CN103602695B - Gm-csf和mart-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接GM-CSF基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。

Description

GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

黑色素瘤（Melanoma），又称恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM），是来源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发生于皮肤体表，亦可见于脉络膜、软脑膜及消化道等，其恶性程度高，是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。近年来，黑色素瘤的发病率及相应的死亡率在迅速增长，且发病年龄愈来愈早，严重威胁着人类的健康。

黑色素瘤的传统治疗，是包括手术、化疗、免疫治疗等在内的综合治疗。目前唯一有效的治疗方法是在肿瘤厚度小于1毫米时通过手术切除肿瘤，但由于黑色素瘤的高度侵袭转移性和对多种化疗药物的耐药性，导致其疗效不佳以及预后不良。针对肿瘤患者普遍存在免疫力低下的情况，通过免疫治疗来诱导机体的特异性抗肿瘤免疫反应，以抑制肿瘤的生长、转移及复发。近年来，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。其中，基因疫苗是通过特定载体将具有治疗作用的基因导入细胞的治疗方法；然而，基因治疗只能短时间提高某种基因对应蛋白表达水平，其疗效持续时间短，缺乏长期抗肿瘤能力。

肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，因而不能被T细胞识别，无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，不仅需要肿瘤相关抗原的表达和呈递，还需要增强共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。

粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在T细胞免疫反应中起关键作用的DC细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进DC等APC分化、成熟和活化以及上调协同刺激分子（如CD86）的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和ADCC效应等活性，促进Th、Tc、NK细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。GM-CSF目前已被广泛应用于肿瘤的免疫治疗，GM-CSF以其显著的免疫调节作用和低毒性，成为肿瘤疫苗重要的免疫佐剂，GM-CSF还可作为化疗的辅助用药，提升肿瘤患者外周血白细胞水平（主要为粒细胞与单核细胞数量）的同时，诱导机体的免疫系统活化，加强对肿瘤的免疫；除上述生物学效应外，GM-CSF还能增加肿瘤基质分泌血管生成抑制素，抑制肿瘤的血管生成和转移；转染GM-CSF基因的肿瘤疫苗在黑色素瘤的免疫治疗研究中取得了显著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治疗方法只是局部地提高机体的GM-CSF蛋白表达水平，其免疫调节作用、抗肿瘤能力较小，而且缺乏免疫治疗的靶向性。

MART-1（人黑色素瘤分化抗原）是黑素瘤分化的相关抗原，其参与黑素小体成熟，表达于黑素瘤和黑素瘤细胞系，在多数类固醇肿瘤（包括肾上腺皮质肿瘤）、黑色素细胞病变以及血管周细胞瘤中表达。MART-1有较强的免疫原性，易于被细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别，产生有效的抗肿瘤免疫应答，被认为是黑素瘤免疫治疗的最佳候选者。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，该重组载体可用于黑色素瘤的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对黑色素瘤产生特异性抗肿瘤效应。

本发明的另一个目的是，提供所述GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法。

本发明的再一个目的是，提供所述GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体在黑色素瘤免疫治疗中的应用。

GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

在其中一个实施例中，所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。

在其中一个实施例中，所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。

本发明所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：

1）获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段；

2）将步骤1）得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段连接于载体，构建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重组载体；

3）获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段；

4）将步骤3）得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段连接于步骤2）得到的重组载体，构建所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体。

在其中一个实施例中，所述的pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体的制备方法，包括以下步骤：

A）获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamH I酶切位点的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

B）构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体：用限制性内切酶EcoR I、BamH I分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤A）得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体；

C）获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

D）构建pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤B）得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体，将步骤C）得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体。

在其中一个实施例中，步骤A）所述的GM-CSF特异性引物为：

GM-CSF上游引物：5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，

GM-CSF下游引物：5’-TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’。

在其中一个实施例中，步骤C）所述的MART-1特异性引物包括MART-1第一引物对和MART-1第二引物对，所述的MART-1第一引物对由MART-1上游长引物和MART-1下游长引物组成，所述的MART-1第二引物对由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物组成：

MART-1第一引物对为：

MART-1上游长引物：5'-AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3'，

MART-1下游长引物：5'-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3'；

MART-1第二引物对为：

MART-1上游短引物：5'-ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3'，

MART-1下游短引物：5'-GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3'。

在其中一个实施例中，所述的pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体的制备方法，包括以下步骤：

a）获得含有特异性酶切位点的MART-1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位点序列的MART-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位点的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；

b）构建pIRES2-MART-1-EGFP重组载体：用限制性内切酶Xho I、EcoR II分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤a）得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MART-1-EGFP重组载体；

c）获得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一种GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

d）构建pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤b）得到的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体，将步骤c）得到的GM-CSF基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体。

在其中一个实施例中，步骤a）所述的MART-1特异性引物为：

MART-1上游引物：5’-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’，

MART-1下游引物：5’-CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’。

在其中一个实施例中，步骤c）所述的GM-CSF特异性引物包括GM-CSF第一引物对和GM-CSF第二引物对，所述的GM-CSF第一引物对由GM-CSF上游长引物和GM-CSF下游长引物组成，所述的GM-CSF第二引物对由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物组成：

GM-CSF第一引物对为：

GM-CSF上游长引物：5'-AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游长引物：5'-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'；

GM-CSF第二引物对为：

GM-CSF上游短引物：5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游短引物：5'-GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'。

本发明所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体在黑色素瘤基因免疫治疗中的应用。

在其中一个实施例中，将所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体转染黑色素瘤患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，进行黑色素瘤基因免疫治疗。

本发明所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接GM-CSF基因和MART-1基因，能够在同一载体中同时表达人黑色素瘤分化抗原（MART-1）以及粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），可减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源基因序列的引入。其中，MART-1是肿瘤靶向性的相关抗原，GM-CSF是发挥免疫调节作用的细胞因子，两者联合使用，既可以发挥细胞因子的的免疫调节作用，又可以靶向性地产生特异性的抗肿瘤效应，从而能够获得更好的黑色素瘤免疫治疗效果。将双基因共表达重组载体转染黑色素瘤患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，MART-1的大量表达，可刺激树突状细胞递呈MART-1多肽与MHC复合物，而刺激机体免疫系统，产生特异性杀伤性T细胞，靶向性地杀伤表达MART-1多肽的肿瘤细胞；而GM-CSF的大量表达，能进一步增强主要和次要的抗体反应，还能诱导DC细胞成熟、分化，促进T细胞免疫反应，一方面增强机体免疫调节能力，另一方面作为免疫佐剂，协同扩大抗肿瘤免疫效应。

IRES序列是来源于某些病毒和细胞mRNA5’端的一段非翻译区，可以不依赖帽的方式启动远端的mRNA翻译，可在上游启动子的控制下和与之相连的基因共同转录，在同一转录本上翻译出不同的蛋白。IRES连接多基因进行共表达时，多个基因的mRNA在同一条转录子上，但转录后的翻译过程相互独立，上游基因以传统方式进行翻译，下游基因依靠IRES序列以不依赖帽的方式进行翻译，保证了各个基因的独立结构及功能。利用IRES代替内部启动子，不但可使多基因共表达载体大大缩小，而且还克服了传统多基因表达载体中启动子之间的相互抑制现象，避免融合蛋白的产生。

附图说明

图1为实施例一所得的含有特异性酶切位点序列的GM-CSF基因片段的电泳图，其中，1为GM-CSF基因，M为标记；

图2为pIRES2-EGFP质粒图谱；

图3为实施例二所得的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体图谱；

图4为实施例二所得的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体的PCR鉴定电泳图，其中，1为PCR反应产物，M为标记；

图5为实施例二所得的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，1为酶切反应产物，M为标记；

图6为实施例三所得的带有限制性内切酶粘性末端的MART-1基因片段的电泳图，其中，1为PCR扩增产物A，2为PCR扩增产物B，M为标记；

图7为实施例三所述的杂交PCR反应的流程图；

图8为实施例四所得的pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体图谱；

图9为实施例四所得的pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，1为EcoR I/BamH I双酶切反应产物，2为BamH I/Not I双酶切反应产物，3为EcoR I/Not I双酶切反应产物，M为标记；

图10为实施例五所得的含有特异性酶切位点序列的MART-1基因片段的电泳图，其中，1为MART-1基因，M为标记；

图11为实施例六所得的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体图谱；

图12为实施例六所得的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体的PCR鉴定电泳图，其中，1为PCR反应产物，M为标记；

图13为实施例六所得的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，1为酶切反应产物，M为标记；

图14为实施例七所得的带有限制性内切酶粘性末端的GM-CSF基因片段的电泳图，其中，1为PCR扩增产物C，2为PCR扩增产物D，M为标记；

图15为实施例七所述的杂交PCR反应的流程图；

图16为实施例八所得的pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体图谱；

图17为实施例八所得的pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，1为Xho I/EcoR I双酶切反应产物，2为EcoR I/Not I双酶切反应产物，3为Xho I/Not I双酶切反应产物，M为标记。

具体实施方式

下述实施例中，所用到的实验技术，例如PCR技术、引物设计技术、载体构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中的常规技术，本领域技术人员可根据现有技术实现（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，科学出版社第三版；或者按照产品说明书进行）。在操作过程中所用到的设备、试剂、载体、菌株等，均为通过市场购买得到的常规产品。

实施例一：获取含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段

1、引物设计

根据GM-CSF基因的核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:1所示）和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计特异性引物如下：

GM-CSF上游引物（如序列表中SEQ ID NO:4所示）：

5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’（下划线部分为EcoR I酶切位点序列），

GM-CSF下游引物（如序列表中SEQ ID NO:5所示）：

5’-TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’（下划线部分为BamH I酶切位点序列）。

2、获取cDNA模板

TRIzon法从CIK细胞（Cytokine-Induced Killer，细胞因子诱导的杀伤细胞）或者人外周血分离的单个核细胞中，提取RNA（TRIzon总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0580），并反转录成cDNA（反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为RR019A）。

3、获取含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段

以所得到的cDNA为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，通过PCR反应获得GM-CSF基因片段，其上游含有EcoR I酶切位点序列，下游含有BamH I酶切位点序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图1所示。

PCR反应体系如下（50μL）：

其中，2×Prime STAR Max DNA Polymerase为DNA聚合酶-缓冲液复合物，购自宝生物（大连）有限公司，产品编号为R045A。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

实施例二：pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体的构建

使用限制性内切酶EcoR I和BamH I，分别酶切pIRES2-EGFP质粒（该质粒的多克隆位点处含有EcoR I、BamH I酶切位点）以及实施例一所得的GM-CSF基因片段，得到酶切后线性化的pIRES2-EGFP载体以及酶切后的GM-CSF基因序列；采用T4DNA连接酶体系进行连接反应，在22℃下孵育30分钟，然后在70℃下灭活5分钟，构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体（如图3所示）。

由pIRES2-EGFP质粒的结构特点（如图2所示）可知，GM-CSF基因插入pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点后，位于质粒载体的自身序列IRES的上游（如图3所示），即在同一启动子启动下的GM-CSF和EGFP序列分别表达。

1、双酶切pIRES2-EGFP质粒

酶切反应体系如下（50μL）：

其中，内切酶EcoR I与10×K Buffer为EcoR I内切酶缓冲液体系，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1040A；内切酶BamH I与10×K Buffer为BamH I内切酶缓冲液体系，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1094A。

酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

2、双酶切GM-CSF基因片段

酶切反应体系如下（50μL）：

酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

3、连接GM-CSF基因片段和pIRES2-EGFP载体，构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体

连接反应体系如下（20μL）：

其中，T4DNA连接酶及10×Ligation Buffer为DNA连接酶缓冲液体系，购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0805。

连接反应条件：22℃孵育30分钟，70℃灭活5分钟。

4、pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体的鉴定

在200μL感受态细胞JM109中（1～2×10⁹Bacteria/ml），加入20μL上述连接反应产物，置于冰上冷却30min后，置于42℃水浴锅中热击90s，再置于冰上冷却2min，然后加入LB液体培养基780ul；在37℃条件下，于150转/分钟的摇床上复苏培养60min，将复苏过的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃下倒置培养16～18小时；挑取阳性菌落至卡那霉素抗性LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养12～16小时。

取阳性菌落菌液，进行菌液PCR初步鉴定，PCR鉴定反应体系如下（20μL）：

其中，2×Power Taq PCR Master Mix为DNA聚合酶-酶缓冲液dNTPs复合物，购自百泰克（北京）生物技术有限公司，产品编号为PR1701。

PCR反应条件为：95℃预变性12min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min。

取菌液PCR鉴定反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图4所示。电泳结果显示，在435bp处出现电泳条带，与目的基因GM-CSF基因的分子量大小一致，表明pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体构建成功。

采用质粒提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0511），按照试剂盒说明书操作，提取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

酶切鉴定反应体系如下（10μL）：

酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

取酶切鉴定反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图5所示。电泳结果显示，电泳后出现两条条带，其中一条出现在435bp处，与目的基因GM-CSF基因的分子量大小一致，表明pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体构建成功。

实施例三：双PCR法获取带有限制性内切酶粘性末端的MART-1基因片段

根据MART-1基因序列和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物；从黑色素瘤细胞A375中提取的RNA所反转录的cDNA作为模板，分别用上述的两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物；将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到四种MART-1基因片段，其中两种MART-1基因片段的两端带有限制性内切酶粘性末端，由此无需使用限制性内切酶进行酶切，即可将MART-1基因片段定向连接到质粒载体的预期多克隆位点中。

与传统的PCR产物克隆方法相比，本方法（双PCR法）具有简单易行、成本低、效率高、通用性好等优点，可以广泛应用于PCR产物的快速克隆。在本方法中，不需要使用限制性内切酶处理PCR产物，即可得到含有限制性内切酶粘性末端的DNA片段，可以充分利用基因载体的多克隆位点，无需考虑目的基因中是否含有与载体多克隆位点相同的酶切位点，可以轻松实现目的基因的定向克隆。

1、引物设计

根据MART-1基因的核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:2所示）和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物，如下：

MART-1第一引物对由MART-1上游长引物和MART-1下游长引物组成：

MART-1上游长引物（如序列表中SEQ ID NO:7所示）：

5'-AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3'

下划线部分为限制性内切酶BstX I识别序列中切割位点下游的全部序列，斜体字母ATG为MART-1基因的起始密码子；

MART-1下游长引物（如序列表中SEQ ID NO:8所示）：

5'-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3'

下划线部分为限制性内切酶Not I识别序列中切割位点下游的全部序列。

MART-1第二引物对由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物组成：

MART-1上游短引物（如序列表中SEQ ID NO:9所示）：

5'-ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3'

下划线部分为限制性内切酶BstX I识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列，AT为MART-1基因的起始密码子的一部分；

MART-1下游短引物（如序列表中SEQ ID NO:10所示）：

5'-GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3'

下划线部分为限制性内切酶Not I识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列。

MART-1第一引物对和MART-1第二引物对的靶序列（即与MART-1基因相应的序列）相同。

限制性内切酶BstX I的识别序列为：5'-CCANNNNN/NTGG-3'

限制性内切酶Not I的识别序列为：5'-GC/GGCCGC-3'

2、获取cDNA模板

TRIzon法从黑色素瘤细胞A375中提取RNA（TRIzon总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0580），并反转录成cDNA（反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为RR019A）。

3、获取带有限制性内切酶粘性末端的MART-1基因片段

以黑色素瘤细胞A375中提取的RNA所反转录的cDNA为模板，用MART-1第一引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物A；用MART-1第二引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物B。PCR扩增产物A和PCR扩增产物B均含有MART-1基因序列。

PCR反应体系如下（50μL）：

PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环；72℃最终延伸5min。

分别取PCR扩增产物A和PCR扩增产物B，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图6所示。电泳结果显示，PCR扩增产物A的电泳条带出现在367bp处，PCR扩增产物B的电泳条带出现在359bp处，均与目的基因的分子量大小一致。

分别取PCR扩增产物A和PCR扩增产物B进行测序，结果表明：PCR扩增产物A的5'端比PCR扩增产物B的5'端多4个核苷酸，PCR扩增产物A的3'端也比PCR扩增产物B的3'端多4个核苷酸，其余序列完全相同。

将PCR扩增产物A和PCR扩增产物B等摩尔混合，进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物。

杂交PCR反应体系如下（25μL）：

扩增产物A（52.5μM）  10.8μL，

扩增产物B（46.1μM）  12.3μL，

灭菌蒸馏水            1.9μL。

杂交PCR反应条件如下：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，4℃保存。

PCR扩增产物A和PCR扩增产物B变性后，得到四种DNA单链，四种DNA单链随机组合，产生四种等比例的DNA片段——MART-1基因片段I、MART-1基因片段II、MART-1基因片段III和MART-1基因片段IV（如图7所示，直线省略区域为序列表SEQ ID NO:2所示的MART-1基因序列）。其中，MART-1基因片段III、MART-1基因片段IV为杂交DNA片段。MART-1基因片段III的5'末端具有BstX I粘性末端，其3'末端具有Not I粘性末端。

实施例四：pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体的构建

使用限制性内切酶BstX I和Not I双酶切pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体。由于内切酶BstX I位于pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体中的IRES序列下游的终点与EGFP序列上游的起始处，而内切酶Not I位于pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体中的EGFP序列的下游终点处，因此，通过这两个酶切位点插入MART-1基因片段后，MART-1基因位于IRES序列的下游，从而使得GM-CSF基因与MART-1基因分别位于IRES序列的两侧（如图8所示），实现了两个目的基因的协同表达，并能避免融合蛋白的产生。

1、Not I酶切反应

Not I酶切反应体系如下（50μL）：

酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

内切酶Not I、10×H Buffer、BSA（牛血清白蛋白）与Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）为Not I内切酶反应试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1166A。

采用DNA快速纯化试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW2302）进行纯化，收集经Not I酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体。

2、BstX I酶切反应

BstX I酶切反应体系如下（50μL）：

其中，内切酶BstX I与10×H Buffer为BstX I内切酶缓冲液体系，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1027A。

酶切反应条件：在37℃下反应6个小时。

采用DNA快速纯化试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW2302）进行纯化，收集经BstX I酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体。

3、连接MART-1基因和pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体，构建pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体

将实施例三制得的MART-1基因片段混合物与双酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体混合（MART-1基因片段与pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体的摩尔比为4︰1），加入T4DNA连接酶进行连接反应，在22℃下孵育30分钟，构建pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体。

MART-1基因片段混合物中的四种DNA片段，只有MART-1基因片段III具有与pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体互补的粘性末端，从而能够与pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体定向连接，其它三种MART-1基因片段均不能与pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体定向连接。

连接反应体系如下（20μL）：

连接反应条件：22℃孵育30分钟，70℃灭活5分钟。

4、pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体的鉴定

将20μL上述连接反应产物加入到200μL感受态细胞JM109中（1～2×10⁹Bacteria/ml），置于冰上冷却30min后，置于42℃水浴锅中热击90s，再置于冰上冷却2min；然后加入LB液体培养基780ul，在37℃条件下，于150转/分钟的摇床上复苏培养60min，将复苏过的菌液涂布在含有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃下倒置培养16～18小时；挑取阳性菌落至卡那霉素抗性LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养12～16小时。

采用质粒提取试剂盒（购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0511），按照试剂盒说明书操作，提取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

酶切反应体系一（10μL）：

酶切反应体系二（10μL）：

酶切反应体系三（10μL）：

其中，内切酶EcoR I与10×H Buffer为EcoR I内切酶缓冲液体系，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1040A。

酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

分别取上述酶切反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图9所示。电泳结果显示，EcoR I/BamH I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在435bp处，与目的基因GM-CSF基因的分子量大小一致；BamH I/Not I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在942bp处，与目的基因MART-1基因和IRES序列的分子量之和大小一致；EcoRI/Not I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在1377bp处，与目的基因GM-CSF基因、MART-1基因和IRES序列的分子量之和大小一致。上述鉴定结果表明，pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体构建成功。

将pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体送至金唯智生物科技（北京）有限公司进行测序，经测序与预期结果一致，进一步证明载体构建成功。

实施例五：获取含有特异性酶切位点的MART-1基因片段

根据MART-1基因的核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:2所示）和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计特异性引物如下：

MART-1上游引物（如序列表中SEQ ID NO:11所示）：

5’-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’（下划线部分为Xho I酶切位点序列），

MART-1下游引物（如序列表中SEQ ID NO:12所示）：

5’-CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’（下划线部分为EcoR I酶切位点序列）。

TRIzon法从黑色素瘤细胞A375中提取RNA并反转录成cDNA，以该cDNA为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，通过PCR反应（PCR反应体系和反应条件参考实施例一）获得MART-1基因片段，其上游含有Xho I酶切位点序列，下游含有EcoRI酶切位点序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图10所示。

实施例六：pIRES2-MART-1-EGFP重组载体的构建

使用限制性内切酶Xho I和EcoR I，分别酶切pIRES2-EGFP质粒（该质粒的多克隆位点处含有Xho I、EcoR I酶切位点）以及实施例五所得的MART-1基因片段（酶切反应体系和反应条件参考实施例二），得到酶切后线性化的pIRES2-EGFP载体以及酶切后的MART-1基因序列；采用T4DNA连接酶体系进行连接反应（连接反应体系和反应条件参考实施例二），在22℃下孵育30分钟，70℃灭活5分钟，构建pIRES2-MART-1-EGFP重组载体（如图11所示）。

取上述连接反应产物转染感受态细胞JM109，挑取阳性菌落菌液，分别进行菌液PCR鉴定和酶切鉴定（鉴定方法参考实施例二）。

取菌液PCR鉴定反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图12所示。电泳结果显示，在357bp处出现电泳条带，与目的基因MART-1基因的分子量大小一致，表明pIRES2-MART-1-EGFP重组载体构建成功。

取酶切鉴定反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图13所示。电泳结果显示，电泳后出现两条条带，其中一条出现在357bp处，与目的基因MART-1基因的分子量大小一致，表明pIRES2-MART-1-EGFP重组载体构建成功。

实施例七：双PCR法获取带有限制性内切酶粘性末端的GM-CSF基因片段

根据GM-CSF基因序列和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物；以CIK细胞中提取的RNA所反转录的cDNA为模板，分别用上述的两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物；将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到四种GM-CSF基因片段，其中两种GM-CSF基因片段的两端带有限制性内切酶粘性末端，由此无需使用限制性内切酶进行酶切，即可将GM-CSF基因片段定向连接到质粒载体的预期多克隆位点中。

1、引物设计

根据GM-CSF基因的核苷酸序列（如序列表中SEQ ID NO:1所示）和pIRES2-EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计两对长度不同、带有限制性内切酶粘性末端的引物，如下：

GM-CSF第一引物对由GM-CSF上游长引物和GM-CSF下游长引物组成：

GM-CSF上游长引物FL（如序列表中SEQ ID NO:14所示）：

5'-AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'

下划线部分为限制性内切酶BstX I识别序列中切割位点下游的全部序列，斜体字母ATG为GM-CSF基因的起始密码子；

GM-CSF下游长引物RL（如序列表中SEQ ID NO:15所示）：

5'-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'

下划线部分为限制性内切酶Not I识别序列中切割位点下游的全部序列。

GM-CSF第二引物对（FS/RS引物对）由GM-CSF上游短引物FS和GM-CSF下游短引物RS组成：

GM-CSF上游短引物FS（如序列表中SEQ ID NO:16所示）：

5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'

下划线部分为限制性内切酶BstX I识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列，AT为GM-CSF基因的起始密码子的一部分；

GM-CSF下游短引物RS（如序列表中SEQ ID NO:17所示）：

5'-GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'

下划线部分为限制性内切酶Not I识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列。

GM-CSF第一引物对与GM-CSF第二引物对的靶序列（即与GM-CSF基因相应的序列）相同。

2、获取带有限制性内切酶粘性末端的GM-CSF基因片段

TRIzon法从CIK细胞或人外周血分离的单个核细胞中，提取RNA并反转录成cDNA。以所得到的cDNA为模板，用GM-CSF第一引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C；用GM-CSF第二引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物D。PCR扩增产物C和PCR扩增产物D均含有GM-CSF基因序列。PCR反应体系和反应条件参考实施例三。

分别取PCR扩增产物C和PCR扩增产物D，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图14所示。电泳结果显示，PCR扩增产物C的电泳条带出现在445bp处，PCR扩增产物D的电泳条带出现在437bp处，均与目的基因的分子量大小一致。

将PCR扩增产物C和PCR扩增产物D等摩尔混合，进行杂交PCR反应，得到GM-CSF基因片段混合物。杂交PCR反应的反应体系和反应条件参考实施例三。

PCR扩增产物C和PCR扩增产物D变性后，得到四种DNA单链，四种DNA单链随机组合，产生四种等比例的DNA片段——GM-CSF基因片段V、GM-CSF基因片段VI、GM-CSF基因片段VII和GM-CSF基因片段VIII（如图15所示，直线省略区域为序列表SEQ ID NO:1所示的GM-CSF基因序列）。其中，GM-CSF基因片段VII、GM-CSF基因片段VIII为杂交DNA片段。GM-CSF基因片段VII的5'末端具有BstX I粘性末端，其3'末端具有Not I粘性末端。

实施例八：pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体的构建

使用限制性内切酶BstX I和Not I双酶切pIRES2-MART-1-EGFP重组载体，酶切反应体系和反应条件参考实施例四。采用DNA快速纯化试剂盒进行纯化，收集经双酶切后线性化的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体。

将实施例七制得的GM-CSF基因片段混合物与双酶切后线性化的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体混合（GM-CSF基因片段与pIRES2-MART-1-EGFP重组载体的摩尔比为4︰1），加入T4DNA连接酶进行连接反应（连接反应体系参考实施例四），在22℃下孵育30分钟，在70℃下灭活5分钟，构建出pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体（如图16所示）。

GM-CSF基因片段混合物中的四种DNA片段，只有GM-CSF基因片段VII具有与pIRES2-MART-1-EGFP重组载体互补的粘性末端，从而能够与pIRES2-MART-1-EGFP重组载体定向连接，其它三种GM-CSF基因片段均不能与pIRES2-MART-1-EGFP重组载体定向连接。

取上述连接反应产物转染感受态细胞JM109，挑取阳性菌落的质粒，进行酶切鉴定。

酶切反应体系一（10μL）：

其中，内切酶Xho I、10×H Buffer为Xho I内切酶反应试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司，产品编号为1094A。

酶切反应体系二（10μL）：

酶切反应体系三（10μL）：

酶切反应条件：在37℃下反应1个小时。

分别取上述酶切反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图17所示。电泳结果显示，Xho I/EcoR I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在357bp处，与目的基因MART-1基因的分子量大小一致；EcoR I/Not I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在1020bp处，与目的基因GM-CSF基因和IRES序列的分子量之和大小一致；Xho I/Not I双酶切反应产物电泳后出现两条条带，其中一条在1377bp处，与目的基因MART-1基因、GM-CSF基因和IRES序列的分子量之和大小一致。鉴定结果表明，pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体构建成功。

将pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体送至金唯智生物科技（北京）有限公司进行测序，经测序与预期结果一致，进一步证明载体构建成功。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体沿载体转录方向依次连接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示；所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游；其包括以下步骤：

A)获得含有特异性酶切位点的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位点序列的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，得到含有EcoRI和BamH I酶切位点的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；

B)构建pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体：用限制性内切酶EcoR I、BamH I分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤A)得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体；

C)获得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到MART-1基因片段混合物，其中的一种MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

D)构建pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤B)得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体，将步骤C)得到的MART-1基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-GM-CSF-MART-1重组载体；

其中，步骤A)所述的GM-CSF特异性引物为：

GM-CSF上游引物：5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，

GM-CSF下游引物：5’-TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’；

步骤A)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；

步骤C)所述的MART-1特异性引物包括MART-1第一引物对和MART-1第二引物对，所述的MART-1第一引物对由MART-1上游长引物和MART-1下游长引物组成，所述的MART-1第二引物对由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物组成：

MART-1第一引物对为：

MART-1上游长引物：5'-AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3'，

MART-1下游长引物：5'-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3'；

MART-1第二引物对为：

MART-1上游短引物：5'-ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3'，

MART-1下游短引物：5'-GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3'；

步骤C)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；

步骤C)所述杂交PCR反应的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，4℃保存。

2.GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体的制备方法，所述的GM-CSF和MART-1双基因共表达重组载体沿载体转录方向依次连接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示；所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游；其包括以下步骤：

a)获得含有特异性酶切位点的MART-1基因片段：从黑色素瘤细胞A375获取cDNA作为模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位点序列的MART-1特异性引物进行PCR扩增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位点的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；

b)构建pIRES2-MART-1-EGFP重组载体：用限制性内切酶Xho I、EcoR II分别酶切pIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MART-1-EGFP重组载体；

c)获得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一种GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；

d)构建pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体：用限制性内切酶BstX I、Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体，将步骤c)得到的GM-CSF基因片段混合物与酶切后线性化的pIRES2-MART-1-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2-MART-1-GM-CSF重组载体；

其中，步骤a)所述的MART-1特异性引物为：

MART-1上游引物：5’-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’，

MART-1下游引物：5’-CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’；

步骤a)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；

步骤c)所述的GM-CSF特异性引物包括GM-CSF第一引物对和GM-CSF第二引物对，所述的GM-CSF第一引物对由GM-CSF上游长引物和GM-CSF下游长引物组成，所述的GM-CSF第二引物对由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物组成：

GM-CSF第一引物对为：

GM-CSF上游长引物：5'-AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游长引物：5'-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'；

GM-CSF第二引物对为：

GM-CSF上游短引物：5'-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3'，

GM-CSF下游短引物：5'-GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3'；

步骤c)所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸5s，30个循环，72℃最终延伸5min；

步骤c)所述杂交PCR反应的反应条件为：95℃5min，80℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，40℃1min，4℃保存。