CN103601762B

CN103601762B - 二茂铁衍生物、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN103601762B
Application number: CN201310608170.3A
Authority: CN
Inventors: 雍建平; 卢灿忠
Original assignee: Fujian Institute of Research on the Structure of Matter of CAS
Current assignee: Fujian Institute of Research on the Structure of Matter of CAS
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: CN103601762A

Abstract

本发明公开式I所示的二茂铁衍生物及其盐

Description

二茂铁衍生物、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一类结构新颖的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物及含该类衍生物的药物组合物及其用途。具体而言，该类二茂铁衍生物对肺癌细胞株A549、大肠癌细胞株HCT-116和乳腺癌细胞株MCF-7具有较强的抑制活性。可作为治疗肿瘤、癌症等疾病的药物或先导化合物。

背景技术

二茂铁（Ferrocene）是1951年由Kealy和Pauson等合成的一种具有具有独特的夹心结构化合物，二价铁离子被夹在两个平面环之间互为交错构型。随着研究的深入，国内外已经合成了许多结构各异的二茂铁衍生物。二茂铁及其衍生物因其自身的特点：(1)芳香性，能发生取代反应，易进行修饰；(2)亲脂性，能够通过细胞膜与细胞内的各种酶相互作用；(3)低毒性，能够在体内进行代谢；(4)抗肿瘤活性等。二茂铁衍生物已被广泛的应用于不对称催化、磁性材料、非线性光学材料、液晶材料及医药等领域。尤其是在医学领域，二茂铁衍生物显示出更为突出的活性：E.I.Edwards等将二茂铁引入青霉素和头孢菌素后，其杀菌活性大大提高(E.I.Edwards,et al.J.Organomet.Chem.1975,85:C23)；A.R.Tajcrak等研究表明二茂铁衍生物具有杀虫活性；A.Rosenefeld等研究表明二茂铁修饰的顺铂衍生物具有相当强的抑制白血病活性，而且其肾毒比cis-DDP低的多(A.Rosenfeld,etal.Inorg.Chim.Acat.1992,201:219)；E.W.Neuse等人研究表明二茂铁衍生物具有独特的抗肿瘤、抗癌活性(E.W.Neuse.J.Inorga.Organoment.Polymers and Materials.2005,15(1):3-32)；E.I.Klimova等人研究表明含环丙烷的二茂铁衍生物具有较强的抗炎活性(E.I.Klimova,etal.J.Organomet.Chem.2012,708-709:37-45)；X.F.Huang等合成了一系列含吡唑环的二茂铁衍生物，活性研究表明部分化合物具有比5-氟尿嘧啶强的抗癌活性(X.F.Huang,etal.J.Organomet.Chem.2012,706-707:113-123)；W.Liu等合成了一系列二茂铁脲衍生物，活性研究表明部分化合物具有较强的抑制HIV-1蛋白酶活性(W.Liu,etal.Appl.Organomet.Chem.2012,26:189-193)；二茂铁喹啉衍生物(FQ,SSR97193)具有很强的抗疟疾活性，已进入二期临床研究。

美国专利申请8426462B2公开了含芳香环的二茂铁衍生物对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和前列腺癌细胞株PC-3具有很强的抑制活性。

异噁唑杂环是一种具有潜在生物活性的功能基团，通常被引入药物分子以提高活性，王建武等将异噁唑杂环基团引入甘草次酸和11-脱氧甘草次酸，合成了结构新颖的含异噁唑杂环的甘草次酸衍生物，活性研究表明该类化合物具有很强的抗炎、镇痛、保肝、抗肾损伤、抗胃溃疡等活性(徐为人,等.中草药.2011,42(6)：1177-1179).

在本发明中，我们将异噁唑杂环引入二茂铁母核，合成了一系列结构新颖的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物，并对该类化合物进行了初步的体外抑肺癌细胞株A549和大肠癌细胞株HCT-116活性研究，结果表明部分化合物在1×10^-4M浓度下对肺癌细胞株A549具有较强的抑制活性；部分化合物在1×10^-4M浓度下对大肠癌细胞株HCT-116具有较强的抑制活性；部分化合物在1×10^-4M浓度下对乳腺癌细胞株MCF-7具有较强的抑制活性；可作为抗肿瘤药物的候选化合物或先导化合物。

发明内容

本发明的目的在于，提供了如式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物，体外抑大肠癌细胞株HCT-116和人肺癌细胞株A549研究结果表明：部分化合物在1×10^-4M浓度下对大肠癌细胞株HCT-116、人肺癌细胞株A549和乳腺癌细胞株MCF-7具有较强的抑制活性。可作为抗癌药物的候选化合物或先导化合物。本发明通过如下的技术方案实现：

一种式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物，或其药学上可接受的盐，或组合物或溶剂化物：

其中：R选自氢、卤素，C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤代C_1-6烷基；n为0-5的整数。

Z为-NR₁-，-S-或-O-，其中R₁为氢或C_1-3烷基；

根据本发明的优选技术方案，式I中：

Z为-NH-或-O-；

R选自氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基或三氟甲基，n优选为0或1或2。

R优选在异噁唑环的邻位或对位，更优选为4-氟、4-氯、2-氯、4-溴、2,4-二氯、4-甲基、4-甲氧基、氢、4-三氟甲基或2,4-二甲氧基。

根据本发明的更优选技术方案，式I中：

根据本发明，所述式I所示的二茂铁衍生物更优选选自下述任一种化合物：

二茂铁甲酸-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氧基-]-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-甲基-苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-三氟甲基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(2,4-二甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-氟苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(2-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-4-{[3-(2,4-二氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-4-{[3-(4-溴苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-甲基-苯基)-异噁唑-5-基]-甲基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-三氟甲基苯基)-异噁唑-5-基]-甲基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2,4-二甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-氟苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2,4-二氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-溴苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

式I所示的二茂铁衍生物，可以分别选择与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。其中术语“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、及其类似盐；也包括与有机酸形成的盐，如乳酸、草酸、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、三氟乙酸或氨基酸和链烷酸盐如醋酸盐，HOOC-(CH2)n-COOH其中n是0-4的盐，及其类似盐。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。

术语“溶剂化物”包括水合物和醇合物。

本发明还提供一种药物组合物，其包括前述任一项的式(I)所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体或稀释剂。

根据所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含一种或多种选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂和包衣材料的药学可接受的辅助材料。

本发明还提供一种药物制剂，其包含前述的式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体或稀释剂。

本发明提供一种药物制剂，其特征在于，所述制剂优选为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

根据本发明的药物制剂，所述的制剂选自片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、颗粒剂、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明还提供一种用作药物的权利要求1-4的式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物或其药学上可接受的盐，尤其是一种有效用于治疗肿瘤/癌症的药物或先导化合物。

本发明还提供一种前述任意一项的式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于抗肿瘤或抗癌药物中的应用。

根据本发明所述的应用，其中所述的肿瘤或癌症选自：膀胱癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，乳腺癌，胃癌，食道癌，肺癌，头颈癌，结肠癌，咽癌，和胰腺癌等，更优选为非小细胞肺癌。

本发明还提供了一种前述任一项式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物和/或药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于抗肿瘤或癌症药物中的应用。

本发明还提供了一种式I所示的含异噁唑杂环的二茂铁衍生物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

二茂铁甲酸和3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑(式III)或3-取代苯基-5-氨甲基-异噁唑(式IV)，在干燥的有机溶剂和酯缩合剂体系中反应制备得到式(I-1)或式(I-2)所示的化合物：

同时，对于Z为其他取代基的式I化合物，例如Z为S时，可以丙炔硫醇为原料，按照化合物(III)的合成过程制备3-取代苯基-5-巯基甲基-异噁唑，接着采用化合物I-1的合成过程制备。

根据本发明，所述反应温度为-20℃至回流条件，优选室温至回流条件。

根据本发明，所述有机溶剂为芳烃、卤代烃、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、二氧六环、乙腈、DMF及离子液体。优选地，所述的溶剂选自苯，甲苯、二甲苯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈或DMF，更优选四氢呋喃。

根据本发明：所述的缩合剂(1)为DCC/DMAP或DCC,HOBt/DMAP或DCC/NMM或DCC/HATU等。

根据本发明，所述式(III)的中间体3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑通过如下的方法制备：

(1)取代苯甲醛与羟胺或羟胺盐酸盐在甲醇/水体系中，在碳酸钠的催化下反应生成相应的苯甲醛肟；

(2)将步骤(1)制得的苯甲醛肟与丙炔醇在N-溴丁二酰亚胺(NCS)和碱性缚酸剂的作用下通过1,3-偶极环加成反应形成式(III)异噁唑化合物。

根据本发明，优选地，所述的碱性缚酸剂选自有机碱或无机碱，所述有机碱选自三乙胺、三丙胺、DMAP、DMF、N-甲基吗啉等；所述的无机碱选自碳酸钾、氢化钠、碳酸钠等。更优选的碱性缚酸剂为三乙胺。

所述反应温度为0℃至回流温度，优选为室温至回流温度。

根据本发明，所述式(IV)的中间体3-取代苯基5-氨甲基-异噁唑通过如下的方法制备：

(3)式(III)的异噁唑化合物(优选通过前述方法获得)与磺酰氯反应获得式(V)化合物；

根据本发明的优选技术方案，步骤(3)中，所述磺酰氯选自：甲磺酰氯、苯磺酰氯、取代苯磺酰氯(如卤代苯磺酰氯、烷基苯磺酰氯)等，更优选为甲磺酰氯。所述反应温度为-5℃至回流温度，优选室温至回流温度。所述反应溶剂选自苯、甲苯、卤代芳烃、卤代烷烃(如氯仿或二氯甲烷)、四氢呋喃、乙腈及离子液体。更优选地，所述反应在二氯甲烷体系中回流反应。

(4)式(V)化合物与叠氮化钠反应，优选在DMF体系中，60℃温度下反应获得式(VI)化合物；

(5)式(VI)化合物与氯化铵及锌粉、铁粉或钯碳催化还原制备式(IV)化合物，优选所述催化剂在无机酸条件下进行催化，优选为盐酸或硫酸，所述催化剂优选为锌粉和氯化铵。

步骤(5)中优选的反应溶剂是水或有机溶剂(例如醇类，卤代烃类，芳烃类等)或其混合物，优选为乙醇和水的反应体系。

优选的合成路线如下所示：

同时，对于Z为其他取代基的式(I)化合物，例如Z为S时，可采用丙炔基硫醇为原料，按照化合物(III)的合成过程制备3-取代苯基-5-巯基甲基-异噁唑，接着采用化合物I-1的合成过程来制备。

术语”有效量”指的是，所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐对于能有效“治疗”个体的一种疾病或不适的用量。如果是癌症时，有效量能减少癌症或肿瘤细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制或阻止肿瘤细胞向周边器官的侵入，例如，肿瘤蔓延入软组织或骨骼中；抑制或阻止肿瘤的转移；抑制或阻止肿瘤的生长；一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状；减少发病率和死亡率；提高生活质量；或者是上述效果的结合。有效量可以是通过抑制EGFR活性来减少疾病症状的用量。对于癌症治疗，体内实验的效果可以通过评估如存活期、疾病进展时间(Time to DiseaseProgression，TTP)、反应率(Response Rates，RR)、持续反应期和/或生活质量来测量。专业人员已经意识到，有效量可以随着给药的途径、赋形剂的剂量、以及与其他药物的合用而变化。

术语“有效量”还可指得是所述至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐对抑制EGFR的过度表达和/或活性过高有效的剂量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例不能作为对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进都不违背本发明的精神。

其中，中间体和目标化合物的合成过程均以实施例中的代表说明，其余的中间体和目标化合物的合成过程同代表化合物。

仪器与试剂：

AVANCE III核磁共振仪(400MHz,DMSO-d₆,TMS为内标)，离子阱液质连用仪(DECAX-30000LCQ Deca XP)，Shimadzu FTIR-8400S(日本岛津制作所生产)，XT5数字显示显微熔点测定仪(北京市科仪电光仪器厂制造，温度未经校正)，可调波长式微孔板酶标仪(Molecular Devies SPECTRAMAX190).

实施例1中间体3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑(II)及3-取代苯基-5-氨甲基-异噁唑(III)的合成

其中以R为H作为示例：

（1）苯甲醛肟的合成

10.0mmol苯甲醛溶解在30mL30%CH₃OH和H₂O溶液中，加入装有磁力搅拌器的三角瓶中，搅拌下加入10.0mmol盐酸羟氨，等盐酸羟氨溶解后缓慢加入5.0mmol干燥研细的碳酸钠。室温反应，TLC检测反应完成后，体系减压蒸除甲醇后，加入30mL H₂O，二氯甲烷(3×30mL)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥有机层.脱溶剂即得苯甲醛肟粗产物，收率86.2%。该粗产物不用分离纯化直接进行下步反应。

（2）3-苯基-5-羟甲基-异噁唑

将10.0mmol苯甲醛肟和30mL干燥的二氯甲烷加入250mL单口圆底烧瓶中，搅拌下加入1.60g(12.0mmol)N-氯丁二酰亚胺(NCS)，微微加热至NCS全部溶解后，滴加0.56g(10.0mmol)2-丙炔-1-醇，随后缓慢滴加入20mL含10.1g(10.0mmol)三乙胺的二氯甲烷溶液，加完后体系回流.TLC检测反应完成后，母液水洗，无水硫酸钠干燥，柱分离(V_石油醚:V_乙酸乙酯5:1～2：1)即得3-苯基-5-羟甲基-异噁唑，收率76.8%。

（3）3-苯基-5-氨甲基-异噁唑

将10.0mmol5-羟甲基-3-苯基-异噁唑和30mL干燥的二氯甲烷加入250mL单口圆底烧瓶中，冰浴搅拌下将含1.01g(10.0mmol)三乙胺的20mL二氯甲烷溶液加入体系中，接着将溶有1.37g(12.0mmol)甲磺酰氯(MsCl)的5mL二氯甲烷溶液缓慢滴加入体系中，冰浴反应2h后，室温反应。TLC检测反应完成后，母液水洗，5%的碳酸氢钠溶液洗，水洗，无水硫酸钠干燥，减压脱溶剂得粗产物5-甲磺酸-3-苯基-异噁唑-5-甲醇酯，收率68.0%。粗产物不必纯化直接进行下步反应。

将5.0mmol5-甲磺酸-3-苯基-异噁唑-5-甲醇酯溶解在20mL干燥的DMF中，加入0.34g(5.20mmol)叠氮化钠，室温搅拌溶解后，置于45℃-50℃油浴中反应，TLC指示反应完成后，过滤，滤饼用乙醚(2×30mL)洗涤，合并有机层，向有机层中加100mL水，用乙醚(5×30mL)萃取，合并有机层，有机层水洗2次，无水硫酸钠干燥，脱溶剂后得粗产物3-苯基-5-叠氮甲基-异噁唑，收率90%，粗产物直接进行下面的还原反应.

5.0mmol5-叠氮甲基-3-苯基-异噁唑溶解在80mL乙醇和20mL水的混合溶液中，将0.17g(2.6mmol)的锌粉和0.28g(5.2mmol)的NH₄Cl加入体系，回流1h，真空脱去乙醇，向体系加入20mL水，用20%的氢氧化钠溶液调至pH值到12，向体系中加入50mL DCM，搅拌均匀后，过滤，滤渣在用少量的水溶解，过滤，合并两次的滤液，分出有机层，有机层，水洗，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂,残渣柱分离(V_二氯甲烷：V_甲醇，10：1)得产物3-苯基-5-氨甲基-异噁唑，收率75%.浅黄色固体,m.p:39～40℃,¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,TMS),δppm:1.60(s,2H,NH₂),3.91(s,2H,CH₂),6.40(s,1H),7.39(m,2H,Ar-H),7.76(m,2H,Ar-H).

实施例2二茂铁甲酸-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氧基-]-酯的合成过程

将0.23g(1mmol)的二茂铁甲酸和8mL干燥的THF加入50mL单口圆底烧瓶，搅拌下将0.206g(1mmol)DCC和0.122g(1mmol)DMAP加入反应体系，0℃反应30min后，接着将0.175g(1mmol)3-苯基-5-羟甲基-异噁唑加入反应体系，0℃反应30min后自然升至室温反应，整个反应过程在氮气保护下进行。TLC检测反应完成后，反应液减压浓缩，残渣柱分离(V_{（石油醚）}：V_{（乙酸乙酯）}=5:1～2:1)即得目标化合物二茂铁甲酸-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氧基-]-酯。其余的化合物按照二茂铁甲酸-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氧基-]-酯的合成过程合成。其结构均通过IR,¹H NMR,ESI-MS等分析方法进行了表征。优选出的化合物的物性常数及光谱数据以列表的形式进行说明：

实施例3N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺的合成过程

将0.23g(1mmol)的二茂铁甲酸和8mL干燥的THF加入50mL单口圆底烧瓶，搅拌下将0.206g(1mmol)DCC，0.135g(1mmol)HOBT和0.122g(1mmol)DMAP加入反应体系，0℃反应30min后，接着将0.175g(1mmol)3-苯基-异噁唑5-甲胺加入反应体系，0℃反应30min后自然升至室温反应，整个反应过程在氮气保护下进行。TLC检测反应完成后，反应液减压浓缩，残渣柱分离V_{（石油醚）}：V_{（乙酸乙酯）}=5:1～2:1）即得目标化合物N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺。其余的化合物按照N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺的合成过程合成。其结构均通过IR,¹H NMR,ESI-MS等分析方法进行了表征。优选出的化合物的物性常数及光谱数据以列表的形式进行说明：

优选出的化合物的结构、编号及名称如下表所示：

表1-优选化合物代号及名称

表2-表1部分化合物的物性常数、IR和MS数据

编号	MS(100%)	编号	MS(100%)
				Fc-1	388([M+1]⁺,6)	Fc-7	422([M+1]⁺,10)
Fc-2	401([M]⁺,100)	Fc-8	421([M]⁺,10)
				Fc-3	417([M]⁺,30)	Fc-9	457([M+1]⁺,20)
Fc-10	466([M]⁺,35)

表3-表1化合物的物性常数¹H NMR

实施例4N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺的盐酸盐和醋酸盐的制备

(1)N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺盐酸盐的制备:

将0.5mmol N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺加入20mL（V:V,1:1）5%的盐酸溶液和甲醇混合溶液中，氮气保护下搅拌30min后，室温缓慢蒸发结晶即得N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺盐酸盐，淡黄色固体，收率：52%。

(2)N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺乙酸盐的制备:

将0.5mmol N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺加入盛有10mL干燥二氯甲烷的50mL单口圆底烧瓶中，氮气保护下搅拌，缓慢滴加入2mL冰乙酸，搅拌30min，冷却后冷藏结晶，过滤，真空干燥后即得N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲基-]-二茂铁甲酰胺乙酸盐，淡黄色固体，收率：58%。

实施例5抗癌活性实验

采用MTT法进行了抑大肠癌细胞株(HCT-116)和人肺癌细胞株(A549)活性筛选。

具体的实验操作过程如下：

(1)将处于对数生长期的大肠癌细胞株HCT-116接种于96孔培养板培养，待细胞长至90%,将1μL1×10^-4M的药品加入，其浓度设3个复孔，并设置阳性对照（吉非替尼），阴性对照为1μL DMSO。之后在37℃、5%CO₂条件下培养12小时;(2)接着在每个孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，放置4小时后将培养基吸出;(3)每孔加入100μL DMSO，用可调波长式微孔酶标仪测595nm波长下的吸光度值(A₅₉₅)。采用如下的公式计算抑制率.

(2)抑肺癌细胞株A549和乳腺癌细胞株MCF-7的实验过程同大肠癌细胞株HCT-116的筛选过程。

优选的化合物或其盐在1×10^-4M浓度下抑制大肠癌细胞株(HCT-116)、人肺癌细胞株A549和乳腺癌细胞株MCF-7的活性，实验结果见下表4、表5和表6.

表4-式I中部分实施例化合物抑制大肠癌细胞株(HCT-116)活性测试结果

表5-式I中部分实施例化合物抑制人肺癌细胞株(A549)活性测试结果

表6-式I中部分实施例化合物抑制乳腺癌细胞株(MCF-7)活性测试结果

Claims

1.一种式I所示的二茂铁衍生物及其盐

其中：R选自氢、卤素，C₁～C₆烷基、C₁～C₆烷氧基或卤代C₁～C₆烷基；n为0-5的整数；

Z为-NR₁-，-S-或-O-，其中R₁为氢或C_1-3烷基。

2.根据权利要求1的二茂铁衍生物，其中

Z为-NH-，或-O-；

R选自氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基或三氟甲基；

n为0或1或2。

3.根据权利要求1或2的二茂铁衍生物，其中

R在异噁唑环的邻位或对位。

4.根据权利要求3所述的二茂铁衍生物，其中，

R为4-氟、4-氯、2-氯、4-溴、2,4-二氯、4-甲基、4-甲氧基、氢、4-三氟甲基或2,4-二甲氧基。

5.根据权利要求1所述的二茂铁衍生物，其中所述化合物选自下述任一种化合物：

二茂铁甲酸-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氧基-]-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-甲基-苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-三氟甲基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-氟苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(4-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-{[3-(2-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-4-{[3-(2,4-二氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

二茂铁甲酸-4-{[3-(4-溴苯基)-异噁唑-5-基]-甲氧基-}-酯；

N-[(3-苯基-异噁唑-5-基)-甲氨基-]-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-甲基-苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-三氟甲基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2,4-二甲氧基苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-氟苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2-氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(2,4-二氯苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺；

N-{[3-(4-溴苯基)-异噁唑-5-基]-甲氨基-}-二茂铁甲酰胺。

6.一种药物组合物，其包括权利要求1-5任一项的式I所示的二茂铁衍生物，或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体或稀释剂。

7.权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种选自填充剂、崩解剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂和包衣材料的药学可接受的辅助材料。

8.权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为制剂形式，所述制剂为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

9.权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的制剂选自片剂、胶囊、颗粒剂、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述片剂选自分散片、肠溶片、咀嚼片或口崩片。

11.一种权利要求1-5任一项的式I所示的二茂铁衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于抗肿瘤或抗癌药物中的应用；

所述的肿瘤或癌症选自：乳腺癌，肺癌，结肠癌。

12.一种权利要求1-5任一项的式I所示的二茂铁衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑(式III)或3-取代苯基-5-氨甲基-异噁唑(式IV)以取代苯甲醛为原料，通过如下的系列反应合成：

式(I)所示的二茂铁衍生物以二茂铁甲酸和3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑(式III)或3-取代苯基-5-氨甲基-异噁唑(式IV)为原料，在干燥的有机溶剂和酯缩合剂体系中通过在特定的反应温度下制备所得：

其中干燥的有机溶剂为：四氢呋喃或二氯甲烷或氯仿或1,2-二氯甲烷或苯或甲苯或吡啶或DMF或离子液体；缩合剂(1)为：DCC/DMAP、DCC,HOBt/DMAP、DCC,HOBt/NMM；缩合剂(2)为：DCC/DMAP、DCC,HOBt/DMAP、DCC,HOBt/NMM；特定的温度指反应温度在-20℃至回流范围变化；

或者：式I所示的二茂铁衍生物通过以二茂铁甲酰氯分别和3-取代苯基-5-羟甲基-异噁唑(式III)或3-取代苯基-5-氨甲基-异噁唑(式IV)反应来制备；其中二茂铁甲酰氯通过以二茂铁甲酸和二氯亚砜或三氯氧磷或五氯化磷或草酰氯反应制备；

其中，R如权利要求1-4任一项中所定义；

如果需要，将(III)和(IV)中的任何官能团予以保护；

并且其后，如果有必要以任何次序：

(1)除去任何保护剂，和

(2)形成式I化合物。