CN103614409B - 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建。采用的技术方案是：(1)PCR扩增GST标签蛋白序列、SacR调控序列以及目的蛋白序列；(2)PCR产物与载体pHY300-PLK连接，构建重组质粒；(3)重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB600，蔗糖诱导蛋白表达，得到融合蛋白。本发明通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实未加蔗糖诱导之前，仅有极低的痕量融合蛋白表达，诱导后32小时得到高效表达的融合蛋白，该融合蛋白通过对目的蛋白的抑菌效果检测以及针对GST标签蛋白的Western-Blot检测实验确定两种蛋白正确融合与表达。

Description

一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建

技术领域

本发明涉及大肠-枯草穿梭诱导载体的构建和转化及表达。

背景技术

近些年来，枯草芽孢杆菌基因组的成功测序催化了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白分泌载体的研究，成绩斐然。基于全基因组的测定，使得通过信号肽预测软件经生物信息学分析识别信号肽并确认分泌蛋白成为可能。结合信号肽预测结果以及已知的分泌蛋白基因结构，将有可能构建一个新的分泌蛋白组(Secretome)，其中包含各种已知的及未知的分泌蛋白信息。通过此种方法，预测得到的枯草芽孢杆菌蛋白质组中已含有4107种蛋白，即占总蛋白25%的蛋白序列含有膜定位信号。

枯草芽孢杆菌表达系统的优点是：（1）能将蛋白表达产物高效分泌培养基中，在多数情况下，经芽孢杆菌分泌后真核生物的异源重组蛋白就是经过简单折叠的天然构并且具备原有的生物活性；（2）许多芽孢杆菌在传统发酵工业中已经有几十年的历史，它们无致病性而且不产生内毒素；（3）芽孢杆菌的分子遗传背景清楚，生长迅速，培养条件简单。但是由于膜定位能力的缺乏、转移前折叠、转移折叠缓慢、低效转移以及错误折叠和蛋白酶水解等因素，外源蛋白的表达进展受限。

外源蛋白的高效表达对于真核蛋白对枯草杆菌表达系统来说并不理想，主要的影响因素是外源蛋白与枯草杆菌的分泌元件不协调。为了达到高表达水平和更广的表达范围的目的，须对其分泌机制进行完整且深入的研究，并通过基因工程等手段加以解决。这方面已有成功的报告，如吴青等构建的枯草杆菌诱导型高效-表达分泌系统，在原有诱导系统上添加正调控基因degU及degQ，获得了296倍表达的调控基因sacB，并使地衣杆菌α-淀粉酶的表达量达到原有的140倍。

枯草芽孢杆菌所承载的质粒的结构和分离上的不稳定性直接影响该表达系统在工业生产中的应用，在大规模生产中，质粒容易发生丢失或结构改变的情况，对目的蛋白的产率造成影响。为了解决这一问题，目前的研究方向集中于：①添加多个正调控基因并使用诱导系统调控外源蛋白的表达；②采取整合表达的方式，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体，以保证质粒的稳定性。

发明内容

本发明目的在于构建一种使用无毒物质进行诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，通过该载体进行蛋白的表达。

1、穿梭质粒的构建

根据上述目的及载体的克隆位点，利用引物设计软件Primer Premier5设计引物，扩增调控序列SacR、标签蛋白GST序列以及目的蛋白序列，连接为重组序列后连入pHY300-PLK空载体，构建重组质粒，重组质粒转化入枯草芽孢杆菌WB600后提取质粒进行双酶切鉴定并对载体进行测序验证。

2、目的蛋白的表达

使用枯草芽孢杆菌WB600进行蛋白表达检测，得到融合蛋白。通过SDS-PAGE进行初步验证并获得最优表达时间，对表达产物进行目的蛋白的抑菌效果和GST标签蛋白的Western-Blot验证，证实该载体能够正确表达融合蛋白。

本发明采用的技术方案是：一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，方法如下：

1）SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和NdeI酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；

所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；

所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；

2）制备GST标签蛋白序列；

3）获得目的蛋白序列；

4）各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经该酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒pHY300-PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切后连接，得到重组质粒；

5）重组质粒的转化：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；

6）目的蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达：选取5）步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡3h，12000rpm离心10min后取上清 液，上清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，12000rpm离心10min，取上清液。

本发明中，步骤1）中所述的SacR序列对其后的蛋白表达起到受诱导的调控作用，可控制蛋白是否表达，在表达后自动切断与后续蛋白的连接；步骤2）中所述的GST标签蛋白序列与目的蛋白序列中间以肠激酶酶切位点连接，在动物肠道中可以自行切割，标签蛋白在方便纯化的同时可以起到催化亲核性的谷胱甘肽与各种亲电子性的外源化学物质的结合，从而阻止它们与细胞生物大分子重要成分的共价结合，起到解毒作用。

本发明的有益效果是：蔗糖诱导系统归属于枯草芽孢杆菌Tat（twin-arginine translocation）分泌途径，与另一分泌途径Sec（Secratory-type）不同，突破了Sec途径中不能转移在细胞质中折叠完的蛋白以及外源蛋白转移至膜外折叠缓慢易被降解的瓶颈。通过蔗糖果聚糖酶（Levansucrase）的启动子-信号肽序列（SacB p.s.,SacR）的调控和引导，可以使外源蛋白受控表达并分泌至胞外。本发明通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实在添加诱导剂蔗糖之前，只有极低的痕量融合蛋白得以表达，蔗糖诱导32小时候得到最高产量的融合蛋白。经抑菌对比试验证实目的蛋白的抑菌效果良好。

附图说明

图1质粒pHY300-PLK结构图。

图2琼脂糖凝胶电泳鉴定调控序列SacR的PCR结果。

图3琼脂糖凝胶电泳鉴定标签蛋白序列GST的PCR结果。

图4琼脂糖凝胶电泳鉴定检测AWRK6序列的PCR结果。

图5琼脂糖凝胶电泳鉴定元件拼接的PCR结果。

图6琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHY300-PLK Hind III单酶切结果。

图7琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHYSGA Hind III/Xba I双酶切结果。

图8 SacR序列pcr产物测序部分结果。

图9 GST标签序列pcr产物测序部分结果。

图10 AWRK6序列测序部分结果。

图11 SGA序列连接产物测序部分结果。

图12琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子PCR验证。

图13琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果。

图14 SDS-PAGE鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。

其中，M：Premixed Protein Marker(Broad)；1：诱导前上清；2：诱导后8h上清；3：诱导后16h上清；4：诱导后24h上清；5：诱导后32h上清；6：诱导后40h上清；7：诱导后48h上清；8：菌体。

图15 Western-Blot鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。

1：未诱导；2：诱导8h上清；3：诱导16h上清；4：诱导24h上清；5：诱导32h上清；6：诱导40h上清；7：诱导48h上清；8：菌体。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验手册》》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下面实施例中蛋白质的表达以抗菌肽AWRK6为例，但是并不限制本发明，任何想要表达的目的蛋白都可以按照下述方法实现。

实施例1大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建

1.SacR调控序列的制备

(1)枯草芽孢杆菌基因组提取

以接种环沾取少量冻存的枯草芽孢杆菌WB600，于20mL固体LB培养基上划线，37℃过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基，37℃、220rpm震荡2h，分装保留5mL种子液，其余全部加入95mL液体LB培养基中，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。依照说明书使用Axygen细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取枯草芽孢杆菌WB600的基因组。

(2)以WB600基因组为模板PCR获得SacB启动子和信号肽序列

根据NCBI公布的SacB序列：

1   GATCCTTTTT AACCCATCAC ATATACCTGC CGTTCACTAT TATTTAGTGA AATGAGATAT 

61  TATGATATTT TCTGAATTGT GATTAAAAAG GCAACTTTAT GCCCATGCAA CAGAAACTAT 

121 AAAAAATACA GAGAATGAAA AGAAACAGAT AGATTTTTTA GTTCTTTAGG CCCGTAGTCT 

181 GCAAATCCTT TTATGATTTT CTATCAAACA AAAGAGGAAA ATAGACCAGTCCAA

241 ACGAGAGTCT AATAGAATGA GGTCGAAAAG TAAATCGCGC GGGTTTGTTA CTG

301 CAAGACC TAAAATGTGT AAAGGGCAAA GTGTATACTT TGGCGTCACC CCTTACATAT 

361 TTTAGGTCTT TTTTTATTGT GCGTAACTAA CTTGCCATCT TCAAACAGGA GGGCTGGAAG 

421 AAGCAGACCG CTAACACAGT ACATAAAAAA GGAGACATGA ACGATGAACA TCAAAAAGTT

481 TGCAAAACAA GCAACAGTAT TAACCTTTAC TACCGCACTG CTGGCAGGAG GCGCAACTCA

541 AGCGTTTGCG AAAGAAACGA ACCAAAAGCC ATATAAGGAA ACATACGGCA TTTCCCATAT 

序列中以框线表示启动子元件，阴影表示核糖体结合位点（RBS），下划线指示的是蔗糖果聚糖酶的信号肽序列。以上述序列为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I，Nde I酶切位点，引物序列见表1：

表1

以在(1)中得到的枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板，建立以下PCR体系：

PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃40s，共30循环后结束反应，获得SacR调控序列。Axygen PCR Cleanup Kit清洁反应产物并测序。SacR调控序列PCR扩增 的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图2所示，由图2可见片段大小符合NCBI数据库描述。SacR序列pcr产物测序结果如图8所示，从图8可见，测序结果与目的序列完全符合。

2.GST标签蛋白序列的制备

以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌BL21-GEX，于20mLAmpicillin浓度50μg/mL的固体LB培养基上划线，37℃过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mLAmpicillin浓度50μg/mL液体LB培养基，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。依照说明书使用Axygen质粒小量制备试剂盒提取质粒pGEX-4T-2，以其为模板进行PCR，体系如下

PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃50s，共30循环后结束反应，获得GST标签蛋白序列。Axygen PCR Cleanup Kit清洁反应产物并测序。标签蛋白GST序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图3所示，由图3可见片段大小符合NCBI数据库描述。GST标签序列pcr产物测序结果如图9所示，从图9可见测序结果与目的序列完全符合。

3.AWRK6序列的制备 

根据已知的AWRK6序列（SWVGKHGKKFGLKKHKKH），设计6条长引物pA1-pA6（引物pA1-pA6的序列见表1）进行PCR，获得AWRK6序列。扩增后通过Axygen PCR Cleanup Kit清洁反应产物并测序。AWRK6序列的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图4所示，从图4可见片段大小符合预期。AWRK6序列pcr产物测序结果如图10所示，从图10可见测序结果与目的序列完全符合。

4.各元件的连接以及与载体的连接

依据Takara DNA Ligation Kit Ver.2.1说明，连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，将GST片段去磷酸化后加入下列反应体系：

16℃处理30min后将产物SG序列清洁回收，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick CutVsp I酶酶切的AWRK6序列片段进行连接，体系如下

16℃处理30min后得到重组序列SGA，以SGA片段为模板，SacR上游引物PS1及AWRK6下游引物PA6为模板，扩增SGA序列，反应体系如下：

PCR条件：采用三步法，98℃10s，55℃15s，72℃90s，共30循环后结束反应，获得重组序列SGA。Axygen PCR Cleanup Kit清洁反应产物并测序。SGA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图5所示，从图5可见片段大小符合预期。SGA序列连接产物测序结果如图11所示，从图11可见，测序结果与目的序列完全符合。

以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌JM109-HY，于20mLAmpicillin及Tetracycline浓度50μg/mL的固体LB培养基上划线，37℃过夜培养。次日挑取单菌落接种于10mL同样抗生素浓度的液体LB培养基，37℃、180rpm震荡4h至OD600nm≈1.2。依照说明书使用Axygen质粒小量制备试剂盒提取质粒pHY300-PLK。质粒pHY300-PLK Hind III单酶切结果的琼脂糖 凝胶电泳鉴定如图6所示，从图6可见片段大小符合预期。

将经过Quick Cut Hind III单酶切并切胶回收的pHY300-PLK质粒片段与测序后的SGA片段分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切的片段使用In-Fusion HD Cloning Kit进行克隆连接。体系如下：

反应条件50℃15min，获得重组质粒pHYSGA。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒pHYSGAHind III/Xba I双酶切结果如图7所示，从图7可见片段大小符合预期。

5.质粒的转化 

(1)取冻存的枯草芽孢杆菌WB600菌种于添加10μL chloromycetin的20mLLB固体培养基上划线，37℃过夜培养。

(2)挑取单菌落在含有25μg/mL chloromycetin的5mLLB液体培养基中进行活化。37℃、180rpm培养4h后挑取活化菌种一环接入内含5mLGM1培养基的试管，37℃、200rpm过夜培养。

(3)取500μL过夜培养的菌液转接入5mL新的GM1培养基中，37℃、200rpm培养3h，此时菌体生长达到对数期末期。取0.75mL以GM1培养的菌液接入装有5mLGM2培养基的试管，37℃、125pm培养1.5h，5000rpm离心10min收集菌体并用mL元培养液上清轻轻悬浮菌体，得到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，预留待用细胞后加30%灭菌甘油至终浓度10%，混匀后每0.5mL菌液分装一管，-70℃冻存备用。

(4)将5μL含有80ng/μL重组质粒pHYSGA的溶液与1mLWB600感受态细胞轻轻震荡混匀，37℃、120rpm培养0.5h，提高震荡速度至200rpm继续培养1.5h，吸取100μL菌液涂布于含有50ug/mL Tetracycline的固体LB培养基上37℃培养过夜。

(5)转化子验证 

以接菌环挑取少量转化子菌体稀释于0.04mL无菌水，沸水浴5min后置于-20℃冰箱中静置5min，于室温溶解后12000rpm离心2min，取1μL上清液为模板，使用引物pS1、pA6 为引物进行PCR验证。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子PCR验证结果如图12所示，从图12可见片段大小与预期SGA片段一致。琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果如图13所示，从图13可见双酶切获得的两条片段大小符合预期。

6.AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达及检测

(1)诱导表达

选取阳性转化子接种于5mL含有50ug/mL Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm活化2h，之后以1%量接种于100mL含50ug/mL Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡3h，取样并12000rpm离心10min后，留少量上清及菌体用于检测，其余通过旋涡混合器重悬并用相同的LB补全体积，而后加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，并于诱导8h、16h、24h、32h、40h、48h时分别取样，12000rpm离心10min，再分别保存上清和菌体。

(2)诱导结果SDS-PAGE检测

取诱导表达前后不同时间段的菌液以及未诱导菌体各10μL，加入等体积2×上样缓冲液混匀，沸水浴5min，冷却至室温吸取10μL上样。电泳仪设置80V待条带进入分离胶后调高至100V电泳1.5h，至指示条带电泳至高于分离胶下沿1cm时终止电泳。将胶置于考马斯亮蓝R250染色液中染色0.5h，脱色至条带清晰并观察。抗菌肽AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果如图14所示，从图14可见，在32h的发酵液中AWRK6的条带最显著，说明此刻浓度最高，为最优表达时间。未诱导的菌液中有微量AWRK6存在，为痕量表达。菌体中有相应条带存在，为尚未分泌到菌液中的抗菌肽AWRK6。

(3)诱导结果Western Blot鉴定

依(2)步骤使用预染蛋白质分子质量标准Prestained Protein Molecular Weight Marker进行SDS-PAGE进行电泳，取消染色步骤。将0.22um孔径的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride）放在去离子水中，毛细作用去除气泡，在转移缓冲液中平衡15分钟。采用半干法进行转膜，以1V/cm²膜的条件转膜2h。取出膜后以PBST漂洗，封闭液于室温轻摇1h。将膜用滤纸铁脚喜感，正面朝下置于一抗稀释液中，4℃静置过夜。而后勇PBST浸洗3次，每次10min。取出膜后正面向下置于二抗稀释液中室温轻摇1h。再次使用PBST漂洗后浸洗3次，每次10min。

依据辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法，混合发光液A、B备用。将膜用去离子水漂洗并吸干后加上发光混合液覆盖，熄灯至可见绿色荧光后吸干并与暗盒中盖加胶片曝光。曝光15s 后立即放入显影液中1min，去离子清洗，置于定影液中并再次清洗晾干。AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达的Western-Blot鉴定结果如图15所示，从图15可见，在诱导后标签蛋白GST及抗菌肽AWRK6得以成功表达，而未诱导的菌液中只有痕量存在，说明诱导调控系统有效控制了蛋白的表达，避免了对宿主菌有杀伤作用的蛋白的毒害，同时能够使得在菌体最优生长阶段表达蛋白成为可能，从而获得较高蛋白表达量。

Claims (1)

1.一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于方法如下：

1)SacR调控序列的制备：提取枯草芽孢杆菌WB600基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板，设计上下游引物pS1及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；

所述的上游引物pS1的序列为GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC；

所述的下游引物pS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG；

2)制备GST标签蛋白序列；以接种环沾取少量冻存的大肠杆菌BL21-GEX，使用Axygen质粒小量制备试剂盒提取质粒pGEX-4T-2，以其为模板，以pG1和pG2为引物，进行

PCR扩增，获得GST标签蛋白序列；

所述的引物pG1的序列为CGCGAATTCCATATGATGTCCCCTATACTAG；

所述的引物pG2的序列为TCTGCATTAATCGATGCGGCCGCTCGAGT；

3)获得目的蛋白AWRK6序列；根据AWRK6序列，设计6条长引物pA1-pA6进行PCR扩增，获得AWRK6序列；

所述的AWRK6序列是SWVGKHGKKFGLKKHKKH；

所述的引物pA1序列是TATTACCATTAATATGACGACGACGACAAGA；

所述的引物pA2序列是GCTTGCCCACCCAGCTCTTGTCGTCGTCGT；

所述的引物pA3序列是GCTGGGTGGGCAAGCATGGCAAGAAGTTTG；

所述的引物pA4序列是TATGTTTCTTCAGGCCAAACTTCTTGCCAT；

所述的引物pA5序列是GCCTGAAGAAACATAAGAAACATTGACTGA；

所述的引物pA6序列是TGCCCAAGCTTTCTTTGTATTCTTTGTAAC；

4)各元件的连接以及与载体的连接：连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick Cut Vsp I酶酶切的目的蛋白AWRK6序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒pHY300-PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切后连接，得到重组质粒；

5)重组质粒的转化：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；

6)目的蛋白AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达：选取5)步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、200rpm活化2h，之后以1％接种量接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡3h，12000rpm离心10min后取上清液，上清液中加入20％蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2％，持续诱导48h，12000rpm离心10min，取上清，得融合多肽。