.5）
治疗组	56	31（55.4）	19（33.9）	6（10.7）	50（89.3）#

注：与对照组比较，#P<0.05。

治疗组的总有效率在89.3%以上，与对照组比较，P<0.05，具有显著性差异。

3.3血压降低结果（见表2）

表2 两组治疗前后血压变化

注：各组中与治疗前相比较，*P<0.05；与对照组治疗后比较，#P<0.05。

各组治疗后血压与治疗前血压相比，P<0.05，具有显著性差异。治疗组治疗后血压与对照组治疗后血压相比，具有显著性差异。

3.5中医症状改善有效率

对照组中头晕、头痛、烦躁、便秘及失眠症状改善总有效率分别为50.1%、53.5%、47.2%、45.3%、45.9%；治疗组上述症状改善总有效率分别为84.3%、85.4%、86.2%、87.0%、85.8%，治疗组与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.01）。

3.6中医治疗效果

中医症状体征分别参照《中药新药治疗细胞损伤病的临床研究指导原则》及中华人民共和国中医药行业标准。将中医症状体征以量化标准分为无、轻、中、重分别记分为0、2、4、6分。两组中医症状治疗前后比较，差异具有统计学意义（P<0.01），两组治疗后比较差异具有统计学意义（P<0.01），治疗组明显优于对照组。（见表3）

表3 两组中医症状治疗前后积分改善情况

注：各组中与治疗前比较，*P<0.01；与对照组治疗后比较，^#P<0.01。

3.7 不良反应情况

两组患者血、尿、大便常规及肝功能、肾功能治疗前后无明显变化。不良反应：对照组8例有头痛、面红、水肿，治疗组未见明显不良反应发生。

4结论 综上所述，本发明药物可以有效治疗细胞损伤，且无明显不良反应。

试验例二 ：本发明药物对H₂O₂ 致内皮细胞损伤的保护作用，采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304，用按实施例1方法所制得的药物（以下称本发明药物）进行了下列试验。

1 材料

1.1细胞：人脐静脉内皮细胞株ECV304，购于中国医科大学肿瘤研究所，复苏后用含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中静置培养，24小时换液一次。

1.2仪器、试剂与药物：本发明药物高、中、低剂量组浓度分别为1.5、1、0.5 g生药/L，本发明药物由石家庄以岭药业股份有限公司提供；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒购自南京建成生物工程研究所；血栓调节蛋白（TM）酶联免疫测试剂盒，FACSCalibur流式细胞仪。

2 方法

2.1 对过氧化氢( H₂O₂) 损伤后内皮细胞死亡率的影响 ：取对数生长期的内皮细胞随机分为5 组: 空白对照组、 模型对照组、 本发明药物高、中、低剂量组，将各组细胞培养 24 h 后制成单细胞悬液，收集细胞于离心管中，除空白组外，其余各组分别加入 200 μmol·L^{－ 1}的，留 1 管做阴性对照( 调零) 。加入终质量浓度为 10 mg·L^{－ 1} PI 避光染色5 min，利用流式细胞仪检测各组细胞的死亡率。

2.2 对 H₂O₂损伤后内皮细胞培养液 TM 含量的影响 取对数生长期细胞接种于96 孔板中，置培养箱中培养至细胞达 80% 融合时，将细胞随机分成 5组: 空白对照组、本发明药物高、中、低剂量组，模型对照组。将各组细胞培养 24 h 后，除空白对照组外，各组均换入含有 200 μmol·L^{－ 1} H₂O₂的培养液 200 μL，空白组换入不含 H₂O₂的培养液 200 μL，再将各组细胞培养 18 h 后取出，取上清，作为待测样品。按试剂盒说明的方法测定。

2.3 对H₂O₂损伤后内皮细胞培养液 LDH 活性的影响 待测样品处理方法同 2. 2。用荧光光度法，按照试剂盒说明书测定细胞培养液中 LDH 的活性。

3 结果

3.1 对过氧化氢( H₂O₂) 损伤后内皮细胞死亡率的影响 加H₂O₂刺激后内皮细胞死亡率显著增加(P<0.01)。本发明药物不同剂量均显著降低H₂O₂损伤后内皮细胞死亡率(P<0.01)。

表 4 本发明药物对过氧化氢损伤后内皮细胞死亡率的影响(±s，n=6)

组别	死亡率%
		对照组	10.20±0.01**
模型组	31.08±0.03
		本发明药物低剂组	18.69±0.01**
本发明药物中剂组	15.15±0.02**
		本发明药物高剂组	10.66±0.03**

与模型组比较，* P<0.05，** P<0.01

3.2 对 H₂O₂损伤后内皮细胞培养液 TM 含量和内皮细胞培养液 LDH 活性的影响经H₂O₂处理后模型组中TM含量明显上升（P<0.05），本发明药物高、中、低浓度均能抑制H₂O₂增加TM的作用和对 H₂O₂所致内皮细胞LDH泄漏有明显的对抗作用，对二者的作用均与低、中、高剂量呈良好的量效关系，即随着剂量的增大对TM的抑制作用增强和减少LDH的渗出作用增强，结果见表5

表 5 本发明药物对过氧化氢( H₂O₂) 损伤后内皮细胞培养液 TM 含量和内皮细胞培养液 LDH 活性的影响(±s，n=10)

组别	TM /ug/ml	LDH /U·L<sup>-1</sup>
			对照组	38.3±6.9*	576.8±182.6 **
模型组	61.5±13.8	2103.7±172.3
			本发明药物低剂组	36.1±7.0 *	1142.8±178.9**
本发明药物中剂组	32.5±5.8*	1018.1±188.7**
			本发明药物高剂组	27.3±8.2 **	963.7±204.9**

与模型组比较，* P<0.05，** P<0.01

4 结论 由以上试验结果可知，本发明药物在对过氧化氢诱导的细胞损伤模型上，通过检测内皮细胞死亡率和培养液中TM含量和LDH 活性可知，本发明药物低、中、高剂量均对血管内皮细胞损伤有明显的保护作用，高剂量对细胞损伤的效果最好。

试验例三、为阐明本发明中药组合物治疗糖尿病小鼠视网膜粘附分子粘附于血管引起的细胞损伤，用按实施例1方法所制得的药物（以下称本发明药物）进行了下列药理试验。

1 材料

1.1 动物 KK/Upj-Ay小鼠，30～40 g；C57BL/6小鼠，25～30 g，均为SPF级，雄性，12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：0225144。

1.2 试剂与仪器 本发明药物，由石家庄以岭药业股份有限公司提供；细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素（E-selectin）和核因子-κB（NF-κB）引物由上海生工生物技术公司合成；ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB一抗购自Santa Cruz公司。荧光定量PCR仪，ABI公司；凝胶成像分析仪，Biorad。

2 方法

2.1 动物分组与给药 40只KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值（FBG）分为模型组、本发明药物高、中、低剂量组，另设C57BL/6小鼠为对照组，每组10只动物。采用灌胃给药，本发明药物高、中、低剂量组分别给予8.32、4.16、2.08 g生药/kg的本发明药物，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日一次，连续3个月。

2.2 一般观察 给药期间，观察小鼠全身一般情况，每周一次测定体重、摄食、摄水、尿量；每月一次测定FBG。

2.3 形态学变化 取小鼠眼球，置于甲醛固定，HE染色。小鼠眼球，置于戊二醛固定，电镜观察超微结构。

2.4 Western blot法检测ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB蛋白的表达 取视网膜组织，常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

2.5 统计学处理 结果以 ±s 表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA分析处理和Dunnett检验。

3 结果

3.1 一般情况 模型组小鼠明显体重减轻，多饮、多食、多尿明显，本发明药物能明显缓解“三多一少”症状，对照组饮食正常，体重增长明显，无上述症状出现。模型组FBG明显高于对照组，本发明药物组FBG明显低于模型组，治疗8、12周，中、高剂组有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表6。

表 6 本发明药物对DR小鼠FBG的影响(±s，n=10)

与对照组比较，^△ P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，* P<0.05，** P<0.01

3.2 形态学变化 HE显示对照组视网膜各层细胞层次分明，细胞结构紧密；模型组视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱，本发明药物能改善上述变化。电镜结果显示对照组小鼠视网膜细胞排列整齐，细胞核和细胞器正常；模型组视网膜出现空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性。内、外核层细胞内线粒体肿胀，光感受器细胞膜破裂，核固缩，周边可见细胞碎屑。本发明药物组外节膜盘间隙较模型组缩小，排列平行度稍好，内外核层细胞线粒体空泡变性有所减少，高剂量组最为明显。

3.3 视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB mRNA表达的变化 qPCR结果显示模型组小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB mRNA表达明显高于对照组（P<0.05，P<0.01），与模型组比，本发明药物中、高剂组ICAM-1、高剂组VCAM-1、低、中、高剂组E-selectin和中、高剂组NF-κB mRNA表达水平明显下降（P<0.05，P<0.01），见表7。

表7 本发明药物对DR小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin

和NF-κB mRNA表达的影响(±s, n = 10)

组别	ICAM-1	VCAM-1	E-selectin	NF-κB
					对照组	1.12±0.11	1.58±0.41	1.45±0.47	1.24±0.28
模型组	6.06±0.95<sup>△△</sup>	6.61±1.67<sup>△</sup>	7.37±1.16<sup>△△</sup>	3.74±0.90<sup>△</sup>
					本发明药物低剂组	4.06±1.04	3.54±1.24	3.03±0.36<sup>**</sup>	2.36±0.43
本发明药物中剂组	3.16±0.89<sup>*</sup>	4.41±1.30	2.55±0.62<sup>**</sup>	1.27±0.26<sup>*</sup>
					本发明药物高剂组	1.84±0.75<sup>**</sup>	2.85±0.81<sup>*</sup>	2.26±0.47<sup>**</sup>	1.37±0.41<sup>*</sup>

与模型组比较，^* P<0.05，^** P<0.01；与对照组比较，^△ P<0.05，^△△ P<0.01；

3.4 视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB蛋白表达的变化 Western blot结果显示正常对照组视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB蛋白表达无或弱表达，模型组中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.01），本发明药物组与模型组比，高剂组ICAM-1、中高剂组VCAM-1、中高剂组E-selectin和低中高剂组NF-κB蛋白表达均明显下降（P<0.01）。见表8。图2。

表8本发明药物对DR小鼠视网膜ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和NF-κB蛋白表达的影响(±s, n = 10)

组别	ICAM-1	VCAM-1	E-selectin	NF-κB
					对照组	0.13±0.03	0.09±0.01	0.12±0.02	0.08±0.01
模型组	0.61±0.15<sup>△△</sup>	0.57±0.13<sup>△△</sup>	0.67±0.18<sup>△△</sup>	0.76±0.19<sup>△△</sup>
					本发明药物低剂组	0.54±0.12	0.42±0.05	0.55±0.15	0.42±0.08<sup>*</sup>
本发明药物中剂组	0.49±0.09	0.34±0.06<sup>*</sup>	0.36±0.07<sup>*</sup>	0.34±0.07<sup>*</sup>
					本发明药物高剂组	0.34±0.06<sup>*</sup>	0.32±0.04<sup>*</sup>	0.31±0.08<sup>*</sup>	0.28±0.03<sup>*</sup>

与模型组比较，^* P<0.05，^** P<0.01；与对照组比较，^△ P<0.05，^△△ P<0.01；

4结论：综上所述，本发明药物可以降低糖尿病小鼠视网膜粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-选择素（E-selectin）和核因子-κB（NF-κB）表达，降低糖尿病小鼠视网膜粘附分子粘附于血管引起的细胞损伤，且无明显不良反应。

附图说明

图1各组荧光定量PCR扩增曲线。

图2各组Western blot结果，1.对照组；2.模型组；3.本发明药物低剂组；4.本发明药物中剂组；5.本发明药物高剂组。

具体实施方式

实施例1：本发明药物胶囊剂的制备

处方：

赤芍180克、黄芪330克、生地黄180克、蒲黄170克、女贞子180克、墨旱莲230克、银杏叶280克、大黄130克、三七80克、地龙130克、决明子280克、葛根230克。

制备方法：

（1）、按处方量称取蒲黄，以6倍量70％乙醇为溶剂，先用适量溶剂浸润药材，密闭15分钟后装渗漉柱，加剩余溶剂浸泡24小时，渗漉，收集渗漉液，备用；

（2）、按处方量称取生地黄、地龙，第一次加9倍量水，浸泡20分钟，加热煎煮1.5小时，过滤；第二次加7倍量的水，煎煮1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20，放冷，加适量乙醇使含醇量达60％，充分搅拌，冷藏24小时，过滤，滤液备用；

（3）、按处方量称取黄芪、赤芍，加8倍量50％乙醇，浸泡20分钟，回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液合并，备用；

（4）、按处方量称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子，加8倍量80％乙醇，浸泡20分钟，回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液合并，备用；

（5）、将步骤（1）、（2）、（3）和（4）所得提取液合并，减压回收乙醇，继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏；

（6）、按处方量称取三七，粉碎成100目粉，加入上述清膏中，搅拌均匀，在真空度为0.07Mpa，温度为65℃条件下烘干，干浸膏粉碎成100目粉，备用；

（7）、取干膏粉和淀粉，混和均匀，用85%乙醇为粘合剂制软材，20目筛网制粒，65℃烘干，18目筛网整粒，装胶囊，即得。

实施例2：本发明药物片剂的制备

处方：

赤芍230克、黄芪280克、生地黄230克、蒲黄130克、女贞子230克、墨旱莲180克、银杏叶330克、大黄80克、三七130克、地龙80克、决明子330克、葛根180克。

制备方法：

（1）、按比例称取蒲黄，以5倍量75％乙醇为溶剂，先用适量溶剂浸润药材，密闭20分钟后装渗漉柱，加剩余溶剂浸泡27小时，以约3ml/kg/min的速度渗漉，收集渗漉液，备用；

（2）、按比例称取生地黄、地龙，第一次加9倍量水，浸泡15分钟，加热煎煮1.5小时，过滤；第二次加7倍量的水，煎煮2小时，过滤，滤液合并，浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20，放冷，加适量乙醇使含醇量达60％，充分搅拌，4℃以下冷藏28小时，过滤，滤液备用；

（3）、按比例称取黄芪、赤芍，加9倍量45％乙醇，浸泡20分钟，回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液合并，备用；

（4）、按比例称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子，加8倍量80％乙醇，浸泡25分钟，回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液合并，备用；

（5）、将步骤（1）、（2）、（3）和（4）所得提取液合并，减压回收乙醇，继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏；

（6）、按比例称取三七，粉碎成110目细粉，备用；

（7）、按常规制剂方法制成片剂。

实施例3：本发明药物口服液的制备

处方：

赤芍200克、黄芪300克、生地黄200克、蒲黄150克、女贞子200克、墨旱莲200克、银杏叶300克、大黄100克、三七100克、地龙100克、决明子300克、葛根200克。

制备方法：按常规制剂方法制成口服液。

实施例4：本发明药物丸剂的制备

处方：

赤芍220克、黄芪290克、生地黄190克、蒲黄160克、女贞子220克、墨旱莲190克、银杏叶290克、大黄90克、三七90克、地龙120克、决明子320克、葛根220克。

制备方法：按常规制剂方法制成丸剂。

Claims (7)

1.一种中药组合物在制备对过氧化氢引起的内皮细胞损伤具有保护作用的药物中的应用，其特征在于所述中药组合物是由如下重量份比例的原料药制成的：赤芍180-230份、黄芪280-330份、生地黄180-230份、蒲黄130-170份、女贞子180-230份、墨旱莲180-230份、银杏叶280-330份、大黄80-130份、三七80-130份、地龙80-130份、决明子280-330份、葛根180-230份。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物是由如下重量份比例的原料药制成:赤芍180份、黄芪330份、生地黄180份、蒲黄170份、女贞子180份、墨旱莲230份、银杏叶280份、大黄130份、三七80份、地龙130份、决明子280份、葛根230份。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物是由如下重量份比例的原料药制成:

赤芍230份、黄芪280份、生地黄230份、蒲黄130份、女贞子230份、墨旱莲180份、银杏叶330份、大黄80份、三七130份、地龙80份、决明子330份、葛根180份。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物是由如下重量份比例的原料药制成:

赤芍200份、黄芪300份、生地黄200份、蒲黄150份、女贞子200份、墨旱莲200份、银杏叶300份、大黄100份、三七100份、地龙100份、决明子300份、葛根200份。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物是由如下重量份比例的原料药制成:

赤芍220份、黄芪290份、生地黄190份、蒲黄160份、女贞子220份、墨旱莲190份、银杏叶290份、大黄90份、三七90份、地龙120份、决明子320份、葛根220份。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述胶囊剂的制备方法是由以下步骤组成：

（1）、按比例称取蒲黄，以4-8倍量60-80％乙醇为溶剂，先用适量溶剂浸润药材，密闭10-30分钟后装渗漉柱，加剩余溶剂浸泡20-36小时，渗漉，收集渗漉液，备用；

（2）、按比例称取生地黄、地龙，第一次加8-10倍量水，浸泡10-30分钟，加热煎煮1-2小时，过滤；第二次加6-9倍量的水，煎煮1-2小时，过滤，滤液合并，浓缩至60℃热测相对密度1.15-1.20，放冷，加适量乙醇使含醇量达50-70％，充分搅拌，冷藏20-36小时，过滤，滤液备用；

（3）、按比例称取黄芪、赤芍，加6-10倍量40-60％乙醇，浸泡10-30分钟，回流提取2-3次，每次1-3小时，过滤，滤液合并，备用；

（4）、按比例称取女贞子、墨旱莲、葛根、银杏叶、大黄、决明子，加6-9倍量70-90％乙醇，浸泡10-30分钟，回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，滤液合并，备用；

（5）、将步骤（1）、（2）、（3）和（4）所得提取液合并，减压回收乙醇，继续浓缩至60℃热测相对密度为1.25-1.30的清膏；

（6）、按比例称取三七，粉碎成100-120目粉，加入上述清膏中，搅拌均匀，真空干燥，干浸膏粉碎成80-120目粉，备用；

（7）、取干膏粉和淀粉，混和均匀，用70-90%乙醇为粘合剂制软材，筛网制粒，整粒，装胶囊，即得。