CN103592169B - 一种鉴定小麦‑滨麦多重异代换系的方法 - Google Patents

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Abstract

一种包含滨麦1Ns、5Ns和6Ns染色体的小麦‑滨麦多重异代换系的创制:通过利用八倍体小滨麦M842‑12(2n=8x=56,AABBDDNsNs)与硬粒小麦(2n=4x=28,AABB)品种Trs‑372杂交,在F1,F2,F3和F4世代均进行细胞学染色体镜检和基因组原位杂交(GISH)鉴定,筛选染色体数目为2n=42,且含有滨麦Ns基因组染色体的单株,对筛选出的单株均套袋自交,在F5世代,选育出1个含有滨麦1Ns、5Ns和6Ns染色体的小麦‑滨麦多重异代换系05DM6。

Description

一种鉴定小麦-滨麦多重异代换系的方法
技术领域
本发明涉及一种包含滨麦1Ns、5Ns和6Ns染色体的小麦-滨麦多重异代换系的创制及原位杂交,SSR和PAGE鉴定。
背景技术
小麦远缘杂交是利用外源遗传物质丰富小麦遗传基础和人工创制合成新物种的重要途径和手段之一。滨麦(Leymus mollis(Trin.)Hara),又名柔软赖草,属禾本科,大麦亚族,赖草属野生杂草,具有抗旱,耐寒,耐盐碱,耐瘠薄,抗多种真菌,细菌病害和茎秆粗壮,大穗多花等特性,是麦类作物品种改良的优异种质资源[2,3]。滨麦的基因组为NsNsXmXm,其中Ns基因组来自于华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng),而Xm基因组的来源目前尚未确定。
上世纪60年代,Tsitsin等通过幼胚培养,获得了四倍体、六倍体小麦与大赖草、滨麦和沙生赖草的杂种。Anamthawat-Jónsson等采用胚拯救和秋水仙碱加倍,获得了普通小麦、波斯小麦与滨麦的杂种双二倍体,并报道了1个包含全部A和B基因组染色体、1对D基因组染色体和6对滨麦染色体的小麦-滨麦双二倍体材料AD99,利用AD99与普通小麦杂交,筛选出了6个抗白粉病的纯合株系[2]。Li等(2005,2006)对八倍体小滨麦小孢子的发生、配子体的形成及滨麦染色体的遗传行为进行了分析,并通过利用八倍体小黑麦与八倍体小滨麦杂交,获得了一个包含6条黑麦染色体和6条滨麦染色体的小麦-黑麦-滨麦三属杂种。
研究通过胚拯救和秋水仙碱染色体加倍,获得了具有滨麦的大穗、多花、大粒、抗病等特性的普通小麦-滨麦不完全双二倍体M842;利用M842与普通小麦和缺体小麦杂交,培育出了3个异附加系和2个异代换系;应用基因组原位杂交对6种类型的八倍体小滨麦(Octoploid Tritileymus)的染色体组构成进行了分子细胞遗传学分析,将八倍体小滨麦M842-4、M842-8、M842-12和M842-16的染色体组构成确定为AABBDDNsNs,M842-10的染色体组构成确定为AABBDDNsNs+2Ta-2Lm(Ns),M842-13的染色体组构成确定为AABBDDJJ;利用八倍体小滨麦与八倍体小偃麦、八倍体小簇麦进行了杂交,获得了小麦-滨麦-偃麦草、小麦-滨麦-簇毛麦三屈杂种[17,18]。利用八倍体小滨麦M842-12和M842-13与硬粒小麦品种Trs-372和D4286进行杂交,对杂种F1进行了细胞遗传学分析。
近年来,SSR分子标记在小麦遗传作图、基因定位、系谱或亲缘关系分析、标记辅助选择、小麦遗传背景中外源遗传物质鉴定等研究中得到了广泛应用。等建立了小麦的第一张微卫星遗传图谱,他们将230个引物对扩增的279个位点整合到国际小麦簇作图计划(ITIM)的“Opata85×W7984”作图群体遗传框架图上;Pestsova等对从粗山羊草分离的D基因组专化性微卫星标记(GDM)在小麦上进行了作图,将55个SSR位点整合到ITIM的“Opata85×W7984”作图群体遗传框架图上。国际小麦微卫星协会(WheatMicrosatelliteConsortium,WMC)也将开发的66个WMC标记整合到已有的小麦遗传框架图上;迄今已有近千个SSR标记被定位在小麦遗传物理图谱中。在小麦遗传背景中外源遗传物质鉴定研究方面,Guo等利用SSR标记对普通小麦-多枝赖草二体异附加系Line24中的多枝赖草染色体进行了鉴定,获得了4个用来鉴定Line24中多枝赖草染色体的分子标记,并根据这4个微卫星标记位点在小麦染色体的位置,推测Line24中附加的1对多枝赖草染色体是第3、5、6、7部分同源群染色体相互易位形成的。Peil等应用SSR对小麦-尾状山羊草(Aegilopsmarkgrafii)异附加系中的外源染色体进行了分析鉴定,并获得了22个可在普通小麦背景中鉴定尾状羊草染色质的分子标记;Iqbal等利用SSR鉴定了小麦-单芒山羊草(Aegilopsuniaristata)3N染色体异附加系。
发明内容
在Trs-372×M84212的杂交后代中,筛选出了1个染色体数目为2n=42,含有6条滨麦染色体的株系05DM6,本发明采用形态学、细胞遗传学、基因组原位杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳和SSR分子标记等技术对该株系进行研究,以期了解株系05DM6的形态特征、遗传行为、染色体构成,及所含滨麦染色体的同源群归屈等,为小麦品种改良和染色体工程育种提供新的种质资源。
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的:通过利用八倍体小滨麦M842-12(2n=8x=56,AABBDDNsNs)与硬粒小麦(2n=4x28,AABB)品种Trs-372杂交,在F1,F2,F3和F4世代均进行细胞学染色体镜检和基因组原位杂交(GISH)鉴定,筛选染色体数目为2n=42,且含有滨麦Ns基因组染色体的单株,对筛选出的单株均套袋自交,在F5世代,选育出1个含有滨麦1Ns、5Ns和6Ns染色体的小麦-滨麦多重异代换系05DM6。
本发明的另一个目的是一种鉴定小麦-滨麦多重异代换系的方法,其特征在于包括以下:
细胞遗传学分析:Trs-372×M842-12的F5后代小滨麦多重异代换系05DM6,种子室内发芽,待根长至1~2cm时,剪取根尖于0~4℃冰水预处理24h,卡诺固定液固定,1%纤维素酶+1%果胶酶酶解,醋酸洋红染色压片;花粉母细胞观察:田间取适龄幼穗,用卡诺固定液固定,醋酸洋红染色压片,Olympus BX60显微镜观察;
基因组原位杂交:DNA提取及探针标记:采用CTAB法提取滨麦和华山新麦草全基因组DNA并进行标记,染色体制片及原位杂交,每张制片加40μl杂交液(包含20×SSC4μl,ssDNA(鲑鱼精DNA,5ug/uL)1μl,10%(W/V)SDS(十二烷基磺酸钠)1μl,50%(W/V)DS(硫酸葡聚糖)8μl,去离子甲酰胺20μl,探针DNA100ng,无菌去离子水加至40μl)。95℃变性8min,杂交在hybrite原位杂交仪上依照程序:75℃ 8min,37℃ 16h进行;
SSR标记分析:PCR扩增反应体系20μl,包含1×buffer(100mM Tris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2),0.2M dNTPs,50ng SSR引物,1U Taq DNA聚合酶,50~100ng模板DNA,94℃预变性3min,34个循环按照94℃变性1min,50,55或60℃退火1min,72℃延伸2min进行,最后充分延伸10min,扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,点样量8μl,150V恒压条件下电泳4~5h,硝酸银染色,数码相机照相保存结果;
PAGE分析:配制12%的分离胶和4.0%的浓缩胶,点样量为10μl,电极缓冲液pH8.3,每板胶恒定电流15mA,15℃电泳5h,考马斯亮蓝R-250染色过夜,自来水脱色,数码相机照相,凝胶浓度12%,凝胶交联度3.3%,点样量10μl,电极缓冲液pH3.1,每板胶恒定电压200V,电泳30min后调为400V,电泳5h,10%三氯乙酸溶液固定,考马斯亮蓝R-250染色,自来水脱色,数码相机照相;
形态学观察:统计八倍体小滨麦M842-12,硬粒小麦品种Trs-372,小滨麦多重异代换系05DM6及普通小麦品种7182的10个单株的株高和分蘖数,调查每个材料5个典型单株所有分蘖的穗长、小穗数、穗粒数、穗下茎节长度、旗叶大小性状,利用SPSS V13.0软件对各性状值的差异显著性进行方差分析。
附图说明
附图1小滨麦多重异代换系05DM6的根尖体细胞染色体(a)及其和花粉母细胞减数分裂中期I染色体(b)
附图2小滨麦多重异代换系05DM6的根尖体细胞染色体的基因组原位杂交鉴定
(a)和花粉母细胞减数分裂中期I染色体基因组原位杂交鉴定(b)
附图3小滨麦多重异代换系05DM6的SSR分子标记分析
附图4小滨麦多重异代换系05DM6及其亲本的SDS-PAGE(a)和A-PAGE(b)鉴定
附图5小滨麦多重异代换系05DM6及其亲本的植株(a)、穗子(b)和小花(c)
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述;应当理解,优选实施例仅为了说明本发明,而不是为了限制本发明的保护范围。
通过胚拯救和秋水仙碱染色体加倍,获得了具有滨麦的大穗、多花、大粒、抗病等特性的普通小麦-滨麦不完全双二倍体M842;利用M842与普通小麦和缺体小麦杂交,培育出了3个异附加系和2个异代换系;应用基因组原位杂交对6种类型的八倍体小滨麦(Octoploid Tritileymus)的染色体组构成进行了分子细胞遗传学分析,将八倍体小滨麦M842-4、M842-8、M842-12和M842-16的染色体组构成确定为AABBDDNsNs,M842-10的染色体组构成确定为AABBDDNsNs+2Ta-2Lm(Ns),M842-13的染色体组构成确定为AABBDDJJ;利用八倍体小滨麦与八倍体小偃麦、八倍体小簇麦进行了杂交,获得了小麦-滨麦-偃麦草、小麦-滨麦-簇毛麦三属杂种。通过利用八倍体小滨麦M842-12(2n=8x=56,AABBDDNsNs)与硬粒小麦(2n=4x=28,AABB)品种Trs-372杂交,在F1,F2,F3和F4世代均进行细胞学染色体镜检和基因组原位杂交(GISH)鉴定,筛选染色体数目为2n=42,且含有滨麦Ns基因组染色体的单株,对筛选出的单株均套袋自交,在F5世代,选育出1个含有6条滨麦Ns基因组染色体的小麦-滨麦多重异代换系05DM6。
本发明的另一个目的是一种鉴定小麦-滨麦多重异代换系的方法,其特征在于包括以下:
细胞遗传学分析:Trs-372×M842-12的F5后代小滨麦多重异代换系05DM6,种子室内发芽,待根长至1~2cm时,剪取根尖于0~4℃冰水预处理24h,卡诺固定液固定,1%纤维素酶+1%果胶酶酶解,醋酸洋红染色压片;花粉母细胞观察:田间取适龄幼穗,用卡诺固定液固定,醋酸洋红染色压片,OlympusBX60显微镜观察;利用M842-12(AABBDDNsNs,2n=56)与硬粒小麦品种Trs-372(AABB,2n=28)杂交,后代经4代套袋自交,在F5后代中,通过根尖体细胞染色体镜检,筛选到1株2n=42的植株05DM6,收获该单株,对其15粒种了室内发芽,固定根尖后播种于大田;15粒种子的根尖体细胞染色体数目都为2n=42(图1a)。田间选取05DM6的适龄幼穗,对54个花粉母细胞减数分裂中期I染色体配对情况进行镜检观察,结果显示,05DM6有46个花粉母细胞的染色体构型为2n=21II,占观察细胞数的85.19%;在二价体中,环状二价体占有很高比例,平均每个细胞有18.97个(图1b)。
基因组原位杂交:DNA提取及探针标记:采用CTAB法提取滨麦和华山新麦草全基因组DNA并进行标记,染色体制片及原位杂交,每张制片加40μl杂交液(包含20×SSC4μl,ssDNA(鲑鱼精DNA,5ug/uL)1μl,10%(W/V)SDS(十二烷基磺酸钠)1μl,50%(W/V)DS(硫酸葡聚糖)8μl,去离子甲酰胺20μl,探针DNA100ng,无菌去离子水加至40μl)。95℃变性8min,杂交在hybrite原位杂交仪上依照程序:75℃ 8min,37℃ 16h进行;
对05DM6的根尖体细胞分别以滨麦和华山新麦草全基因组DNA为探针进行基因组荧光原位杂交(GTSH)鉴定,结果显示,05DM6细胞都含有6条完整的黄绿色染色体信号,推断05DM6含有6条Ns基因组染色体(图2a)。以华山新麦草总基因组DNA作为探针,对其花粉母细胞进行基因组原位杂交鉴定,结果显示,05DM6花粉母细胞减数分裂中期I细胞都有3个完整的二价体显示黄绿色信号,表明05DM6中的6条Ns基因组染色体可以完全配对为3对染色体(图2b)。由此说明,05DM6是1个遗传稳定的,包含36条小麦染色体和3对滨麦Ns基因组染色体的小麦-滨麦多重异代换系。
SSR标记分析:为确定05DM6的染色体组成,采用Pestsova等公布的小麦D基因组1D~7D染色体的14对SSR引物,对05DM6及其亲本进行了PCR分子标记分析。PCR扩增反应体系20μl,包含1×buffer(100mM Tris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2),0.2M dNTPs,50ng SSR引物,1U Taq DNA聚合酶,50~100ng模板DNA,94℃预变性3min,34个循环按照94℃变性1min,50,55或60℃退火1min,72℃延伸2min进行,最后充分延伸10min,扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,点样量8μl,150V恒压条件下电泳4~5h,硝酸银染色,数码相机照相保存结果。
SSR结果分析显示,D基因组的2D,3D,4D和7D染色体上的引物,在05DM6,八倍体小滨麦M842和小麦品种7182中都扩增出了预期的目标条带,而1D,5D和6D染色体上的引物,虽然在八倍体小滨麦M842和小麦品种7182中扩增出了预期的目标条带,但在05DM6中却没有扩增出预期的目标条带,说明05DM6可能缺失的了小麦D基因组的1D,5D和6D染色体,而含有小麦D基因组的2D,3D,4D和7D染色体(图3)。05DM6中小麦D基因组的1D,5D和6D染色体可能由滨麦的1Ns、5Ns和6Ns染色体所代换。
PAGE分析:对05DM6及其亲本的种子贮藏蛋白进行了十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酸性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)鉴定。配制12%的分离胶和4.0%的浓缩胶,点样量为10μl,电极缓冲液pH8.3,每板胶恒定电流15mA,15℃电泳5h,考马斯亮蓝R-250染色过夜,自来水脱色,数码相机照相,凝胶浓度12%,凝胶交联度3.3%,点样量10μl,电极缓冲液pH3.1,每板胶恒定电压200V,电泳30min后调为400V,电泳5h,10%三氯乙酸溶液固定,考马斯亮蓝R-250染色,自来水脱色,数码相机照相;SDS-PAGE电泳结果显示,在高分子量谷蛋白区,05DM6及其外源亲本M842-12和滨麦都有1条特异的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)条带,而在对照中国春,05DM6的小麦亲本Trs-372和7182则没有该条带,同时05DM6还缺少了小麦亲本71821D染色体Glu-D1位点所表达的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)条带(图4a,箭头所示);A-PAGE电泳结果显示,在ω-醇溶蛋白区域,05DM6及其外源亲本M842-12和滨麦都有1条特异的醇溶蛋白条带,而05DM6的小麦亲本Trs-372和7182则没有该条带(图4b,箭头所示)。说明,05DM6携带了来自滨麦Ns基因组的特异HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白条带。表明,05DM6中小麦D基因组的1D染色体己由滨麦Ns基因组的1Ns染色体所代换。
形态学观察:统计八倍体小滨麦M842-12,硬粒小麦品种Trs-372,小滨麦多重异代换系05DM6及普通小麦品种7182的10个单株的株高和分蘖数,调查每个材料3个典型单株所有分蘖的穗长、小穗数、穗粒数、穗下茎节长度、旗叶大小性状,利用SPSS V13.0软件对各性状值的差异显著性进行方差分析。结果显示,05DM6具有双亲的形态学特征,株高明显变矮,比双亲都低,穗形与亲本M842-12较为接近,都为纺锤形(图5b),而护颖与亲本Trs-372相似,较光滑且具有较为明显的龙骨突起,芒的长度明显变短,与亲本M842-12较为接近。05DM6的分蘖数、旗叶大小、穗长、小穗数以及结实率均介于双亲之间,而株高、穗下茎节长度和穗粒数等性状显著低于双亲。方差分析表明,05DM6与亲本M842-12、Trs-372、7182相比,株高差异显著,分蘖数、穗长、小穗数和穗下茎节长度等性状差异极显著,旗叶大小和结实率差异不显著。

Claims (1)

1.一种鉴定小麦-滨麦多重异代换系的方法,其特征在于包括以下分析:
1)细胞遗传学分析:Trs-372×M842-12的F5后代小滨麦多重异代换系05DM6,种子室内发芽,待根长至1~2cm时,剪取根尖于0~4℃冰水预处理24h,卡诺固定液固定,1%纤维素酶+1%果胶酶酶解,醋酸洋红染色压片;花粉母细胞观察:田间取适龄幼穗,用卡诺固定液固定,醋酸洋红染色压片,Olympus BX60显微镜观察,利用M842-12(AABBDDNsNs,2n=56)与硬粒小麦品种Trs-372(AABB,2n=28)杂交,后代经4代套袋自交,在F5后代中,通过根尖体细胞染色体镜检,筛选到1株2n=42的植株05DM6,收获该单株,对其15粒种子室内发芽,固定根尖后播种于大田;15粒种子的根尖体细胞染色体数目都为2n=42,田间选取05DM6的适龄幼穗,对54个花粉母细胞减数分裂中期I染色体配对情况进行镜检观察,结果显示,05DM6有46个花粉母细胞的染色体构型为2n=21II,占观察细胞数的85.19%;在二价体中,环状二价体占有很高比例,平均每个细胞有18.97个;
2)基因组原位杂交:DNA提取及探针标记:采用CTAB法提取滨麦和华山新麦草全基因组DNA并进行标记,染色体制片及原位杂交,每张制片加40μl杂交液,该40μl杂交液包含20×SSC4μl,5ug/uL的ssDNA(鲑鱼精DNA)1μl,10%(W/V)SDS(十二烷基磺酸钠)1μl,50%(W/V)DS(硫酸葡聚糖)8μl,去离子甲酰胺20μl,探针DNA100ng,无菌去离子水加 至40μl,95℃变性8min,杂交在hybrite原位杂交仪上依照程序:75℃8min,37℃16h进行,对05DM6的根尖体细胞分别以滨麦和华山新麦草全基因组DNA为探针进行基因组荧光原位杂交(GISH)鉴定,结果显示,05DM6细胞都含有6条完整的黄绿色染色体信号,推断05DM6含有6条Ns基因组染色体,以华山新麦草总基因组DNA作为探针,对其花粉母细胞进行基因组原位杂交鉴定,结果显示,05DM6花粉母细胞减数分裂中期I细胞都有3个完整的二价体显示黄绿色信号,表明05DM6中的6条Ns基因组染色体可以完全配对为3对染色体,05DM6是1个遗传稳定的,包含36条小麦染色体和3对滨麦Ns基因组染色体的小麦-滨麦多重异代换系;
3)SSR标记分析:PCR扩增反应体系20μl,包含1×buffer,0.2M dNTPs,50ng SSR引物,1U Taq DNA聚合酶,50~100ng模板DNA,所述buffer为100mMTris-HCl pH8.3,1.5mMMgCl2,94℃预变性3min,34个循环按照94℃变性1min,50,55或60℃退火1min,72℃延伸2min,最后充分延伸10min,扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,点样量8μl,150V恒压条件下电泳4~5h,硝酸银染色,数码相机照相保存结果,SSR结果分析显示,D基因组的2D,3D,4D和7D染色体上的引物,在05DM6,八倍体小滨麦M842和小麦品种7182中都扩增出了预期的目标条带,而1D,5D和6D染色体上的引物,虽然在八倍体小滨麦M842和小麦品种7182中扩增出了预期的目标条带,但在05DM6中却没 有扩增出预期的目标条带;
4)PAGE分析:配制12%的分离胶和4.0%的浓缩胶,点样量为10μl,电极缓冲液pH8.3,每板胶恒定电流15mA,15℃电泳5h,考马斯亮蓝R-250染色过夜,自来水脱色,数码相机照相,凝胶浓度12%,凝胶交联度3.3%,点样量10μl,电极缓冲液pH3.1,每板胶恒定电压200V,电泳30min后调为400V,电泳5h,10%三氯乙酸溶液固定,考马斯亮蓝R-250染色,自来水脱色,数码相机照相,SDS-PAGE电泳结果显示,在高分子量谷蛋白区,05DM6及其外源亲本M842-12和滨麦都有1条特异的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)条带,而在对照中国春,05DM6的小麦亲本Trs-372和7182则没有该条带,05DM6缺少了小麦亲本71821D染色体Glu-D1位点所表达的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)条带;
5)形态学观察:统计八倍体小滨麦M842-12,硬粒小麦品种Trs-372,小滨麦多重异代换系05DM6及普通小麦品种7182的10个单株的株高和分蘖数,调查每个材料5个典型单株所有分蘖的穗长、小穗数、穗粒数、穗下茎节长度、旗叶大小性状,利用SPSS V13.0软件对各性状值的差异显著性进行方差分析,05DM6具有双亲的形态学特征,株高变矮,比双亲都低,穗形与亲本M842-12接近,都为纺锤形,而护颖光滑且具有龙骨突起,芒的长度变短,与亲本M842-12接近,05DM6的分蘖数、旗叶大小、穗长、小穗数以及结实率均介于双亲之间。
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小麦—滨麦—偃麦草三属杂交后代的细胞遗传学和形态学研究;赵继新等;《西北农业学报》;20011231;第10卷(第4期);第21页左栏第2段至第22页左栏第1段 *
小麦-黑麦大穗型衍生后代的分子细胞学鉴定;杜万里等;《麦类作物学报》;20090830;第29卷(第4期);第566页右栏1.6部分 *
普通小麦×大麦杂交后代中间材料的GISH及PAGE鉴定;陈新宏等;《遗传学报》;20040731;第31卷(第7期);第731页左栏第3段至右栏第5段 *

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