CN103589724B - 一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5及其应用。所述启动子具体为巨桉品种EG6的多逆境诱导型基因G6PDH的启动子。所述启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明的启动子的调控元件包含有涉及低温胁迫应答、干旱胁迫应答、光应答、激素应答等等元件。所述启动子可被低温、干旱等逆境所诱导表达，能用于植物源的诱导型表达载体，在生物工程领域中具有广泛的适用性和很好的应用前景。

Description

一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子 pG5 及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5及其应用。

背景技术

戊糖磷酸途径是植物体内糖代谢的重要途径，其主要生理功能是为生物合成提供还原力 NADPH和为核酸的合成提供五碳糖，以及部分中间产物可参与氨基酸和脂肪酸合成等等。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是其关键性调控限速酶(林元震. 2006.甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因克隆及结构分析与功能鉴定. 博士学位论文, 北京林业大学, 导师: 张志毅, pp.44-66)，涉及了多种环境胁迫引起的植物应答反应，比如与一些金属离子(如Al³⁺)的胁迫、水分胁迫、盐胁迫、低温胁迫、病原菌侵染等有关，说明多种逆境胁迫可诱导G6PDH 的表达，G6PDH基因启动子区域可能含有涉及多种环境胁迫应答的调控元件。

启动子是一段能与 RNA 聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列，其类型直接决定了外源基因表达的时空效应(侯丙凯, 夏光敏, 陈正华. 2001. 植物基因工程表达载体的改进和优化策略. 遗传, 23(5): 492- 497)。植物基因启动子中往往包含许多不同的顺式作用元件，可在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物增强抵御外界环境胁迫的能力(聂丽娜, 夏兰琴, 徐兆师, 高东尧, 李琳, 于卓, 陈明, 李连城,马有志. 2008. 植物基因启动子的克隆及其功能研究进展. 植物遗传资源学报, 9(3): 385-391)。因此分离与弄清楚植物启动子的分子本质不仅是研究基因表达调控机制的重要内容，而且也是构建基因工程表达载体的关键。

每年，非生物逆境给农林业生产造成了巨大的经济损失，主要原因是逆境严重影响了植物的正常生长发育。近年来，随着植物抗寒生理生化及分子机理研究的深入，科学家们已相继从多种植物中分离出抗逆境基因，并通过基因工程的途径，显著提高了农林作物对非生物逆境的抵抗能力。但是，在植物抗逆基因工程中，目前大多使用组成型的强启动子。对于双子叶植物，一般使用花椰菜叶病毒CaMV 35S启动子或胭脂碱氨酸合成酶 Nos启动子；对于单子叶植物，最常用的是水稻肌动蛋白 Act1启动子、玉米泛素Ubi 启动子及 35S 启动子(夏江东, 程在全, 吴渝生, 季鹏章.2006.高等植物启动子功能和结构研究进展. 云南农业大学学报, 21(1): 7-14)。虽然这些启动子能使外源基因在植物中高效表达，转基因植物的抗逆性虽然得到了提高，但往往抑制了植物的生长发育。根据Kasuga等报道，组成型启动子CaMV 35S驱动DREB基因转化拟南芥，虽转基因植株提高了抗逆性，但植株生长受到抑制，表现为植株矮化、生长畸形、籽粒数减少(Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1999. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol, 17: 287–291)；而由诱导型启动子rd29A驱动DREB基因在拟南芥中表达，不仅提高了植株的抗逆性，而且也避免了对植株生长的负面影响(Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2004. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol, 45(3)：346-350)。因此，寻找特异的新诱导型启动子，来驱动外源基因定向、定位表达成为当前植物分子生物学的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的为了克服现有技术中特异的新诱导型启动子资源匮乏的缺陷，提供一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5。

本发明的另一个目的是提供一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5在启动目的基因表达中的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述启动子pG5受低温、干旱等逆境环境诱导。

一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述启动子pG5的（SEQ ID NO:1）序列。所述出发载体可以是本技术领域中经常用到的所有类型的表达载体，优选地，本发明所用到的出发载体为pBI121载体，得到的重组载体为pBI121：pG5。

一种包含如上所述重组载体（优选为重组载体pBI121：pG5）的重组菌。

一种包含如上所述重组载体（优选为重组载体pBI121：pG5）的细胞系。

用于扩增启动子pG5（序列如SEQ ID NO:1）的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

如上所述启动子pG5在启动目的基因表达中的应用；所述目的基因的表达受低温、干旱诱导。优选地，所述目的基因为GUS基因。

一种培育转基因植物的方法，具体步骤为：将含有如上所述启动子pG5的重组载体导入所述出发植物，从而得到利用启动子pG5启动目的基因表达的转基因植物；所述目的基因的表达受低温、干旱诱导。

所述出发植物为烟草；所述低温为4 ℃，24 h；干旱为25% PEG 6000，24 h。

所述目的基因为GUS基因。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述启动子pG5的调控元件包含有涉及低温胁迫应答、干旱胁迫应答、光应答、激素应答等等元件，可受低温、干旱等多种逆境诱导；启动子序列区域内未含有常见的酶切位点如XbaI、SacI、EcoRI、HindIII等，无需使用其他价格较昂贵的限制性内切酶，便于表达载体的构建，节约经费；该启动子可被低温、干旱等逆境所诱导表达，可广泛用于植物源的诱导型表达载体，也可用于单启动子驱动多基因的诱导表达，综合提高受体植物的抗多种逆境能力；同时还可作为高大乔木基因工程内的诱导型启动子资源匮乏的一个补充。

2、本发明所述的多逆境诱导型启动子pG5是从桉树上获得的第一个G6PDH基因启动子。该启动子在国际上是首次报道。而且，该启动子可被低温、干旱等逆境所诱导表达，能用于植物源的诱导型表达载体，在生物工程领域中具有广泛的适用性和很好的应用前景。

说明书附图

图1. 启动子pG5的核苷酸序列编号示意图。

图2. 启动子pG5的调控元件示意图。

图3. 转基因烟草叶片染色结果；A：转pBI 121烟草叶片；B：转pG5-GUS烟草叶片。

图4. 转基因烟草叶片在不同温度、干旱处理下GUS基因的表达量柱形图；A：转基因烟草叶片在不同温度处理下GUS基因的表达量；B：转基因烟草叶片在干旱处理下GUS基因的表达量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。

巨桉(品种EG6)：从国家林业局桉树研究开发中心获得。

烟草(品种NC89)：华南农业大学，林业生物技术实验室组培苗。

pBI 121载体：来源于华南农业大学；参考文献：余云舟, 金宁一, 王罡, 季静, 王萍, 李昌. 2004. HIV-1 gag基因和gp120基因转化番茄及转基因植株再生.中国生物工程杂志, 2: 37-40。

农杆菌 LBA 4404：来源于华南农业大学；参考文献：闫双勇, 智庆文, 刘欣洁, 张红伟, 谭振波, 李仕贵. 2004. 水稻T-DNA插入突变体库的构建及突变类型的分析. 遗传学报，31(12): 1388-1394。

实施例1

启动子的发现

提取巨桉(品种EG6)的基因组DNA，桉树基因组DNA的提取参照本领域常规方法。设计特异性引物（P1：5’-TCATTCTAGAGCGTAATTGCTGTC GCACCC-3’，如SEQ ID NO：2，下划线为Xba I酶切位点）和（P2：5’-GCTCAAGCTTCGAGAAGGAATCGCTTCTGA-3’，如SEQ ID NO：3，下划线为Sac I酶切位点）对基因组DNA进行扩增，将片段回收、克隆后进行DNA测序，获得一个720bp的DNA片段，720bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对扩增的SEQ ID NO：1所示的序列进行调控区的分析，鉴定出基因的起始密码子ATG，去除结构基因的部分。获得基因的5’端的调控序列，启动子的调控元件如图2所示，TATA盒位于−150 ～ −155区，与低温胁迫相关的LTR元件位于−384 ～ −389区，与干旱胁迫相关的MBS元件位于−61～ −66区，与光应答相关的MNF1元件位于−33 ～ −50、−425 ～ −442区，Sp1元件位于−345 ～ −354区。另外有大量的激素调控元件分布于启动子区段，如与GA(赤霉素)相关的GARE元件位于−124 ～ −130区、P-Box元件位于−462 ～ −467区，与ABA(脱落酸)相关的MYB 元件位于−334 ～ −339区，与MeJA(茉莉酸)相关的TGACG元件位于−307 ～ −401、 − 605～ −609区。SEQ ID NO：1所示的序列就是启动子的序列。启动子命名为pG5。因为起始密码子ATG的编号从1开始，所以启动子的序列编号从−660～ ＋60（如图1所示）。将启动子pG5与pGEM-T easy载体连接得到的重组质粒命名为pGEM-T：pG5。

实施例2

一、启动子pG5的低温、干旱诱导活性验证

重组表达载体的构建

1、用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切实施例1制备的pGEM-T：pG5，回收酶切产物(pG5)。

2、用限制性内切酶Xba I和Sac I酶切双元载体pBI 121，获得去除CaMV 35S启动子的pBI 121载体骨架。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒，进行测序验证，测序结果表明，得到了目的质粒pG5-GUS(用SEQ ID NO：1所示序列的pG5取代pBI 121的Xba I和Sac I酶切识别位点间的小片段)。

二、瞬时表达转化烟草

将含有pG5-GUS和pBI 121-GUS表达载体的农杆菌分别用YEB液体培养基摇菌，28 ℃、200 rpm，过夜培养至OD₆₀₀=1.0。4 ℃、 5000 rpm 离心10 min，收集农杆菌，重新悬浮于10 mM MES缓冲液(pH 5.6, 10mM MgSO4, 100 µM 乙酰丁香酮)。室温静置3小时后，轻摇混匀，用2mL 注射器将菌液沿烟草叶片远轴面主叶脉侧端注射入叶片中。48小时后，收集处理的叶片，进行GUS染色实验。

三、启动子的功能验证：启动子的活性检测通过GUS活性测定实验进行，实验方法如下：将步骤二得到的烟草叶片（转pG5-GUS烟草叶片或转pBI 121 烟草叶片）切割后放入一个eppedorf离心管中，加入X-Gluc染色液，25 ℃培养箱暗处过夜。第二天观察叶片的染色。染色结果见图3。图3A显示，转pBI 121烟草叶片呈现大片的蓝色，表明GUS基因已经大量表达。图3B显示，转pG5-GUS烟草叶片也呈现蓝色，表明GUS基因也已经表达。结果说明，pG5和CaMV 35S 启动子一样具有启动基因转录的活性。

四、启动子的低温、干旱诱导活性验证

根据GUS基因的序列，设计特异性GP1和GP2，利用Actin基因作为内标基因。

GUSP1：5’-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’，SEQ ID NO：4；

GUSP2: 5’-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3’，SEQ ID NO：5。

ActinP1：5′-CTGCTGGAATTCACGAAACA-3′，SEQ ID NO：6；

ActinP2：5′-GCCACCACCTTGATCTTCAT-3′，SEQ ID NO：7。

将步骤二得到的烟草叶片(转pG5-GUS烟草叶片或转pBI 121 烟草叶片)各分为两组，低温诱导组为常温(25 ℃)和低温(4 ℃)下处理2小时；干旱诱导组为清水(25 ℃)和25% PEG6000(25 ℃)处理2小时。分别提取总RNA，并逆转录生成cDNA。利用上述引物对不同胁迫处理下的cDNA样品进行Real-time PCR检测(Roche Lightcycler 480II)。以转pBI 121 烟草叶片在室温下或清水处理2小时的GUS基因表达量为1，将两组烟草叶片在不同温度、干旱处理下GUS基因的表达量绘制柱形图，见图4。图4A显示：低温处理组，在常温下的转pG5-GUS烟草叶片，GUS基因的表达量很少(相对表达量为0.336)，而低温下的转化烟草叶片有大量的GUS基因转录产物(相对表达量为0.950)，差异量达到近3倍，差异显著(P<0.05)；在常温下的转pBI 121烟草叶片，GUS基因的表达量为1，而低温处理后的转化烟草，GUS基因的相对表达量为1.06，差异量不显著。图4B显示：干旱处理组，在清水处理下的转pG5-GUS烟草叶片，GUS基因的表达量很少(相对表达量为0.316)，而干旱处理下的转化烟草叶片有大量的GUS基因转录产物(相对表达量为0.850)，差异达到显著(P<0.05)；在清水处理下的转pBI 121烟草叶片，GUS基因的表达量为1，而干旱处理后的转化烟草，GUS基因的相对表达量为1.02，两者差异量不显著。上述结果表明，启动子pG5具有低温、干旱诱导特性。实施例2的实验重复进行三次，都得到了同样的结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种来源于巨桉的多逆境诱导型启动子pG5及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 启动子pG5

<400> 1

gcgtaattgc tgtcgcaccc gtgacgtttg tttatattcc gacccctttt tttggcgctg 60

ttgattatta taagctgatc ccgcgactct ttcaaccctc atcgattccg tccctctccc 120

actgtttctc tctcttcaac gcgtcggcgt ccgggcattg cggagcctct aacttccgga 180

tccggctgct gcccttttgc tatttgggtc ctgcgcgtgc ccttcggttg ttggttttct 240

caggcgggct catctcaggt gacgggttcg ttttcgggga gcaattcttg ttattgttcg 300

ttctctgggt gggtggtagt ttgaccgtga gagtgaggga agcgaataga gcgcggtgtg 360

cggtgacatg cttgtcatgc tgcgtttgtt ggtttaggat cgcgagcgaa tgctgtggtt 420

tttatatgtg atggtgtctc cgtagccagg cggtgtgcat agcagatcct cgtccctagt 480

tcttttcttt catttttcgt tttggagtga ttgtgcggag catctttacc tctgttgtgg 540

ccgaatgatg atcaagttcg ttcattttgc tctaatcaac ccgtgtcttg cttctaactg 600

cagatcaaag aggtgccctg tttgtgaagc agcatctttg tcttcaaaac tctttagaag 660

atgggatcgg gtcagtggtc tgttgagaaa agatccagtc tcagaagcga ttccttctcg 720

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 特异性引物P1

<400> 2

tcattctaga gcgtaattgc tgtcgcaccc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 特异性引物P2

<400> 3

gctcaagctt cgagaaggaa tcgcttctga 30

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> GUSP1

<400> 4

ctgcgacgct cacaccgata cc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> GUSP2

<400> 5

tcaccgaagt tcatgccagt ccag 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ActinP1

<400> 6

ctgctggaat tcacgaaaca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> ActinP2

<400> 7

gccaccacct tgatcttcat 20

Claims (9)

1.一种来源于巨桉的低温或干旱诱导型启动子pG5，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述启动子pG5是通过特异性引物对巨桉基因组DNA进行扩增得到，所述特异性引物序列为5’-GCGTAATTGCTGTCGCACCC-3’和5’-CGAGAAGGAATCGCTTCTGA-3’。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在出发载体pBI121的XbaI和SacI酶切识别位点间插入权利要求1所述启动子序列。

3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述重组载体命名为pBI121：pG5。

4.一种包含权利要求2或3所述重组载体的重组菌。

5.一种包含权利要求2或3所述重组载体的细胞系。

6.权利要求1所述启动子pG5在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因的表达受低温、干旱诱导。

7.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，将含有权利要求1所述启动子的重组载体导入所述出发植物，从而得到利用权利要求1所述启动子启动目的基因表达的转基因植物，所述目的基因的表达受低温、干旱诱导。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述出发植物为烟草；所述低温为4 ℃，24 h；干旱为25% PEG 6000，24 h。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。