CN103614470A - 酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 - Google Patents
酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103614470A CN103614470A CN201310603130.XA CN201310603130A CN103614470A CN 103614470 A CN103614470 A CN 103614470A CN 201310603130 A CN201310603130 A CN 201310603130A CN 103614470 A CN103614470 A CN 103614470A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- probe
- primer
- nucleotide sequence
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241000193412 Alicyclobacillus acidoterrestris Species 0.000 title abstract description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 16
- 241001147780 Alicyclobacillus Species 0.000 claims description 11
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 8
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 2
- 125000002723 alicyclic group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SSIZLKDLDKIHEV-UHFFFAOYSA-N 2,6-dibromophenol Chemical compound OC1=C(Br)C=CC=C1Br SSIZLKDLDKIHEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001063273 Alicyclobacillus acidiphilus Species 0.000 description 2
- 241000640374 Alicyclobacillus acidocaldarius Species 0.000 description 2
- 241000850382 Alicyclobacillus contaminans Species 0.000 description 2
- 241000850378 Alicyclobacillus fastidiosus Species 0.000 description 2
- 241000532138 Alicyclobacillus herbarius Species 0.000 description 2
- 241000032588 Alicyclobacillus hesperidum Species 0.000 description 2
- 241001442202 Alicyclobacillus sendaiensis Species 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 241000193415 Alicyclobacillus cycloheptanicus Species 0.000 description 1
- 241001185617 Alicyclobacillus pomorum Species 0.000 description 1
- 241001429219 Bacillus ginsengihumi Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229960001867 guaiacol Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及酸土脂环酸芽孢杆菌PCR检测用引物、探针及应用。所涉及的引物和探针是根据A.acidoterrestris16S rDNA基因的保守区域设计的，用以定量检测待测样品中A.acidoterrestris的核酸拷贝数。具体来讲，所述引物的上游引物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列；所述探针具有序列表中SEQ ID NO.3的核苷酸序列。所涉及的方法以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好、检测速度快、准确性好和灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物检测技术领域，具体涉及酸土脂环酸芽孢杆菌（A.acidoterrestris）的荧光定量PCR检测中引物和探针及应用。
背景技术
脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus spp.）是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状、产芽孢、严格需氧，可以在pH2.5～6.0，温度20～60℃范围内存活和生长。由于其具有耐热、耐酸的特性，普通的巴氏杀菌难以将其杀灭，且其生长代谢产生愈创木酚和2,6-二溴苯酚等物质，使果汁口感、风味变差，形成白色沉淀或雾状浑浊，因此，脂环酸芽孢杆菌成为果汁和饮料加工业中重要的质量指标。因为酸土脂环酸芽孢杆菌（A.acidoterrestris）是果汁污染和腐败中分离最多的脂环酸芽孢杆菌类细菌，所以，A.acidoterrestris已成为果汁饮料加工生产中最重要的监测指标之一。
目前，主要采用培养法进行A.acidoterrestris的常规检测，虽然这种方法简单、易操作，但耗时长、检测滞后于生产。同时，A.acidoterrestris在饮料及食品中含量非常低，复杂的食品成分和非目标微生物对目标菌体的检测有非常大的影响，常规PCR、酶联免疫吸附测定法、傅里叶变换红外光谱和电子鼻等检测方法需要与菌体培养富集结合才能到达检测目的，因此，尚未应用于食品工业实际检测中。
发明内容
本发明的目的是提供用于A.acidoterrestris实时荧光PCR检测的引物及探针序列。
本发明通过对Alicyclobacillus spp.中A.acidocaldarius,A.acidiphilus,A.contaminans,A.fastidiosus,A.herbarius,A.hesperidum,A.sendaiensis和A.acidoterrestris10个不同种细菌的16S rDNA序列分析，分别设计了引物和荧光探针。所述的引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，该探针的一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。该探针选择的报告荧光染料为FAM，选择的淬灭荧光染料为MGB。
本发明还提供了一种检测A.acidoterrestris的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的上游引物和核苷酸序列为SEQ IDNO.2的下游引物以及核苷酸序列为SEQ ID NO.3的探针进行实时荧光定量PCR检测，每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定A.acidoterrestris的存在。
优选的，上述方法中的荧光定量PCR反应过程中的退火温度为60℃。
具体的，本发明中对于A.acidoterrestris的检测是以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应条件是在反应体系中加入无菌超纯水、2×PremixEx Taq、上游引物、下游引物、探针和总DNA。
更具体的，本发明中对于A.acidoterrestris的检测，是在25μL反应体系中进行，反应条件是加入12.5μL2×Premix Ex Taq,0.5μL10μM上游引物,0.5μL10μM下游引物,1.0μL10μM探针,2.0μL总模板和8.5μL无菌超纯水。
其中，荧光PCR反应的反应条件为：第一个循环为95℃10min；随后40个循环，95℃15s，60℃1min。
本发明还提供了一种用于A.acidoterrestris检测的试剂盒，该试剂盒含有上述上游引物SEQ ID NO.1、下游引物SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3。
进一步，将本发明中设计的引物、荧光探针以及相关的试剂组装成试剂盒，以方便使用。
本发明对Alicyclobacillus spp.中10个不同种的16S rDNA基因序列进行比较，并设计了基于A.acidoterrestris保守区域的引物和荧光探针。通过软件评价和对实际菌株的检测，说明获得的引物和探针具有非常好的特异性。本发明建立的实时荧光PCR检测方法灵敏度高、特异性强，可以简单快速的判断样品中是否含有A.acidoterrestris，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1是对Alicyclobacillus spp.中不同菌株的16S rDNA基因序列分析，在此基础上进行引物和探针的设计。其中，→为上游引物FP,←为下游引物RP，==为探针LP；
图2是实时荧光PCR的特异性评价结果示意图；
图3（a）表示不同浓度菌体的PCR扩增曲线；图3（b）分别表示不同浓度菌体的标准曲线。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不是用来限制本发明的范围。
实施例1：
引物及探针的设计与合成
采用Primer Premier5软件对Alicyclobacillus spp.中10个不同种的16SrDNA基因序列进行比较，如图1所示，并采用探针设计软件Primer Express设计了基于A.acidoterrestris保守区域的引物和荧光探针，如表1所示。经过大量筛选得到如下序列的引物序列和探针，如表2所示。
引物的上游引物（FP）序列为SEQ ID NO.1，引物的下游引物（RP）序列为SEQ ID NO.2，具体引物序列的组成如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGAGT AACAC GTGGG CAATC TG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-CTACC CGTGT ATTAT CCGGC AT-3’。
荧光探针的核苷酸序列为：5’-CTTTCAGACTGGAATAAC-3’，在探针的5’端标记6-carboxyfluorescein（FAM）荧光染料，3’端标记Minor Groove Binder（MGB）荧光染料。
将上述游引物（FP）、下游引物（RP）和荧光探针（LP）分别配制成浓度为10μmol/L的溶液，备用。
总DNA的提取
总DNA的提取，采用试剂盒法。试剂盒购买于takara-宝生物工程(大连)有限公司。
将需要检测的样品（5mL）置于离心管中，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心10min，弃去上清液。加入20mg/mL of溶菌酶缓冲液(20mmol/LTris-HCl,pH8.0,2mmol/L EDTA and1.2%Triton X-100)于37℃水浴中处理30min。按照试剂盒的说明进行提取，最后用100μL洗脱液溶解提取的样品。采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行样品检测或者置于-20℃保存、备用。
实时PCR扩增
1、实时荧光PCR反应体系建立
以取制备好的样品总DNA为模板，同时，以含有A.acidoterrestris总DNA的样品为阳性对照，以无菌超纯水为阴性对照，分别进行如下实时荧光PCR反应：每个样品的PCR反应检测均在无菌八联管中进行，反应体系总体积25μL，主要包含：12.5μL2×Premix Ex Taq,8.5μL无菌超纯水（灭酶），0.5μL上游引物FP(10μM),0.5μL下游引物RP(10μM),1.0μL探针LP(10μM)，然后分别加入2.0μL的待测样品DNA，阳性样品DNA和无菌超纯水阴性对照。其中，Premix Ex Taq购自takara-宝生物工程(大连)有限公司。
2、实时荧光PCR反应
样品检测使用的是美国伯乐公司iCycleriQ5荧光定量PCR仪，反应条件为：第一个循环为95℃10min；随后40个循环，95℃15s，60℃1min。每个循环结束后采集数据，根据荧光强度变化判断样品检测结果。样品检测的Ct值小于40判定为阳性样品，Ct值大于40或者没有扩增曲线，则判定为阴性样品。
实施例2：
特异性实验
采用本发明方法中引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3建立的实时荧光PCR检测体系对如表1所示的菌株进行检测，评价本发明中引物、探针及实时荧光PCR检测体系的特异性。
将表1所示的30个菌株分别在最佳条件下培养，并用无菌超纯水调整其浓度为104-105CFU/mL。将5mL制备好菌体稀释液样品置于离心管中，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心10min，弃去上清液。加入20mg/mL of溶菌酶缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,2mmol/L EDTA and1.2%Triton X-100)于37℃水浴中处理30min。按照试剂盒的说明进行提取，最后用100μL洗脱液溶解提取的样品。采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，按照上述方法进行样品的PCR扩增检测，如图2所示。
本发明方法中引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3建立的实时荧光PCR检测体系对于9株A.acidoterrestris(DSM-2498,DSM-3922,DSM-3923,DSM-3924,AAT-12,AAT-13,AAT-96,C-16and C-18)的检测准确率为100%；对于A.acidocaldarius(DSM-446,DSM-448,DSM-449和DSM-451),A.acidiphilus(DSM-14558),A.contaminans(DSM-17975,YL-5),A.fastidiosus(DSM-17978),A.pomorum(DSM-14955),A.cycloheptanicus(DSM-4006),A.herbarius(DSM-13609),A.hesperidum(DSM-12489),A.sendaiensis(DSM-17614),B.subtilis(DSM-10,YL-3),B.brevis(DSM-30),B.ginsengihumi(DSM-18134,LC-8,BS-2),B.licheniformis(DSM-13),B.megaterium(DSM-32)等21个菌株的扩增曲线均在临界值以下，说明检测中存在引物或者探针不匹配，PCR扩增表现为阴性结果。
说明本发明中引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3建立的实时荧光PCR检测体系对于A.acidoterrestris检测特异性强。采用本发明建立的PCR体系可以实现A.acidoterrestris的快速检测。
实施例3：
灵敏度实验
取10mL A.acidoterrestris标准菌株的增殖培养液（3×107CFU/mL），用无菌超纯水进行10倍稀释，其浓度分别为：3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL、3×102CFU/mL、3×101CFU/mL、3×100CFU/mL。将5mL制备好菌体稀释液样品置于离心管中，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心10min，弃去上清液。加入20mg/mL of溶菌酶缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,2mmol/L EDTA and1.2%Triton X-100)于37℃水浴中处理30min。按照试剂盒的说明进行提取，最后用100μL洗脱液溶解提取的样品。采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行按照上述方法进行样品的PCR扩增检测。同时，根据样品浓度与Ct值之间的关系，绘制标准曲线，计算相关系数（R2），斜率（S）和PCR扩增效率（E）。不同浓度菌体的PCR扩增曲线和标准曲线分别如图3（a）和图3（b）所示。
本发明方法对A.acidoterrestris的最低检测限是3×101CFU/mL；同时，根据样品浓度与Ct绘制获得标准曲线的R2=0.998，斜率S=-3.055，PCR扩增效率E=112.5%。
结果表明：采用本发明方法中引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQID NO.3建立的实时荧光PCR检测体系对A.acidoterrestris检测的具有非常高的灵敏度和扩增效率，检测效果好。
Claims (10)
1.一种酸土脂环酸芽孢杆菌检测用引物，其特征在于，该引物的上游引物序列SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGAGT AACAC GTGGG CAATC TG-3’；
SEQ ID NO.2：5’-CTACC CGTGT ATTAT CCGGC AT-3’。
2.与权利要求1所述的引物配合使用的探针，其特征在于，该探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5’-CTTTCAGACTGGAATAAC-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有6-carboxyfluorescein荧光染料，3’端标记有Minor Groove Binder荧光染料。
4.一种酸土脂环酸芽孢杆菌的检测方法，其特征在于，该方法以样品总DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的下游引物以及核苷酸序列为SEQ ID NO.3的探针进行实时荧光定量PCR检测，每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定酸土脂环酸芽孢杆菌的存在。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应过程中的退火温度为60℃。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应条件是在反应体系中加入无菌超纯水、2×Premix ExTaq、上游引物、下游引物、探针和总DNA。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应条件是25μL反应体系由12.5μL2×Premix Ex Taq，0.5μL10μM上游引物，0.5μL10μM下游引物，1.0μL10μM探针，2.0μL总模板和8.5μL无菌超纯水组成。
8.如权利要求4-7任一权利要求所述的方法，其特征在于，荧光PCR反应的反应条件为：第一个循环为95℃，10min；之后40个循环，95℃，15s、60℃，1min。
9.一种用于检测酸土脂环酸芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含了引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的探针。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310603130.XA CN103614470B (zh) | 2013-11-21 | 2013-11-21 | 酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310603130.XA CN103614470B (zh) | 2013-11-21 | 2013-11-21 | 酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103614470A true CN103614470A (zh) | 2014-03-05 |
| CN103614470B CN103614470B (zh) | 2015-04-08 |
Family
ID=50165185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310603130.XA Active CN103614470B (zh) | 2013-11-21 | 2013-11-21 | 酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103614470B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182570A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-11 | 沈阳出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1576376A (zh) * | 2000-03-14 | 2005-02-09 | 大塚制药株式会社 | 酸土脂环酸菌的核酸引物及鉴定酸土脂环酸菌的方法 |
-
2013
- 2013-11-21 CN CN201310603130.XA patent/CN103614470B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1576376A (zh) * | 2000-03-14 | 2005-02-09 | 大塚制药株式会社 | 酸土脂环酸菌的核酸引物及鉴定酸土脂环酸菌的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHRISTOPHER J. CONNOR等: "Development of a real-time PCR-based system targeting the 16S rRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY》 * |
| K. YAMAZAKI等: "Specific primers for detection of Alicyclobacilhs acidoterrestris by RT-PCR", 《LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182570A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-11 | 沈阳出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103614470B (zh) | 2015-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110964788B (zh) | 阪崎克罗诺杆菌的快速恒温检测方法、引物组及应用 | |
| CN111321234B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用 | |
| CN110079617A (zh) | 以rRNA为标的的微生物定量分析方法 | |
| Yuan et al. | Development of the saltatory rolling circle amplification assay for rapid and visual detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice | |
| CN113817854B (zh) | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 | |
| CN101555522A (zh) | 用于荧光定量pcr法检测肠道白色念珠菌的试剂盒 | |
| CN111485028A (zh) | 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒 | |
| CN107058511A (zh) | 一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法 | |
| CN102268478A (zh) | 检测空肠弯曲菌的引物、探针及方法和试剂盒 | |
| CN102344953B (zh) | 用于样品中桃源性成分检测的引物及方法和试剂盒 | |
| CN117568497A (zh) | 一种基于RPA-Cas12a的检测食源性致病菌的方法 | |
| Hu et al. | Research on nanogold-assisted HRM-qPCR technology for highly sensitive and accurate detection of Vibrio parahaemolyticus | |
| CN104513857A (zh) | 副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 | |
| CN102344951B (zh) | 用于样品中梨源性成分检测的引物及方法和试剂盒 | |
| CN103614470B (zh) | 酸土脂环酸芽孢杆菌pcr检测用引物、探针及应用 | |
| CN110734988A (zh) | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）核酸恒温扩增方法 | |
| CN101089195A (zh) | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 | |
| WO2025001365A1 (zh) | 一种用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的rpa引物对及其应用 | |
| CN103205485A (zh) | 一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针 | |
| CN101086021B (zh) | 用于检测硫酸盐还原菌的引物 | |
| CN106916903A (zh) | 结核分枝杆菌85B mRNA的实时荧光RT‑PCR检测方法及试剂盒 | |
| CN105154523A (zh) | 用于果汁中脂环酸芽孢杆菌pcr检测的引物及其应用 | |
| CN108004334B (zh) | 检测饮用水中四种致病菌的四重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法 | |
| CN103571942B (zh) | 一种副溶血弧菌vp核酸恒温扩增方法 | |
| CN107287315B (zh) | 用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |